Abstract
Biofilmer er overflate festet mikrobielle samfunn som har komplekse strukturer og produserer betydelige romlige heterogeniteter. Biofilm utvikling er sterkt regulert av den omgivende strømmen og næringsmiljø. Biofilmvekst øker også heterogenitet i den lokale mikromiljøet ved å generere komplekse strømningsfelt og oppløst stoff transportmønstre. For å undersøke utviklingen av heterogenitet i biofilmer og interaksjoner mellom biofilmer og deres lokale mikro-habitat, vokste vi mono-arter biofilm av Pseudomonas aeruginosa og dual-arter biofilm av P. aeruginosa og Escherichia coli i henhold til ernæringsmessige gradienter i et mikrofluidstrømningscellen. Vi gir detaljerte protokoller for å skape nærings gradienter innen strømningscellen og for dyrking og visualisere biofilm utvikling under disse forholdene. Vi presenterer også protokoller for en serie av optiske metoder for å kvantifisere romlige mønstre i biofilm struktur, flyte distributions løpet biofilm, og massetransport rundt og innenfor biofilm kolonier. Disse metodene støtter omfattende undersøkelser av co-utvikling av biofilm og habitat heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer feste til overflater og danner biofilm - cellleaggregater vedlagt i et ekstracellulært-polymer matrise 1. Biofilmer oppføre seg svært forskjellig fra individuelle mikrobielle celler, fordi biofilmer har dramatiske romlig heterogenitet som skyldes en kombinasjon av oppløst stoff interne transportbegrensninger og romlige variasjoner i cellulær metabolisme 2,3. Oksygen og næringsstoffer konsentrasjoner drastisk nedgang i grenseflaten mellom biofilm og omkringliggende væske og få ytterligere utarmet innenfor i biofilm to. Romlige variasjoner i biofilm respirasjon og proteinsyntese kan også oppstå som en respons på lokaliserte oksygen og næringsstoffer 2.
I akvatiske og jord miljøer, de fleste bakterier bor i biofilm. Naturlige biofilmer utføre viktige biogeokjemiske prosesser, inkludert sykling karbon og nitrogen og redusere metaller 4,5. Klinisk er biofilmdannelse responsusynlige for langvarig lunge og urinveisinfeksjoner 6. Biofilmassosierte infeksjoner er svært problematisk fordi cellene i biofilmer har ekstremt høy motstand mot antimikrobielle midler i forhold til sine planktoniske kolleger 6. Fordi biofilm er viktige i ulike innstillinger, har en betydelig mengde forskning vært fokusert på å forstå de miljømessige faktorene som styrer biofilm aktiviteter og romlig heterogenitet i biofilmer og det omkringliggende mikromiljøet.
Tidligere studier har funnet at biofilm utvikling er sterkt regulert av en rekke miljøfaktorer: biofilmer utvikle ulike morfologi under ulike strømningsforhold; oksygen og næringsstoffer innflytelse biofilm morfologi, og hydrodynamiske skjærspenning påvirker bindingen av planktoniske celler til overflater og løsgjøring av celler fra biofilmer 7-9. Videre påvirker flyten tilstand ekstern levering av underlag into og innen biofilm 10. Vekst av biofilm endrer også omkringliggende fysiske og kjemiske forhold. For eksempel fører biofilmveksten av lokal utarming av oksygen og næringsstoffer 2; biofilmer akkumulere uorganiske og organiske forbindelser fra omgivelsene 11; og biofilm klynger avlede strømmen og øker overflatefriksjonen 12,13. Fordi biofilmer samhandle med deres omkringliggende miljø i svært komplekse måter, er det viktig å samtidig få informasjon om biofilm egenskaper og miljømessige forhold, og flerfaglige tilnærminger må brukes til omfattende karakter biofilm-miljø interaksjoner.
Her presenterer vi en serie av integrerte metoder for å karakterisere romlige mønstre i mikrobiell vekst innen mono-arter og dual-arter biofilm under en pålagt ernæringsmessig gradient, og å observere den resulterende endring av lokal kjemisk og væske mikromiljøet. Vi first beskriver anvendelse av et nylig utviklet doble innløpsmikrofluidstrømningscellen for å observere biofilm vekst under veldefinerte kjemiske gradienter. Vi demonstrerer bruken av denne mikrofluidstrømningscellen for å observere vekst av to arter av bakterier, Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli, i biofilmer under en rekke næringsforhold. Vi viser hvordan in situ visualisering av fluoriserende spor forplantning inn i biofilm kolonier kan brukes til å kvantitativt vurdere mønstre av oppløst stoff transport i biofilmer. Endelig viser vi hvordan mikropartikkelsporings velocimetry, utført under konfokal mikroskopi, kan anvendes for å oppnå lokal strømningsfeltet rundt de voksende biofilmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flow Cell Setup og Inoculation
MERK:. Bruk en dobbel-innløp microfluidic flyt celle beskrevet i Song et al, 2014 14 for å vokse biofilm. Denne flyten celle er i stand til å skape veldefinerte glatte kjemiske gradienter. Strømningscellekonstruksjon er vist i figur 1 og strømningscellen fabrikasjon ble tidligere beskrevet i Song et al., 2014 14. Her detalj våre fremgangsmåter ved hjelp av P. aeruginosa og E. coli for å danne biofilmer, men andre arter kan også være egnet. Vi brukte P. aeruginosa PAO1- GFP, som konstitutivt uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP), som modellorganisme for biofilm-utviklingen. I tillegg brukte vi E. coli DH5a å danne mixed-arter biofilmer med P. aeruginosa. P. aeruginosa og E. coli-stammer ble dyrket på LB-agar-plater.
- Forberede flytcellen ved hjelp polydimethylsiloxane (PDMS) bundet til englass dekkglass via oxygen plasmabehandling slik det er beskrevet i 14. Dimensjonene av strømningscellekammeret er 23 mm x 13 mm x 0,24 mm (lengde x bredde x dybde).
- Forberede modifisert FAB vekst medium 15. For å observere biofilmvekst under et ernæringsmessig gradient i strømningscellen, innfører modifisert FAB medium 15 med 0,6 mM glukose i ett innløp og innføre FAB medium uten karbonkilde gjennom det andre innløp. Filter-sterilisere (pore size = 0,2 mikrometer) glukoseløsning (60 mM) før du legger den til FAB medium. Også autoklaveres FAB medium med syklus 1 (væske, 15 min, 121 ° C, 17 psi) før bruk.
- Sterilisere flow system. Før inokulering, autoklaveres hele strømningsbanen (mellom flasker, rør, boblefeller, strømnings celler) ved anvendelse av en syklus, med unntak av de plast treveisventiler (engangs- og pre-sterilisert) som befinner seg oppstrøms av strømningscellen. (Tre-veis ventil anvendes for å sprøyte inn celle cruk, fluorescerende tracer og mikroperler.) For å unngå forurensning ved montering, dekke alle rør og kontaktåpninger med aluminiumsfolie eller autoklav poser før autoklave.
- Koble strømningssystemet. Sette sammen komponentene i strømningscellesystem nøye (se video for strømningssystem sammenstilling) og levere vekstmedium til strømningscellen via en peristaltisk pumpe som nøyaktig styrer strømningshastigheten.
- Forbered cellekultur for vaksinasjon ved å overføre en koloni av P. aeruginosa eller E. coli fra LB-plater i 3 ml LB-medium og rist kulturen O / N ved 225 rpm og 37 ° C. Fortynn O / N-cellekulturer i 1 ml sterilt vann til en endelig OD 600 = 0,01 som inokulum. (Kultur og fortynne bakterier i en laminær hette for å unngå forurensning.)
- For forsøkene med blandede arter biofilmer, fortynne de to bakteriekulturer i et forhold på 1: 1 i 1 ml med en tilsvarende OD 600 = 0,01 for hver enkelt bakterie.
- Inokuler strømningscellen. Injisere 1 ml av inokulumet til strømningscellen innløpet fra tre-veis ventil. Etter injeksjonen stanse flyten i 1 time for å tillate bakterieceller å feste til frontglass. (Pass på at strømningscellen er plassert med dekksiden ned for å tillate suspendert celler til å bosette seg på dekkglass.)
- Etter 1 time, gjenoppta strømmen og pumpe vekstmediet til strømningscellen ved en konstant hastighet på 0,03 ml / min for hvert innløp i 3 dager.
2. karakteriserer Biofilm Development i Response til Nutrient overgangar Bruke Konfokalmikroskopi
MERK: P. aeruginosa kan avbildes med konstitutivt uttrykte-GFP, men E. coli i mixed-arter biofilm må avbildes ved kontra.
- Observere de tre-dagers biofilm ved hjelp konfokalmikroskopi. For de representative resultater, observere biofilm ved hjelp av et konfokal mikroskop med en 63X objektiv. Før bildebehandling, markdobbel-innløp flyt celle med et rutenett på coveret glass side. (Hensikten med dette gitter er å tillate experimenter å lokalisere de bildedannende områder inne i strømningscellen kammeret.)
- For å counterstain, fortynne 10 pl av celle-permeant rødt fluorescerende nukleinsyre flekken, slik som grønt fluorescerende nukleinsyre flekken som STYO 62, stamoppløsning (1 mM) i 990 ul sterilt vann og deretter langsomt injisere den fortynnede flekken ved hjelp av en sprøyte inn i strømningscellen kammeret fra oppstrøms treveisventil. Holde strømningscellen stillestående og i mørke i 30 min, og deretter gjenoppta strømmen for å vaske ut det ubundne flekken i 15 min.
- Utføre confocal bildebehandling. Aktivere 488 nm argonlaser for eksitasjon og emisjon oppsamlingskanaler for GFP (500-535 nm) og nukleinsyre flekk (for grønt fluorescerende nukleinsyre flekken, 650-750 nm). Juster gevinster og forskyvninger for begge kanaler å ha lyse og rene bilder. Velg xyz og samtidig avbildningsmodus. Bruk z-bryteren til Idensere bunnen og toppen av biofilm i felten. Sett z-trinnet til 0,5 pm for å oppnå et 3-D bilde stabelen. (For å sikre høy bildekvalitet, bruk en linje gjennomsnitt på fire for bildeopptak.)
- For å kartlegge de romlige mønstre av biofilm-utviklingen i strømningscellen, bilde biofilmer på tre eller flere langsgående (x) avstander langs strømningscelleinnløpet, og ved tre tverrgående (y) posisjon i forhold til den påtrykte ernæringsmessig gradient, som vist i Figur 1 .
3. karakteriserer Intern oppløst stoff Transport med Injeksjoner av Høyres Fluorescent Tracer
MERK: En konservativ fluoriserende sporstoff, slik som Cy5, kan brukes til å karakterisere oppløst stoff transportmønstre i biofilmen.
- Oppløs Cy5 (Mono-Reactive NHS ester) i vann til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml som en stamoppløsning. Oppbevar Cy5 stamløsning i en -20 ° C fryser.
MERK: Fordi Cy5 er lys-SensITive, butikk, fortynne og injisere Cy5 løsninger i mørket. - Forut for injeksjoner av det fluorescerende tracer, ta en 3-D bilde stabel av 3-dagers biofilm med konfokal mikroskopi (med et 63X objektiv). (Brede områder av biofilm kolonier er ideelle for tidsserie observasjoner av fargestoff transport.) Også velge en z-planet med godt separerte kolonier for avbildning (som vist på figur 5A).
- For hvert eksperiment Cy5 injeksjon, fortynn 2 ul av Cy5 stamløsning i 998 ul sterilt vann for å gi en injeksjonsoppløsning som har et Cy5-konsentrasjon på 20 ug / ml.
- Stoppe pumpen for å stanse strømningen og injisere oppløsning inn Cy5 oppstrøms av strømningscellen ved hjelp av en sprøyte via tre-veis ventil. (Det er viktig å hindre at luftbobler kommer inn i strømningsbanen mens injisering. Boble feller bør holdes åpen i ryggen injeksjon.)
- Etter å ha injisert Cy5 løsning, lukke boble feller, justere 3-veis ventil, og startpumpe for å levere den injiserte Cy5 oppløsningen i strømningscellen.
- Slå konfokal avbildningsmodus til xyt. Aktiver Cy5 og GFP kanaler under samtidig avbildningsmodus. Juster konfokale innstillinger på Cy5 intensitet (laser intensitet, få og offset) for å unngå å mette signaler, som er kritisk for kvantifisering. (High temporal oppløsning er å foretrekke for å visualisere fargestoff penetrasjon. Imidlertid synker rask skanning bildekvalitet.) Velg riktig skanning hastighet og linje gjennomsnitt å balansere tidsoppløsning på bildebehandling og bildekvaliteten. For denne protokollen bruker en linje gjennomsnitt på fire og en bildefrekvens på 0,15 Hz.
- Gjenoppta strømmen for å levere Cy5 inn i strømningscellen (fremdeles ved en strømningshastighet på 0,03 ml / min). Samtidig starter tidsserier confocal bildebehandling.
- Kvantifisere Cy5 penetrasjon av radielt snitt Cy5 intensitet innenfor en 2-D sirkulær biofilm koloni. Til gjennomsnitt, først identifisere kanten av en biofilm klynge, deretter generere en avstand kart for en 2-D-delen av klyngenOg endelig gjennomsnittlig radielle mønstre av Cy5 intensiteter for å generere en penetrasjon kurve (se figur 6).
- Til beregnings innser trinn 3.8, bruker BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) programvarepakke (upublisert, programvarepakke og manuell tilgjengelig på forespørsel) eller andre bildeanalyseprogrammer.
- For å bruke BioSPA, først importere et bilde satt inn BioSPA. Deretter velger du riktig terskel for GFP og Cy5 kanaler for å lage binære bilder. I analysen / beregningsmenyen, velg Avansert Analyse og deretter Diffusion Analysis. Bruk GFP kanal for å definere kanten av en klynge og bruke polygonverktøyet til å velge en klynge som regionen av interesse (ROI).
- Dobbeltklikk den valgte biofilm klynge å utføre diffusjon analyse. Lagre diffusjon analyseresultater og kalibrere Cy5 intensitet til Cy5 konsentrasjon ved hjelp av en kalibreringskurve.
- Å generere Cy5 konsentrasjon kalibreringskurve, måle Cy5 intensiteter over en Cy5 concentration graderingen under konfokalmikroskopi. (Cy5 intensitet og konsentrasjon har en lineær sammenheng.)
4. karakteriserer Rundt Flow Feltet av Tracking Fluorescent Partikler
MERK: Fluorescent partikler, for eksempel fluorescerende mikroperler, kan brukes til å karakterisere strømningsfeltet rundt biofilmer. Flow feltet rundt biofilmer kan beregnes fra tidsserie observasjoner av partikkel stillinger ved hjelp partikkel sporing velocimetry programvare. De som er vist her resultater ble oppnådd med Streams 2.02 programvarepakken 16 (nedlasting av programvare og brukerhåndbok tilgjengelig på http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Fortynn de fluorescerende mikroperler (diameter ~ 1 uM) i sterilisert vann til et endelig faststoff-konsentrasjon på 0,2% og et sluttvolum på 0,5 ml. Vortex for å sørge for at mikroer godt spredt.
- Injisere og levere utvannet fluorescerende mikroperler inn i flyten celle følgende prosedyrer fra trinn 3.3 til 3.5. Å tillate en nøyaktig sporing av partikkelbanen, bruker en relativt lav strømningshastighet (0,01 ml / time for partikkelsporingsresultatene i denne artikkelen).
- Bytt konfokale innstillinger til xyt modus for å spore partikkelbevegelse på en z-slice og ta tidsseriebilder. (Et bildefrekvens på 1 Hz ble brukt for de representative resultater som er vist i dette dokumentet.) Gjenta partikkelinnsprøytning og bilde på forskjellige steder for å generere z 3-D-strømningsfeltet.
- Pre-prosessen tidsserien konfokale bilder ved å trekke bakgrunnen fluorescens signal (signal i første kjøpt bildet av bildesettet) ved hjelp ImageJ (nedlasting av programvare og manuell tilgjengelig på http://imagej.nih.gov/ij/ ) eller andre programmer.
- I ImageJ, åpner det første bildet av et bildesett og deretter importere bildesettet. Under Process / Image Calculator, trekker det første bildet fra bildesettet. Lagre pre-behandlet bildesett.
- For å beregne strømnings vektorer, import tidsserier konfokale bilder i Streams 2,02. Under "Åpen prosess view", velge og gjennomføre "Identifiser partikler". Bruk riktig terskel for å identifisere partikler. Bruk 0,5 og 5 mikrometer som minimum og maksimum diameter terskler for en mikrometer partikler.
- Deretter under "Åpen prosess view", velge og gjennomføre "PTV analyse rørledning" for å generere partikkelbaner. Sjekk partikkelbanene for å se om de representerer partikkel bevegelse. Til slutt velger og utføre "Opprett hastighetsfelt" for å generere en flyt vektorkart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den doble innløpsmikrofluidstrømningscelle tillater observasjon av biofilmveksten under en veldefinert kjemisk gradient dannet ved blanding av to løsninger inne i strømningskammeret. Den resulterende kjemiske gradient ble tidligere observert av fargestoff-injeksjonen og karakterisert i detalj ved Song et al., 14. Glatte konsentrasjonsgradienter ble dannet i den tverrgående retning, som vist i figur 1. Konsentrasjonsprofilen var bratt nær innløpet og fikk avslappet nedstrøms på grunn av diffusjon (Figur 1). For å observere biofilm utvikling under en ernæringsmessig gradient brukte vi et definert minimalt vekstmedium (FAB medium) med glukose tilsettes kun til ett innløp som den eneste karbonkilde. Dette ga en glukose-gradient i strømningscellekammeret mens alle andre næringsstoffer ble homogent fordelt. Veksten av P. aeruginosa PAO1 biofilm var sterkt korrelert til lokal levering av glukose (figur 2).Som den tverrgående glukosekonsentrasjonen var bratt gradient i nærheten av innløpet, biofilmen biomasse viste en dramatisk reduksjon av høy-glucose-regionen til lav-glukose-regionen. Som den tverrgående glukose gradient avslappet nedstrøms, ble biofilmen biomasse mer homogen. Vi har videre demonstrert ved bruk av denne strømningscellen for å studere interaksjonene av P. aeruginosa og E. coli i biofilm under ett glukose gradient (figur 3). Resultatene viste at disse to arter viste forskjellige romlige mønstre i vekst i forhold til den ernæringsmessige gradient, og derfor okkupert distinkte økologiske nisjer: P. aeruginosa dominert biofilm biomasse i områder med høye glukosekonsentrasjoner og E. coli dominerte i regioner med lav glukosekonsentrasjoner (figur 3).
For å forstå den tilbake mellom biofilmvekst og den omgivende strømningsmiljø, karakterisert vi strømningsfeltet rundt voksende biofilmer av fluorescerende partikkel sporing velocimetry henhold konfokalmikroskopi. Den observerte bevegelsen av injisert fluorescerende mikro er vist i Movie 1. Lokal flyt vektor informasjonen ble hentet fra et gjennomsnitt på minst 4.200 diskrete målinger av partikkelhastigheter ved hjelp av Strømmer programvarepakken. Tredimensjonal kartlegging av strømningsfeltet ble oppnådd ved å spore partikler på flere vertikale posisjoner (figur 4). Biofilm vekst betydelig økt flyt heterogenitet (figur 4). Flow nær biofilm basen omdirigert rundt biofilm klynger, som fører til økt heterogenitet og redusert hastighet (figur 4). Flyt på biofilm toppen har høyere hastighet og er mer homogen (figur 4).
For å forstå den interne heterogenitet forårsaket av begrenset oppløst stoff transport innen biofilm, observerte vi transport av Cy5 innen biofilm ved konfokalmikroskopi. Time-serien penetrasjonav Cy5 inn i en biofilm klynge er vist i Movie 2. tidsserier Cy5 penetrasjon kurver er vist i Movie 3. Den effektive diffusjonskoeffisient Cy5 i biofilm ble beregnet ved å montere en 1-D spredningsmodell til Cy5 konsentrasjonsprofiler:
hvor C er radialt fordelt Cy5-konsentrasjonen beregnet fra fluorescens-intensitet, og er avstanden inn i biofilmen 17. Cy5 viste den høyeste konsentrasjon i bulkstrøm og redusert bratt etter inn i biofilmen (figur 5).
Figur 1. Dobbelt innløp microfluidic flyt celle. Glatte glukose gradienter ble skapt inne i strømningskammeret ved å innføre FAB medium til de to innløp med en karbonkilde (GLUCO SE) tilgjengelig bare i ett innløp. Resulterende mønstre av glukose i strømningscellen er indikert ved skravering. Mørk skyggelegging representerer høyere glukosekonsentrasjoner. Konfokalt avbildnings ble utført på ni steder i strømningscellen. Resultatene presentert i figurene 2 og 3 refererer til de steder nummerert 1-9 på figuren. Dette tallet er endret etter Song et al. (2014), Fig. En. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. PAO1 biofilm vekst under glukose gradienter. 3-dagers PAO1 biofilm ble fotografert på ni steder vist i figur 1. Grid avstand = 18 mikrometer for bilde 1-8 og 24 mikrometer for bilde 9.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utvikling av P. aeruginosa og E. coli dual-arter biofilmer i henhold til glukose gradienter. P. aeruginosa konstitutivt uttrykker GFP, og biofilm ble også motfarget med SYTO 62, som er en generell nukleinsyre flekken. Bildene som vises her er overlegg av GFP (grønt) og SYTO 62 (rød) kanaler. P. aeruginosa synes derfor grønn eller gul (grønn + rød), og E. coli vises rødt. Skala barer = 47 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Strømningshastighet vektorfelt ved z = 4, 10 og 16 um rundt en biofilm klynge. Lengden på pilen representerer størrelsen av hastigheten. Lav strømningshastighet viser at biofilm base (z = 4, blå piler). Flow er mer homogen nær biofilm toppen (z = 16, røde piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Cy5 inntrengning i biofilmer. (A) Confocal fotomikrografi ved z = 18 um viser delvis gjennomtrengning av Cy5 i biofilm klynger ved t = 190 sek. Skala barer = 10 mikrometer. (B) Resulterer mønstre av Cy5 konsentrasjon kartet. (C) Cy5 konsentrasjonsprofil i en biofilm klynge. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Prosedyrer for å generere en Cy5 penetrasjon profil Venstre:. Valgt ROI inneholder en 2-D biofilm klynge. Midten: Avstand kart over biofilm klynge. Høyre: Radialt-gjennomsnitt Cy5 intensitet profil. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Film 1 : Bevegelse av injisert fluorescerende partikler rundt biofilm klynger (konfokal video).
Movie 2 : Formering av Cy5 inn biofilm klynger (konfokal video).
_content "> Movie 3 : Formering av Cy5 inn biofilm klynger (konsentrasjon profiler video).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en pakke med metoder for å karakterisere tre viktige biofilm-miljø interaksjoner: biofilm respons på kjemiske gradienter, effekter av biofilm vekst på rundt flyt mikromiljøet, og biofilm heterogenitet som følge av interne transport begrensninger.
Vi først viste bruk av en roman mikrofluidstrømning celle å ilegge en veldefinert kjemisk gradient for biofilm utvikling. For å generere en veldefinert kjemisk gradient i strømningscellen, er det viktig å opprettholde den samme strømningshastighet for begge innløpene. Sørg for at den peristaltiske pumpen er godt tilpasset for begge strømningskanaler for å levere vokse medium i samme takt. Pass også på at det ikke er tilstopping i strømningsbanen i løpet av biofilm vekst. Observasjoner av veksten av dual-arter biofilmer i denne flyten celle viser at kjemiske gradienter sterkt påvirket biofilm vekst og inter-arter interaksjoner innenfor biofilm. Kjemiske gradienter er vanlig imiljøer der biofilmer vokse, på grunn av en kombinasjon av transportbegrensninger, kjemisk binding og reaksjoner, og mikrobiell opptak og metabolisme 18-20. Denne mikrofluidstrømningscellen gjør undersøkelser av ulike biofilm aktiviteter under et definert område av kjemiske forhold i en enkelt enhet. For eksempel har denne strømningscellen blitt demonstrert å være anvendelige for studium av biofilm dreping under en antimikrobiell gradient 14.
Vi demonstrerte bruken av partikkelsporings velocimetry å observere strømningsfeltet rundt biofilm klynger. For å sikre en nøyaktig sporing av de injiserte fluorescerende partikler, må strømningshastigheten som skal optimaliseres. Vanligvis gir lav strømningshastighet bevegelse av partiklene som skal fanges opp i konfokal synsfelt. Også skannebildefrekvens må optimaliseres for å balansere bildekvalitet og tidsoppløsning. Hvis partiklene beveger seg for fort for å fange bevegelsen, bruker lavere linje eller ramme gjennomsnittlig eller Increase skanning hastighet. Vi tilordnet strømningsfeltet ved tre vertikale posisjoner over en biofilm klynge, og fant at biofilmveksten økes strømningsheterogeniteten. Karakteriserer strømningsfeltet rundt biofilmer tillater viktige strømnings-biofilm interaksjoner å bli utforsket. For eksempel, kan dette brukes til å evaluere mekanismene som regulerer fluidmotstand og skjær over biofilmen, og den resulterende biofilm svikt og løsgjøring av celler fra overflaten 1,21. Disse prosessene er viktig for å forstå både effektene av biofilm på flow systemer (f.eks begroing) og regulering av biofilm morfologi 8. Strømningsforhold rundt biofilmer også styre massetransport, noe som er viktig for et bredt spekter av biofilmprosesser. For eksempel, den lokale fluidhastighet ved biofilmoverflate påvirker levering av næringsstoffer og substrater til biofilm gjennom adveksjon 22.
Til slutt, vi viste bruk av injisere fluorescerende sporstoff for å analysereoppløst stoff transportmønstre innenfor biofilm. Vi brukte Cy5 her som en konservativ tracer, og dette fluor ser ut til å ofte oppføre seg konservativt i biofilmer 23. Derfor resultatene skal være representative for transportmønstre ikke-reaktive, nøytrale solutes i biofilmer. Resultatene viste en sterk reduksjon av Cy5 konsentrasjon nær biofilmoverflate, noe som ga et Cy5-konsentrasjon i det indre av biofilm bare ~ 50% av konsentrasjonen i bulkstrømmen. Slike bratte konsentrasjonsprofiler er i samsvar med tidligere rapporterte målinger av oksygen, næringsstoffer og antimikrobielle midler innenfor biofilmer 2,24. Cy5 penetrasjon kurver gi informasjon om oppløst stoff diffusjon i biofilm klynger. Imidlertid er metoden vi presenterer her begrenset til å analysere 2D-oppløst stoff transport i horisontal (xy) plan i biofilmer. Med nyere rask bildebehandling evne, for eksempel spinne disk konfokalmikroskopi, fargestoff penetrasjon kan også bli visualisert i 3-D innen biofilm, WHIch vil tillate en undersøkelse på vertikale transportprosesser. Videre kan fluoriserende sporstoff og partiklene injiseres sammen for å innhente informasjon fra eksterne strømningsforhold og intern transport oppløst stoff på samme tid. Slik informasjon er nyttig å skille advective og diffusive oppløst stoff transport blant bulk flyt og biofilm og for å vurdere effekten av ekstern flyt på intern oppløst stoff transport i biofilmer.
Samlet presenterer vi detaljerte protokoller for å bruke en roman microfluidic flyt celle som gir veldefinerte kjemiske gradienter for studier av biofilm reaksjoner på kjemiske signaler i miljøet. Å bedre karakter heterogenitet i biofilmer og deres omkringliggende mikrohabitat, presenterer vi her metoder for å karakterisere mønstre i både strømningsfeltet rundt biofilmer og intern oppløst stoff transport innen biofilm. Hver metode gir deg tydelig informasjon om biofilm egenskaper og / eller miljøforhold. Siden disse metodeneer integrert, kan flere sider av informasjon fås samtidig. Kombinert informasjon gjør at forskere å nærme mer komplekse problemer. For eksempel ved hjelp av disse metodene, vi får analysert biofilm utvikling og arts interaksjoner i biofilmer under et næringsstoff gradient. Disse fremgangsmåter gir også eksperimentelt evne til å øke kompleksiteten i den mikrobielle samfunnet og den kjemiske miljøet, noe som tillater undersøkelser på biofilmprosesser på en mer realistisk sammenheng. Potensielle anvendelser av disse metodene dekker ulike aspekter av biofilm forskning, inkludert biofilm livssyklus, flerbestands biofilmer, biofilm heterogenitet, transportprosesser i biofilm, og biofilm-flow samspill.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Matt PARSEK ved University of Washington (Seattle, Washington) for å gi P. aeruginosa og E. coli-stammer og Roger Nokes ved Universitetet i Canterbury (New Zealand) for å gi tilgang til Streams programvare. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet R01AI081983 fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer. Konfokal bildebehandling ble utført ved Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
