Abstract
バイオフィルムは、複雑な構造を持ち、重要な空間的不均一性を生成する表面結合微生物群集である。バイオフィルムの開発が強く、周囲の流れおよび栄養環境によって調節される。バイオフィルムの成長はまた、複雑な流れ場と溶質輸送パターンを生成することによって、局所微小環境の不均一性を増大させる。バイオフィルムとそのローカルマイクロ生息地間のバイオフィルムとの相互作用における異質の開発を調査するために、我々は緑膿菌とP.のデュアル種のバイオフィルムのモノ種のバイオフィルムを成長したマイクロ流体フローセル中の栄養勾配下緑膿菌、大腸菌 。我々は、フローセル内の栄養勾配を作成するために成長し、これらの条件下で、バイオフィルム発生を可視化するための詳細なプロトコルを提供する。また私たちは現在、バイオフィルム構造で空間パターンを定量化するための光学的方法の一連のためのプロトコル、フローdistriバイオフィルム上butions、および大量輸送の周りや生物膜コロニー内。これらのメソッドは、バイオフィルムと生息地の異質の共同開発の総合的な調査をサポートしています。
Introduction
細胞外ポリマーマトリックス1で囲まれた細胞凝集物-微生物は、表面およびフォームバイオフィルムに付着する。バイオフィルムは、内部溶質移動の制限と細胞代謝2,3における空間的変化の組み合わせから得られる劇的な空間的不均一性を持っているので、バイオフィルムは、非常に異なる個別の微生物細胞から振る舞う。酸素と栄養素濃度が大幅にバイオフィルムと流体と、さらにバイオフィルム2における内枯渇取得周囲の間の界面に減少する。バイオフィルム呼吸およびタンパク質合成の空間変動もローカライズ酸素および栄養素利用2に対する応答として生じ得る。
水生および土壌環境では、ほとんどの細菌はバイオフィルムに住む。ナチュラルバイオフィルムは、炭素と窒素を循環し、金属4,5の削減などの重要な生物地球化学的処理を行う。臨床的には、バイオフィルム形成はRESPONSです長期の肺と尿感染症の6のためible。バイオフィルム中の細胞はそれらのプランクトン様の対応物6と比較して、抗菌剤に対して極めて高い耐性を有するので、バイオフィルム関連感染症は非常に問題である。バイオフィルムは、多様な設定において重要であるため、研究のかなりの量は、バイオフィルム活性とバイオフィルム中の空間的不均一性と、周囲の微小環境を制御する環境要因を理解することに焦点を当ててきた。
以前の研究では、バイオフィルムの開発が強く環境要因の数によって調節されることを見出した：バイオフィルムは、種々の流動条件下で、異なる形態を開発する。酸素と栄養素の可用性に影響を与えるバイオフィルム形態。と流体力学的せん断応力が表面に浮遊性細胞の付着とバイオフィルム7-9からの細胞の脱離に影響を与えます。また、外部フロー条件は、基板のintの配信に影響を与えるO及びバイオフィルム10内。バイオフィルムの成長はまた、物理的および化学的条件を囲む変える。例えば、バイオフィルムの成長は、酸素と栄養2のローカル枯渇をもたらす。バイオフィルムは、周囲の環境11からの無機および有機化合物を蓄積。とバイオクラスターは流れをそらすと表面摩擦12,13を増やす。バイオフィルムは、非常に複雑な方法でその周囲の環境と相互作用するので、同時にバイオフィルムの特性および環境条件についての情報を得ることが重要であり、学際的なアプローチが包括的にバイオフィルム環境の相互作用を特徴付けるために使用される必要がある。
ここでは、課せられた栄養勾配の下でのモノ種とデュアル種のバイオフィルム内の微生物の増殖に空間パターンを特徴づけるために統合された一連の方法を提示し、局所的な化学的および流体微小環境の結果の変更を観察する。我々モミstは明確な化学勾配下バイオフィルムの成長を観察するための最近開発されたダブルインレットマイクロ流体フローセルの使用を記載している。次に、栄養条件の範囲の下でバイオフィルム中の細菌は、 緑膿菌、大腸菌 、2種の成長を観察するために、このマイクロ流体フローセルの使用を示す。我々は、バイオフィルムコロニーへの蛍光トレーサーの伝播のインサイチュ可視化定量的バイオフィルムにおける溶質輸送のパターンを評価するために使用できる方法を示す。最後に、共焦点顕微鏡下で行う、どのマイクロ粒子追跡速度測定を示し、成長したバイオフィルムの周りに局所的な流れ場を得るために使用することができる。
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Protocol
1.フローセルセットアップおよび接種
注：Song らに記載されてダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用し、2014年14バイオフィルムを成長させる。。このフローセルは、明確に定義された滑らかな化学的勾配を作成することができる。フローセルの設計は、 図1に示されており、電池の製造は、以前Song らに記載されて流れている。、2014 14。P.を使用してここで詳細に我々の方法を緑膿菌とE.大腸菌は、バイオフィルムを形成するが、他の種にも適切であり得る。我々はPを使用構成的バイオフィルム発生のためのモデル生物として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する緑膿菌 PAO1- のgfp。さらに、当社は、Eを使用大腸菌DH5αP.と混合種のバイオフィルムを形成するために緑膿菌。P.緑膿菌とE.大腸菌株はLB寒天プレート上で増殖させた。
- a側にポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、結合したフローセルを準備14に記載されているように、酸素プラズマ処理を介してカバーガラス。フローセルチャンバーの寸法は、0.24ミリメートル（奥行き×幅×長さ）×13ミリメートル×23ミリメートルである。
- 修正されたFAB成長培地15を準備します。 、フローセル内の栄養勾配の下でのバイオフィルムの成長を観察する一つの入口で0.6μMグルコースを培地に変更FAB 15を紹介し、他の入口から任意の炭素源なしFAB培地を導入する。フィルター滅菌し（孔径=0.2μm）でのグルコースストック溶液（60 mM）のFAB培地に添加する前に。使用前に、また、サイクル1（121℃、17 psiの液体、15分）を有するFAB培地をオートクレーブ。
- フローシステムを滅菌する。接種の前に、流路全体（培地ボトル、チューブ、バブルトラップ、フローセル）フローセルの上流に位置する（使い捨て滅菌済み）プラスチック三方弁を除いて、サイクル1を用いてオートクレーブ。 （スリーウェイバルブはセルcを注入するために使用されulture、蛍光トレーサー及びマイクロビーズ。）オートクレーブする前に、アルミ箔またはオートクレーブ袋ですべてのチューブおよびコネクタの開口部をカバーし、組み立て中に汚染を避けるために。
- フローシステムを接続します。注意深くフローセルシステムの構成要素を組み立てる（フローシステムアセンブリのためのビデオを参照）、正確に流量を制御する蠕動ポンプを介してフローセルに増殖培地を提供。
- P.のコロニーを転送することによって接種のための細胞培養を準備緑膿菌またはE. LBプレートからLBブロスの3ミリリットルに大腸菌および225rpmで、37℃で培養するO / Nを振ること。接種物として最終OD 600 = 0.01に水を滅菌1ミリリットル中にO / N細胞培養物を希釈する。 （培養および汚染を避けるために、層流フード中の細菌を希釈する。）
- 各細菌のための同等のOD 600 = 0.01と1ミリリットル中に1：混在種のバイオフィルムを用いた実験では、1の比に2細菌培養を希釈。
- フローセルを接種する。三方弁からフローセル入口に接種物1mlを注入する。注射後、細菌細胞をカバーガラスに付着させ、1時間の流れを一時停止。 （フローセルが懸濁された細胞は、カバースリップ上に沈降させるためにカバースリップ側を下に置かれていることを確認します。）
- 1時間後、フローを再開し、3日間、各入口0.03 ml /分の一定速度でフローセルに成長培地をポンピングする。
2.共焦点顕微鏡を用いて栄養グラデーションに応じて、バイオフィルムの開発の特徴付け
注：P.緑膿菌は、構成的に発現したGFPが、Eで画像化することができる混合種のバイオフィルム中の大腸菌は、対比によって画像化されなければならない。
- 共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムを観察します。代表的な結果を得るには、63Xの目的とした共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察する。イメージング、マークの前にカバーガラス側のグリッドダブルインレットフローセル。 （このグリッドの目的は、実験者がフローセルチャンバ内の撮像領域を見つけることを可能にすることである。）
- 、対比などSTYO 62などの緑色蛍光核酸染色などの細胞透過赤色蛍光核酸染色、10μlのを希釈、原液（1 mM）を990μlの滅菌水にしてから、ゆっくりとシリンジを用いて希釈染みを注入するために、上流側の三方弁からフローセルチャンバー。停滞フローセルを維持し、30分間、暗所で、その後15分間、結合していない汚れを洗い流すためにフローを再開。
- 共焦点イメージングを行います。励起のための488nmアルゴンレーザーとGFP（500から535ナノメートル）と（緑色蛍光核酸染色のため、650〜750 nm）の核酸染色のためのチャネルを収集放出をアクティブにします。明るく清潔なイメージを持っているように、両方のチャネルのためのゲインおよびオフセットを調整します。 XYZと同時撮像モードを選択します。 IDENするZ-コントロールノブを使用して、フィールド内のバイオフィルムの底部と頂部をtify。 3次元画像スタックを取得するための0.5μmからのz段階を設定する。 （画像取得のための4つのラインの平均を使用して、高画質を確保するために）。
- 三つにおける空間フローセル内のバイオフィルムの発達のパターン、画像、バイオフィルムをマッピングする複数の長手方向（x）のフローセル入口に沿って距離が、 図1に示すように、3つの横方向（y）に、課された栄養勾配に対する相対位置。
保守党蛍光トレーサーの注射によって3の特徴付け内部溶質輸送
注：そのようなCy5のような保守的な蛍光トレーサー、バイオフィルム内の溶質移動パターンを特徴付けるために使用することができる。
- ストック溶液としてミリリットルの10mg /の最終濃度まで水でのCy5（モノ反応性NHSエステル）に溶解する。 -20℃の冷凍庫でCy5の原液を保管してください。
注：Cy5標識が光sensitであるためIVEは、ストアは、希釈し、暗所にCy5のソリューションを注入する。 - 蛍光トレーサーの注射の前に、（63X対物レンズを使用）共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムの3次元画像スタックを取る。 （バイオフィルムコロニーの広い領域は、色素の輸送での時系列の観測に最適です。）（ 図5（a）に示すように）また、イメージングのための十分に分離したコロニーを有するz平面を選択します。
- 各Cy5の注入実験のために、20μg/ mlのCy5標識の濃度を有する注射溶液を得、滅菌水998μlの中のCy5ストック溶液2μlを希釈する。
- 流れを一時停止し、3方弁を介して注射器を用いて、フローセルの上流にCy5の溶液を注入するポンプを停止する。 （これは、注入しながら流路に入るの気泡を防止することが重要である。バブルトラップが戻って注入中に開いたままにすべきである。）
- Cy5の溶液を注入した後、バブルトラップを閉じる三方弁を調整し、再起動するフローセルに注入Cy5のソリューションを提供するポンプ。
- XYTする共焦点撮像モードを切り替えます。同時撮像モードの下でのCy5とGFPのチャンネルをアクティブにします。定量化のために重要である、信号の飽和を避けるために、（レーザー強度、ゲイン、オフセット）Cy5の強度に共焦点設定を調整します。 （高時間分解能は、染料浸透を可視化することが好ましい。ただし、高速走査は、画像品質を低下させる。）、撮像の時間分解能および画質のバランスをとるために、適切な走査速度とライン平均値を選択する。このプロトコルの4のライン平均0.15 60Hzのフレームレートを使用。
- （静止0.03ミリリットル/分の流速で）フローセルにCy5標識を提供するためのフローを再開。同時に時系列共焦点イメージングを開始する。
- 放射状に2-Dの円形のバイオフィルムコロニー内のCy5強度を平均化することによりCy5の浸透を定量化する。最初のバイオクラスターのエッジを識別する、平均化するために、クラスタの2-D区間の距離マップを生成する、最後にCy5の強度の平均半径方向のパターンが浸透曲線（ 図6参照）を生成する。
- 計算上3.8ステップ実現するために、Biospa社（バイオフィルム空間パターン解析）ソフトウェアパッケージ（リクエストに応じて利用可能未発表、ソフトウェアパッケージとマニュアル）、または他の画像解析プログラムを使用しています。
- Biospa社を使用するには、まずBiospa社に設定した画像をインポートします。その後、バイナリイメージを作るために、GFPおよびCy5チャンネルのための適切なしきい値を選択します。分析/計算メニューで、高度な分析と、その後拡散分析を選択します。クラスタのエッジを定義し、関心領域（ROI）のような1つのクラスタを選択するために、多角形ツールを使用してGFPチャネルを使用。
- 二重拡散分析を実行するために選択されたバイオフィルムのクラスタをクリックします。拡散分析結果を保存し、検量線を用いてCy5の濃度にCy5の強度を較正する。
- のCy5 conceにわたってCy5の強度を測定し、Cy5の濃度の較正曲線を生成する共焦点顕微鏡下ntration勾配。 （Cy5の強度と濃度は線形の関係を有する。）
4.追跡蛍光粒子によって周囲の流れ場の特徴付け
注：蛍光ビーズのような蛍光粒子は、バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるために使用することができる。バイオフィルムの周りの流れ場は、粒子追跡速度測定ソフトウェアを使用して、パーティクルの位置の時系列観測値から算出することができる。ここに示す結果はストリーム2.02ソフトウェアパッケージ16（ソフトウェアのダウンロードとで利用できるユーザーガイドを用いて得られたhttp://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ）。
- 0.2％の最終固形分濃度が0.5 mlの最終容積に滅菌水で蛍光マイクロビーズ（直径約1ミクロン）で希釈する。渦は、マイクロビーズがいることを確認するよく分散されている。
- ステップ3.3から3.5から手順以下のフローセルに希釈された蛍光マイクロビーズを注入してお届けします。粒子経路の正確なトラッキングを可能にするために、比較的低流量（0.01ミリリットル/本論文では、粒子追跡結果のための時間）を使用します。
- 1のzスライスにおける粒子の動きを追跡し、時系列画像を撮影するモードをXYT共焦点設定を切り替える。 （1ヘルツのフレームレートは、この論文に示されている代表的な結果を得るために使用した。）を繰り返して、粒子噴射し、画像を別のzの位置における3次元流れ場を生成する。
- 前工程の時系列（上利用可能なソフトウェアのダウンロードとマニュアルのImageJを使用してバックグラウンドの蛍光シグナル（画像セットの最初の取得画像内の信号）を減算することによって共焦点画像http://imagej.nih.gov/ij/を ）または他のプログラム。
- ImageJのでは、画像セットの最初の画像を開き、画像セットをインポートします。プロセスの下で/画像のCalculator、画像セットから最初の画像を差し引く。前処理された画像セットを保存します。
- ストリーム2.02においてフローベクトル、インポート時系列の共焦点画像を算出する。 「オープン·プロセスビュー」の下で、「粒子の識別」を選択し、実行します。粒子を識別するために、適切なしきい値を使用してください。 1ミクロンの粒子の最小値と最大直径のしきい値として0.5と5μmのを使用してください。
- その後、「オープンプロセスビュー」の下に、粒子のパスを生成するために、「PTV解析パイプライン」を選択して実行。彼らは、粒子の動きを表現するかどうかを確認するために、粒子のパスを確認してください。最後に、選択して、フローベクトルマップを生成する「速度場の作成」を実行します。
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Representative Results
ダブルインレットマイクロ流体フローセルは、フローチャンバー内の2つの溶液を混合することにより形成された、明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルムの成長の観察を可能にする。得られた化学勾配が以前の染料注入により観察し、Song ら 14により詳細に特徴付けた。 図1に示すように、滑らかな濃度勾配は、横方向に形成された。濃度プロファイルは、入口付近急であり、拡散による（ 図1）の下流に緩和た。栄養勾配下でのバイオフィルムの発達を観察するために、我々は、唯一の炭素源として1つの入口に添加グルコースで定義された最少増殖培地（FAB培地）を用いた。他のすべての栄養素が均一に分布しながら、フローセルチャンバー中のグルコース濃度勾配を得た。 P.の成長緑膿菌 PAO1バイオフィルムが強くグルコースのローカル配信（ 図2）に相関していた。横グルコース濃度勾配は、入口の近くに急であったように、バイオフィルムのバイオマスは、低グルコース領域に高いグルコース領域からの劇的な減少を示した。下流緩和横断グルコース勾配としては、バイオフィルムのバイオマスは、より均一になった。我々はさらに、Pの相互作用を研究するために、このフローセルの使用を実証した緑膿菌とE.グルコース勾配下のバイオフィルム中の大腸菌 （ 図3）。結果は、これら2種は栄養勾配に成長相対的で明確な空間パターンを示したため、明確な生態学的地位を占めていたことを示した：P.緑膿菌は、高グルコース濃度とE.と地域でバイオフィルムのバイオマスを支配大腸菌は、低グルコース濃度（ 図3）と地域で支配した。
バイオフィルムの成長と周囲の流れ環境との間のフィードバックを理解するためには、成長しているバイオ周りの流れ場を特徴とする共焦点顕微鏡下での蛍光粒子追跡速度測定による映画。注入された蛍光マイクロビーズの観察された移動は、ローカルフローベクトル情報がストリームソフトウェアパッケージを使用して粒子速度の少なくとも4,200の別個の測定値の平均から抽出された映画の1に示されている。流れ場の三次元マッピングは、複数の垂直位置（ 図4）で粒子を追跡することによって得た。バイオフィルムの成長が大幅に増加の流れの不均一性（ 図4）。バイオフィルムベースの近くにフローが増加異質につながる、バイオクラスターの周りに迂回さと速度（ 図4）減少した。バイオフィルムの上部の流れは、より高い速度を有した（ 図4）より均一である。
バイオフィルム内の限られた溶質の輸送に起因する内部の不均一性を理解するために、共焦点顕微鏡により、バイオフィルム内のCy5の輸送を観察した。時系列浸透Cy5でのバイオフィルムのクラスタに時系列Cy5の浸透曲線はバイオフィルム中のCy5の有効拡散係数は、Cy5の濃度プロファイルに1次元拡散モデルをフィッティングすることによって計算されたムービー3に示すムービー2に示されている。
Cは、蛍光強度から算出した半径方向に平均Cy5の濃度であり、バイオフィルム17への距離である。 Cy5のバルクフローで最高濃度を示し、バイオフィルム（ 図5）に入ると急激に減少した。
図1.ダブルインレットマイクロ流体フローセル。滑らかなグルコース勾配は炭素源（グルコ2つの入口にFAB培地を導入することにより、フローチャンバ内に作成されたそれは）一つの入口にのみ提供。フローセル内のグルコースの得られたパターンは陰影で示されている。暗い陰影は、より高いグルコース濃度を表す。共焦点イメージングは、フローセル内の9カ所で実施した。 図2及び図3に示す結果は、場所を参照図に1-9の番号が付け。この数字は、ソングらの後に変更される。（2014）、図。 1。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
グルコース勾配下の図2. PAO1のバイオフィルムの成長。3日間のPAO1バイオフィルムは、 図1に示す9箇所で画像化した。画像9用の画像1-8と24ミクロンのためのグリッド間隔=18μmで。G "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. Pの開発緑膿菌とE.グルコース勾配の下で大腸菌デュアル種のバイオフィルム。P. 緑膿菌は、構成的に、GFPを発現し、バイオフィルムはまた、一般的な核酸染色でSYTO 62、により対比染色した。ここに示されている画像は、GFP（緑色）およびSYTO 62（赤）チャンネルのオーバーレイである。P.緑膿菌は、したがって（赤+緑）緑や黄色に表示され、E。大腸菌は赤く表示されます。スケールバー=47μmで は。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4流速ベクトル場zにおける= 4、10及びバイオフィルムクラスタ約16以下である。矢印の長さは、速度の大きさを表す。低流速は、バイオベース（のz = 4、青い矢印）で示す。フローは、バイオフィルムの上部付近より均質である（Z = 16、赤矢印）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
バイオフィルムに図5. Cy5の浸透。T = 190秒でバイオフィルムのクラスタにCy5のの部分的な浸透を示すZ = 18ミクロンで、（A）共焦点顕微鏡写真。 1バイオクラスタ内のスケールバー=10μmである。（B）のCy5濃度マップのパターンが得られた。（C）のCy5濃度プロファイル。 602fig5large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Cy5の浸透プロファイルを生成するために、図6の手順左：2-Dバイオクラスターを含む選択されたROI。ミドル：バイオクラスターの距離マップ。右：半径方向平均Cy5の強度プロファイル。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
映画1 ：バイオクラスターの周りに注入された蛍光粒子の運動（共焦点ビデオ）。
映画2 ：バイオクラスターへのCy5の伝播（共焦点ビデオ）。
_content "> ムービー3 ：バイオクラスターへのCy5の伝播（濃度プロファイルビデオ）。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
バイオフィルムの化学勾配に応じて、周囲の流れの微小環境上のバイオフィルムの成長、および内部輸送の制限に起因するバイオフィルムの不均一性の影響：私たちは三つの重要なバイオフィルムと環境の相互作用を特徴づけるための方法のスイートを実証した。
まず、バイオフィルム発生のために明確に定義された化学勾配を課すことは、新規なマイクロ流体フローセルの使用を示した。フローセル内で明確に定義された化学勾配を生成するために、両方の入口に同じ流量を維持することが重要である。蠕動ポンプはよく同じ速度で成長媒体を提供するために両方の流路のために調整されていることを確認してください。また、バイオフィルムの成長の間の流路内に目詰まりがないことを確認してください。化学勾配が大幅にバイオフィルム内のバイオフィルムの成長と種間の相互作用に影響を与えたのは、このフローセルショーでデュアル種のバイオフィルムの成長の観察。化学勾配に一般的である輸送の制限、化学結合および反応、および微生物の取り込みおよび代謝18-20の組み合わせによるバイオフィルムが成長する環境。このマイクロ流体フローセルは、単一のデバイス内の化学的条件の定義された範囲の下で多様なバイオフィルムの活動の調査を可能にします。例えば、このフローセルは、抗菌勾配14下バイオフィルムを殺すの研究に有用であることが実証されている。
次に、バイオクラスターの周囲の流れ場を観察する粒子追跡速度測定の使用を実証した。注入された蛍光粒子の正確な追跡を保証するために、流量を最適化する必要がある。通常、低流量、粒子の運動が視野の共焦点フィールドに入力することを可能にする。また、走査フレームレート、画質及び時間分解能のバランスをとるために最適化する必要がある。粒子が動きを捕捉するための速すぎて移動する場合は、下の線やフレーム平均またはincreを使用走査速度アーゼ。我々は、バイオフィルムのクラスタ上に3つの垂直位置で流れ場をマッピングし、バイオフィルムの成長は流れの不均一性を増加させることを見出した。バイオフィルムのまわりの流れ場を特徴づけることが鍵フローバイオフィルムの相互作用が検討されることを可能にする。例えば、これは、バイオフィルム上の流体抗力と剪断力を制御する機構、及び得られたバイオフィルムの障害と表面1,21からの細胞の剥離を評価するために用いることができる。これらのプロセスは、フローシステム（ 例えば 、生物付着）上のバイオフィルムの効果とバイオフィルムの形態8の規制の両方を理解する上で重要である。バイオフィルムの周りの流れの状態はまた、バイオプロセスの広い範囲のために重要である大量輸送を制御する。例えば、バイオフィルム表面でのローカル流体速度は移流22を介してバイオフィルムに栄養と基質の配信に影響を与えます。
最後に、分析するための蛍光トレーサーの注入の使用を示したバイオフィルム中の溶質の輸送パターン。私たちは、保守的なトレーサーとして、ここでのCy5を使用し、このフッ素は、多くの場合、バイオフィルム23に保守的に動作するように表示されます。したがって結果は、バイオフィルム中の非反応性、中立溶質の輸送パターンの代表である必要があります。結果は、バイオフィルムバルク流中の濃度のわずか〜50％の内部Cy5の濃度を得、バイオフィルムの表面付近のCy5濃度の急激な減少を示した。このような急峻な濃度プロファイルは、バイオフィルム2,24内の酸素、栄養素と抗菌剤の以前に報告された測定値と一致している。 Cy5の浸透曲線は、バイオクラスターに溶質拡散に関する情報を提供する。しかし、ここで提示する方法は、バイオフィルムの横（ のxy）平面における2次元溶質輸送を分析するために制限されている。新しい高速イメージング機能により、例えば、ディスク共焦点顕微鏡を紡糸、染料浸透はまた、WHIの、バイオフィルム内の3次元で可視化することができるCH垂直輸送過程での調査が可能になります。さらに、蛍光トレーサー粒子は、同時に外部流れ条件及び内部溶質移動の情報を取得するために一緒に注入することができる。このような情報は、バルク流およびバイオフィルムの中移流と拡散溶質移動を区別し、バイオフィルム内部の溶質の輸送に外部流れの効果を評価するのに有用である。
全体として、我々は、環境中の化学的手がかりのバイオ応答の研究のために明確に定義された化学的勾配を提供する新規なマイクロ流体フローセルを使用した詳細なプロトコルを提示する。優れたバイオフィルムとその周囲の生息場所に不均一性を特徴づけるために、我々は、バイオフィルムおよびバイオフィルム内の内部溶質輸送を取り囲む流れ場の両方のパターンを特徴付けるために、ここでの方法を提示する。それぞれの方法は、バイオフィルムの特性および/または環境条件に関する独特の情報を提供します。これらのメソッドので、統合され、情報の複数の側面を同時に得ることができる。結合された情報は、より複雑な問題にアプローチする研究者を可能にします。例えば、これらの方法を用いることにより、我々は正常に栄養素勾配下でバイオフィルム中のバイオフィルムの発達及び種間の相互作用を分析した。これらの方法は、より現実的な状況におけるバイオプロセスに調べることができる微生物群集における複雑さ及び化学的環境を高めるための実験能力を提供する。これらの方法の潜在的な用途は、バイオフィルムのライフサイクル、複数種のバイオフィルム、バイオフィルムの不均一性、バイオフィルム中の輸送過程、およびバイオフロー相互作用を含むバイオフィルム研究の多様な側面をカバーする。
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Acknowledgments
私たちは、Pを提供するためにワシントン大学（シアトル、ワシントン州）のMatt Parsekに感謝緑膿菌とE.ストリームソフトウェアへのアクセスを提供するためのカンタベリー大学（ニュージーランド）での大腸菌の菌株とロジャー·ノークス。この作品は、国立衛生研究所からの助成金のR01AI081983、アレルギーと国立感染症研究所によってサポートされていました。共焦点イメージングは、ノースウェスタン生物イメージング機能（BIF）で行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
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