Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس

doi: 10.3791/52602 Published: March 11, 2015

Abstract

الأغشية الحيوية هي المجتمعات الميكروبية المرفقة السطحية التي لديها هياكل معقدة وإنتاج التغاير المكانية كبيرة. وينظم تطوير بيوفيلم بقوة تدفق المحيطة والبيئة الغذائية. يزيد نمو بيوفيلم أيضا عدم تجانس المكروية المحلية عن طريق توليد حقول تدفق المعقدة وأنماط النقل المذاب. للتحقيق في وضع من عدم التجانس في الأغشية الحيوية والتفاعلات بين الأغشية الحيوية والخاصة المحلية الصغيرة الموائل، ونحن نمت الأغشية الحيوية أحادية أنواع الزائفة الزنجارية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع من P. الزنجارية والقولونية تحت التدرجات الغذائية في خلية تدفق الموائع الدقيقة. ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لإنشاء التدرجات المواد الغذائية داخل الخلية وتدفق لزراعة وتصور تنمية بيوفيلم في ظل هذه الظروف. نحن أيضا بروتوكولات الحالية لسلسلة من وسائل بصرية لقياس الأنماط المكانية في هيكل بيوفيلم، وتدفق زعتهbutions على الأغشية الحيوية، والنقل الجماعي حول وداخل المستعمرات بيوفيلم. هذه الأساليب تدعم تحقيقات شاملة للشارك في تطوير بيوفيلم والسكن التجانس.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكائنات الحية الدقيقة نعلق على الأسطح والأغشية الحيوية شكل - المجاميع الخلية المغلقة في مصفوفة خارج الخلية البوليمر 1. الأغشية الحيوية تتصرف بشكل مختلف جدا من الخلايا الميكروبية الفردية، لأن الأغشية الحيوية لها التنوع المكاني الدرامي الناتجة عن مزيج من القيود النقل المذاب الداخلية والاختلافات المكانية في الأيض الخلوي 2،3. تركيزات الأكسجين والمواد الغذائية انخفاضا كبيرا في واجهة بين بيوفيلم والمحيطة السائل والحصول على مزيد من ضمن المنضب في بيوفيلم 2. يمكن أن تحدث أيضا تغيرات المكانية في التنفس بيوفيلم وتخليق البروتين كرد فعل على الأكسجين المحلية وتوافر المواد الغذائية 2.

في البيئات المائية والتربة، ومعظم البكتيريا يسكن في الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية الطبيعية تنفذ العمليات البيولوجية الكيميائية الهامة بما في ذلك ركوب الدراجات الكربون والنيتروجين والحد من المعادن 4،5. سريريا، وتشكيل بيوفيلم هو رد والمرئي لفترة طويلة الرئوية والتهابات المسالك البولية 6. العدوى المرتبطة بيوفيلم هي مشكلة كبيرة لأن الخلايا في الأغشية الحيوية لها مقاومة عالية للغاية لمضادات الميكروبات مقارنة مع نظرائهم العوالق 6. لأن الأغشية الحيوية مهمة في إعدادات متنوعة، وقد تركز قدر كبير من البحوث على فهم العوامل البيئية التي تتحكم في أنشطة بيوفيلم وعدم التجانس المكاني في الأغشية الحيوية والمكروية المحيطة بها.

وقد وجدت دراسات سابقة أن التنمية بيوفيلم وينظم بقوة من قبل عدد من العوامل البيئية: الأغشية الحيوية تتطور الأشكال التضاريسية مختلفة تحت ظروف تدفق مختلف. الأكسجين والمغذيات توافر تأثير التشكل بيوفيلم. وإجهاد القص الهيدروديناميكية يؤثر المرفق من خلايا العوالق على الأسطح ومفرزة من الخلايا من الأغشية الحيوية 7-9. وعلاوة على ذلك، حالة التدفق الخارجي يؤثر على تسليم ركائز كثافة العملياتس وداخل الأغشية الحيوية 10. نمو الأغشية الحيوية يغير أيضا الظروف المحيطة الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال، يؤدي نمو بيوفيلم في استنفاد المحلي من الأوكسجين والمواد المغذية 2. الأغشية الحيوية تتراكم المركبات العضوية وغير العضوية من البيئة المحيطة 11؛ ومجموعات بيوفيلم تحويل تدفق وزيادة سطح الاحتكاك 12،13. لأن الأغشية الحيوية تتفاعل مع بيئتها المحيطة بطرق معقدة جدا، فمن الأهمية بمكان الحصول على المعلومات في وقت واحد على خصائص بيوفيلم والظروف البيئية، ونهج متعدد التخصصات في حاجة لاستخدامها لتوصيف شامل التفاعلات بيوفيلم للبيئة.

هنا نقدم سلسلة من أساليب متكاملة لتوصيف الأنماط المكانية في النمو الميكروبي داخل الأنواع أحادية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع تحت التدرج الغذائية المفروضة، ومراقبة التعديل الناتجة من هذه المادة الكيميائية المحلية والمكروية السوائل. نحن التنوبالحادي ووصف استخدام خلية تدفق ميكروفلويديك مزدوجة مدخل وضعت مؤخرا لمراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرجات الكيميائية واضحة المعالم. نحن ثم شرح استخدام هذه الخلية تدفق الموائع الدقيقة لمراقبة نمو نوعين من البكتيريا، الزائفة الزنجارية والقولونية، في الأغشية الحيوية في ظل مجموعة من الظروف الغذائية. وتبين لنا كيف التصور الموقع من نشر التتبع الفلورسنت في المستعمرات بيوفيلم في يمكن استخدامها لتقييم كمي لأنماط النقل المذاب في الأغشية الحيوية. وأخيرا، وتبين لنا كيف الميكروسكيل velocimetry تتبع الجسيمات، وتتم تحت المجهر متحد البؤر، ويمكن استخدامها للحصول على مجال تدفق المحلي حول الأغشية الحيوية المتنامية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تدفق إعداد الخلية والتلقيح

ملاحظة: استخدم خلية تدفق الموائع الدقيقة مزدوجة مدخل وصفها في كلمات وآخرون 2014 14 لزراعة الأغشية الحيوية. هذه الخلية تدفق قادرة على خلق التدرجات الكيميائية سلسة واضحة المعالم. يظهر تصميم خلية تدفق في الشكل (1) وتتدفق تصنيع خلية وصفت سابقا في كلمات وآخرون. 2014 14. وهنا التفاصيل طرقنا باستخدام P. الزنجارية وE. القولونية لتشكيل الأغشية الحيوية، ولكن قد تكون الأنواع الأخرى مناسب جدا. كنا P. الزنجارية PAO1- GFP، والذي يعبر بشكل جوهري بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، وكائن نموذج للتنمية بيوفيلم. بالإضافة إلى ذلك، كنا E. القولونية DH5α لتشكيل الأغشية الحيوية مختلط الأنواع مع P. الزنجارية. P. الزنجارية وE. كانت تزرع سلالات القولونية على لوحات أجار LB.

  1. إعداد خلية تدفق باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) منضما إلىساترة الزجاج عن طريق الأكسجين العلاج البلازما كما هو موضح في 14. أبعاد الغرفة خلية تدفق هي 23 ملم × 13 ملم × 0.24 ملم (طول × عرض × عمق).
  2. إعداد تعديل FAB النمو المتوسطة 15. لمراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرج الغذائية داخل الخلية التدفق، وإدخال تعديل FAB المتوسطة 15 مع الجلوكوز 0.6 ميكرومتر في مدخل واحد وإدخال FAB وسيط وبدون أي مصدر الكربون من خلال مدخل الآخرين. فلتر تعقيم (حجم المسام = 0.2 ميكرون) محلول المخزون الجلوكوز (60 ملم) قبل إضافتها إلى وسيلة FAB. الأوتوكلاف أيضا وسيلة FAB مع دورة 1 (السائل، 15 دقيقة، 121 ° C، 17 رطل) قبل الاستخدام.
  3. تعقيم نظام التدفق. قبل التلقيح، الأوتوكلاف المسار بالكامل التدفق (زجاجات المتوسطة، وأنابيب، والفخاخ فقاعة، تدفق الخلايا) باستخدام دورة 1، باستثناء البلاستيكية الصمامات الثلاثية (يمكن التخلص منها وتعقيمها قبل) الواقعة المنبع من الخلية التدفق. (تستخدم صمامات ثلاث طرق لحقن الخلايا جulture، التتبع الفلورسنت وميكروبيدات.) لتجنب التلوث أثناء التجمع، وتغطي جميع فتحات أنابيب وموصل مع رقائق الألومنيوم أو أكياس التعقيم الأوتوكلاف قبل.
  4. ربط نظام التدفق. تجميع مكونات نظام خلية تدفق بعناية (انظر الفيديو لتجميع نظام تدفق) وتحقيق نمو متوسط ​​إلى الخلية التدفق عبر مضخة تحوي التي تتحكم بدقة معدل التدفق.
  5. إعداد زراعة الخلايا لالتلقيح عن طريق نقل مستعمرة P. الزنجارية أو E. القولونية من لوحات LB إلى 3 مل من مرق LB ويهز ثقافة O / N في 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. تمييع O / مزارع الخلايا N في 1 مل تعقيم المياه إلى OD النهائي 600 = 0.01 كما قيحة. (الثقافة وتمييع البكتيريا في غطاء تدفق الصفحي لتجنب التلوث.)
  6. للتجارب مع الأغشية الحيوية مختلط الأنواع، وتمييع الثقافتين البكتيرية إلى نسبة 1: 1 في 1 مل مع OD يعادل 600 = 0.01 لكل البكتيريا.
  7. تطعيم الخلية التدفق. حقن 1 مل من اللقاح إلى مدخل الخلية التدفق من ثلاثي صمام. بعد الحقن، وقفة تدفق لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا البكتيرية لنعلق على غطاء زجاجي. (تأكد من أن يتم وضع خلية تدفق مع الجانب ساترة لأسفل للسماح للخلايا مع وقف التنفيذ ليستقر على ساترة.)
  8. بعد 1 ساعة، واستئناف تدفق وضخ المتوسطة النمو إلى الخلية تدفق بمعدل ثابت قدره 0.03 مل / دقيقة لكل مدخل لمدة 3 أيام.

2. تميز بيوفيلم التنمية في الرد على المغذيات التدرجات عن طريق متحد البؤر المجهر

ملاحظة: P. الزنجارية يمكن تصويرها مع GFP أعرب جوهري، ولكن E. القولونية في الأغشية الحيوية مختلط الأنواع يجب تصويرها من قبل counterstaining.

  1. مراقبة الأغشية الحيوية لمدة 3 أيام باستخدام متحد البؤر المجهري. لنتائج ممثلة، ومراقبة الأغشية الحيوية باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 63X. قبل التصوير، علامةخلية تدفق مزدوج مدخل مع شبكة على الجانب غطاء زجاجي. (الغرض من هذه الشبكة هو السماح للالمجرب لتحديد المناطق التصوير داخل غرفة خلية تدفق).
  2. لمباين، وتمييع 10 ميكرولتر من خلايا نفيذ الحمراء الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي، مثل الأخضر الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي مثل STYO 62، حل سهم (1 ملم) في 990 ميكرولتر تعقيم الماء ثم حقن ببطء وصمة عار المخفف باستخدام حقنة في غرفة خلية تدفق من صمام المنبع ثلاثي. الحفاظ على خلية تدفق راكدة وفي الظلام لمدة 30 دقيقة، ثم استئناف تدفق لتغسل وصمة عار غير منضم لمدة 15 دقيقة.
  3. أداء التصوير متحد البؤر. تفعيل 488 نانومتر الأرجون ليزر لالإثارة وانبعاث جمع قنوات GFP (500-535 نانومتر) وصمة عار النووية حامض (لالخضراء الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي، 650-750 نانومتر). ضبط المكاسب والتعويضات لكل من القنوات لديك صورا مشرقة ونظيفة. حدد XYZ وطريقة التصوير في وقت واحد. استخدام مقبض التحكم ض لايدنمنظمة حددت السفلي والعلوي من بيوفيلم في هذا المجال. ضبط خطوة ض إلى 0.5 ميكرون للحصول على 3-D صورة المكدس. (لضمان جودة الصورة العالية، واستخدام المتوسط ​​خط من أربعة لاقتناء الصورة.)
  4. لتعيين الأنماط المكانية للتنمية بيوفيلم داخل الخلية التدفق، والأغشية الحيوية في صورة ثلاثة أو أكثر طولية (خ) المسافات على طول مدخل الخلية التدفق، وعلى ثلاثة عرضية (ذ) الأوضاع النسبية لالتدرج الغذائية المفروضة، كما هو مبين في الشكل (1) .

3. تميز المذاب الداخلية النقل عن طريق الحقن من المحافظين نيون الراسم

ملاحظة: التتبع الفلورسنت المحافظ، مثل Cy5، ويمكن استخدامها لتوصيف أنماط النقل المذاب داخل بيوفيلم.

  1. حل Cy5 (مونو-رد الفعل NHS استر) في الماء لتركيز النهائي من 10 ملغ / مل كحل الأسهم. تخزين محلول المخزون Cy5 في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: كما Cy5 هو خفيف sensitإيف، وتخزين، وتمييع حقن حلول Cy5 في الظلام.
  2. قبل حقن التتبع الفلورسنت، تأخذ 3-D صورة كومة من بيوفيلم 3 أيام مع المجهر متحد البؤر (مع الهدف 63X). (مناطق واسعة من المستعمرات بيوفيلم مثالية لملاحظات السلاسل الزمنية النقل صباغة.) أيضا اختيار لض الطائرة مع المستعمرات فصل جيدا للتصوير (كما هو موضح في الشكل 5A).
  3. لكل تجربة حقن Cy5، وتمييع 2 ميكرولتر من محلول المخزون Cy5 في 998 ميكرولتر تعقيم المياه لتسفر عن حل حقن وجود تركيز Cy5 من 20 ميكروغرام / مل.
  4. وقف ضخ لإيقاف تدفق وحقن الحل Cy5 في المنبع من خلية تدفق باستخدام حقنة عن طريق 3 في اتجاه وصمام. (من المهم منع فقاعات الهواء من الدخول إلى مسار تدفق في حين حقن. يجب أن تبقى الفخاخ فقاعة مفتوحة خلال الحقن في الظهر.)
  5. بعد حقن محلول Cy5، أغلق الفخاخ فقاعة، وضبط 3 في اتجاه وصمام، وإعادة تشغيلضخ لإيصال الحل Cy5 حقنها في الخلية التدفق.
  6. تبديل طريقة التصوير متحد البؤر لXYT. تفعيل Cy5 وGFP قنوات تحت وضع التصوير في وقت واحد. ضبط إعدادات مبائر على كثافة Cy5 (كثافة الليزر، وكسب وتعويض) لتجنب تشبع الإشارات، وهو أمر حاسم بالنسبة الكمي. (ويفضل القرار الزماني عالية لتصور تغلغل الصبغة. ومع ذلك، مسح سريع يقلل جودة الصورة.) اختر سرعة المسح الضوئي المناسبة والمتوسط ​​خط لتحقيق التوازن القرار وقت التصوير وجودة الصورة. لهذا البروتوكول استخدام المتوسط ​​خط من أربعة ومعدل الإطار من 0.15 هرتز.
  7. استئناف تدفق لتقديم Cy5 في الخلية التدفق (لا يزال بمعدل تدفق 0.03 مل / دقيقة). في وقت واحد وقت بدء سلسلة متحد البؤر التصوير.
  8. تحديد Cy5 الاختراق عن طريق حساب متوسط ​​كثافة Cy5 شعاعيا داخل بيوفيلم دائرية 2-D مستعمرة. في المتوسط، أولا التعرف على حافة مجموعة بيوفيلم، ثم إنشاء مخطط المسافة لقسم 2-D من الكتلة، وأخيرا متوسط ​​أنماط شعاعي من شدة Cy5 لتوليد منحنى الاختراق (انظر الشكل 6).
    1. لتحقيق حسابيا خطوة 3.8، استخدم BioSPA (بيوفيلم المكانية تحليل نمط) حزمة برامج (غير منشورة، مجموعة من البرامج ودليل متوفرة عند الطلب) أو غيرها من برامج تحليل الصور.
    2. لاستخدام BioSPA، استيراد أول صورة مجموعة الى BioSPA. ثم حدد عتبة المناسبة لGFP وقنوات Cy5 لجعل الصور ثنائية. في القائمة تحليل / الحساب، حدد تحليل متقدمة ومن ثم تحليل الانتشار. استخدام قناة GFP لتحديد حافة العنقودية واستخدام أداة المضلع لتحديد مجموعة واحدة، مؤكدا أن المنطقة ذات الاهتمام (ROI).
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق الكتلة بيوفيلم المختارة لإجراء تحليل نشرها. حفظ نتائج التحليل نشر ومعايرة شدة Cy5 إلى تركيز Cy5 باستخدام منحنى المعايرة.
      1. لتوليد Cy5 منحنى تركيز معايرة وقياس شدة Cy5 على مدى بغية دراسته واقراره Cy5التدرج ntration تحت المجهر متحد البؤر. (كثافة Cy5 والتركيز لديها علاقة خطية).

4. يميز مجال تدفق المحيطة التي تتبع نيون الجسيمات

ملاحظة: جزيئات الفلورسنت، مثل ميكروبيدات الفلورسنت، ويمكن استخدامها لتوصيف مجال تدفق حول الأغشية الحيوية. ويمكن حساب مجال تدفق حول الأغشية الحيوية من الملاحظات الوقت سلسلة من المواقف الجسيمات باستخدام برنامج تتبع الجسيمات velocimetry. تم الحصول على النتائج المعروضة هنا مع تيارات 2.02 حزمة برامج 16 (تنزيل البرمجيات ودليل المستخدم متاحة في http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

  1. تمييع ميكروبيدات الفلورسنت (قطر ~ 1 ميكرون) في الماء المعقم إلى تركيز قوي النهائي من 0.2٪ والحجم النهائي من 0.5 مل. دوامة للتأكد من أن ميكروبيداتوفرقت أيضا.
  2. حقن وتسليم ميكروبيدات الفلورية المخفف في خلية تدفق الإجراءات من الخطوات 3،3-3،5 التالية. للسماح لتتبع دقيق لمسار الجسيمات، واستخدام معدل منخفض نسبيا تدفق (0.01 مل / ساعة لتتبع النتائج الجسيمات في هذه الورقة).
  3. تبديل إعدادات مبائر لXYT وضع لتتبع حركة الجسيمات في واحدة ض شريحة ويستغرق وقتا طويلا سلسلة الصور. (تم استخدام معدل الإطار من 1 هرتز لنتائج ممثل هو مبين في هذه الورقة.) حقن كرر الجسيمات وصورة في أماكن مختلفة لتوليد ض 3-D مجال تدفق.
  4. ما قبل العملية السلاسل الزمنية صور مبائر بطرح إشارة مضان الخلفية (إشارة في الصورة المكتسبة الأولى من مجموعة صورة) باستخدام يماغيج (تحميل البرمجيات ودليل متوفرة على http://imagej.nih.gov/ij/ ) أو غيرها من البرامج.
  5. في يماغيج، فتح الصورة الأولى من مجموعة الصورة ثم استيراد مجموعة الصورة. تحت عملية / صورة كاليفورنياlculator، طرح أول صورة من مجموعة الصور. حفظ معالجتها قبل مجموعة الصورة.
  6. لحساب نواقل التدفق، استيراد السلاسل الزمنية صور مبائر في تيارات 2.02. تحت عنوان "عرض عملية مفتوحة"، اختيار وتنفيذ "تحديد الجزيئات". استخدام عتبة المناسبة لتحديد الجزيئات. استخدام 0.5 و 5 ميكرون كحد أدنى وأقصى قطر عتبات 1 ميكرون الجسيمات.
  7. ثم تحت "وجهة نظر عملية مفتوحة"، اختيار وتنفيذ "خط أنابيب تحليل PTV" لتوليد مسارات الجسيمات. تحقق مسارات الجسيمات لمعرفة ما إذا كانت تمثل حركة الجسيمات. وأخيرا، اختيار وتنفيذ "إنشاء حقل سرعة" لإنشاء مخطط ناقلات التدفق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلية تدفق الموائع الدقيقة مزدوجة مدخل تتيح مراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرج كيميائية محددة جيدا التي شكلتها خلط حلين داخل غرفة التدفق. مما أدى التدرج الكيميائية لوحظ سابقا عن طريق الحقن صبغ وتتميز بالتفصيل كلمات وآخرون. 14. وتم تشكيل التدرجات تركيز الملساء في الاتجاه العرضي، كما هو مبين في الشكل رقم 1. إن قائمة تركيز حاد بالقرب من مدخل وحصلت على تخفيف المصب بسبب نشر (الشكل 1). لمراقبة تطور بيوفيلم تحت التدرج الغذائية، استخدمنا وسيلة تعريف الحد الأدنى من النمو (FAB المتوسطة) مع الجلوكوز فقط إضافة إلى مدخل واحد كمصدر وحيد للكربون. ونتجت عن ذلك التدرج الجلوكوز في غرفة خلية تدفق في حين أن كل المواد المغذية الأخرى تم توزيع متجانس. نمو P. ارتبط الأغشية الحيوية الزنجارية PAO1 بشدة على التسليم المحلي من الجلوكوز (الشكل 2).كما كان عرضية التدرج تركيز الجلوكوز الحاد بالقرب من مدخل، أظهرت الكتلة الحيوية بيوفيلم على انخفاض هائل من منطقة عالية الجلوكوز إلى المنطقة منخفضة الجلوكوز. كما التدرج الجلوكوز عرضية خففت المصب، أصبحت الكتلة الحيوية بيوفيلم أكثر تجانسا. لقد أثبتنا أيضا استخدام هذه الخلية تدفق لدراسة تفاعلات P. الزنجارية وE. القولونية في الأغشية الحيوية في ظل الانحدار الجلوكوز (الشكل 3). وأظهرت النتائج أن هذين النوعين أظهرت الأنماط المكانية واضحة في نمو نسبة إلى التدرج الغذائية، وبالتالي احتلت بيئات ايكولوجية متميزة: P. تهيمن الكتلة الحيوية الزنجارية بيوفيلم في المناطق ذات تركيزات الجلوكوز عالية وE. يهيمن القولونية في المناطق ذات تركيزات الجلوكوز المنخفضة (الشكل 3).

لفهم ردود الفعل بين النمو بيوفيلم والبيئة تدفق المحيطة بها، ونحن تتميز مجال تدفق الحيوية حول تزايدالأفلام التي كتبها الفلورسنت velocimetry تتبع الجسيمات تحت المجهر متحد البؤر. وأظهرت حركة احظ من ميكروبيدات الفلورسنت حقن في الفيلم تم استخراج المعلومات 1. ناقلات تدفق المحلية من متوسط ​​قدره 4،200 على الأقل قياسات منفصلة من سرعات الجسيمات باستخدام حزمة البرامج تيارات. تم الحصول على خرائط ثلاثية الأبعاد للحقل التدفق من خلال تتبع الجسيمات في مواقع العمودية متعددة (الشكل 4). نمو بيوفيلم زيادة كبيرة في عدم التجانس تدفق (الشكل 4). تدفق بالقرب من قاعدة بيوفيلم تحويل حول مجموعات بيوفيلم، مما يؤدي إلى زيادة التجانس وانخفضت سرعة (الشكل 4). تدفق في أعلى بيوفيلم ديه أعلى سرعة وأكثر تجانسا (الشكل 4).

لفهم عدم التجانس الداخلي الناجم عن النقل المذاب محدود داخل الأغشية الحيوية، لاحظنا نقل Cy5 داخل الأغشية الحيوية بواسطة المجهر متحد البؤر. اختراق السلاسل الزمنيةمن Cy5 إلى مجموعة بيوفيلم يظهر في الفيلم 2. الوقت سلسلة Cy5 منحنيات اختراق يظهر في الفيلم 3. معامل الانتشار الفعال لCy5 في الأغشية الحيوية تم حسابها من المناسب نشر نموذج 1-D إلى ملامح تركيز Cy5:

المعادلة 1

حيث C هو تركيز Cy5 متوسط ​​شعاعيا-تحسب من كثافة مضان، وهي المسافة في بيوفيلم 17. أظهر Cy5 أعلى تركيز في تدفق بكميات كبيرة وانخفض بشكل حاد عند دخول بيوفيلم (الشكل 5).

الشكل (1)
الشكل 1. خلية تدفق الموائع الدقيقة مزدوجة مدخل. تم إنشاء التدرجات الجلوكوز السلس داخل غرفة التدفق عن طريق إدخال المتوسطة FAB إلى مداخل اثنين مع مصدر الكربون (gluco SE) تقدم فقط في مدخل واحد. الناتجة أنماط من الجلوكوز داخل الخلية تدفق بالرمز التظليل. التظليل الداكن يمثل تركيزات الجلوكوز أعلى. تم إجراء التصوير متحد البؤر في تسعة مواقع في الخلية التدفق. النتائج المقدمة في الشكلين 2 و 3 الرجوع إلى المواقع المرقمة 1-9 في الشكل. تم تعديل هذا الرقم بعد كلمات وآخرون (2014)، الشكل. 1. اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تم تصوير الشكل 2. PAO1 نمو بيوفيلم تحت التدرجات الجلوكوز. الأغشية الحيوية PAO1 3 أيام في 9 مواقع مبين في الشكل 1. تباعد الشبكة = 18 ميكرون لصورة 1-8 و 24 ميكرون لصورة 9.ز "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تطوير P. الزنجارية وE. الأغشية الحيوية ثنائي الأنواع القولونية تحت التدرجات الجلوكوز. P. الزنجارية تعرب جوهري GFP، وكانت counterstained الأغشية الحيوية أيضا SYTO 62، والتي هي وصمة عار الحمض النووي العامة. الصور المعروضة هنا هي تراكب من GFP (الخضراء) وSYTO 62 (الحمراء) القنوات. P. لذا يبدو الزنجارية أخضر أو أصفر (أخضر + أحمر)، وE. القولونية يبدو الحمراء. الحانات النطاق = 47 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الحقول الشكل 4. تدفق سرعة ناقلات في ض = 4 و 10 و 16 ميكرون حول مجموعة بيوفيلم. ويبلغ طول السهم يمثل حجم السرعة. وتظهر انخفاض سرعة تدفق في قاعدة بيوفيلم (ض = 4، والسهام الزرقاء). تدفق هو أكثر تجانسا قرب أعلى بيوفيلم (ض = 16، السهام الحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. Cy5 اختراق الأغشية الحيوية. (A) متحد البؤر مجهرية في ض = 18 ميكرومتر تظهر الاختراق الجزئي للCy5 في مجموعات بيوفيلم في ر = 190 ثانية. الحانات النطاق = 10 ميكرومتر. (B) الناتجة أنماط Cy5 خريطة التركيز. (C) Cy5 الملف الشخصي تركيز في المجموعة بيوفيلم واحد. 602fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. إجراءات لإنشاء ملف تعريف اختراق Cy5 اليسار: مختارة ROI تحتوي على مجموعة بيوفيلم 2-D. خريطة القطر من الكتلة بيوفيلم: المتوسطة. اليمين: متوسط ​​شعاعي-ملف كثافة Cy5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1 : الحركة من الجسيمات الفلورية حقنها حول مجموعات بيوفيلم (فيديو متحد البؤر).

فيلم 2 : تأمرون Cy5 في مجموعات بيوفيلم (فيديو متحد البؤر).

_content "> فيلم 3 : تأمرون Cy5 في مجموعات بيوفيلم (تركيز لمحات من الفيديو).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أثبتنا مجموعة من الطرق لتوصيف الثلاثة المهمة التفاعلات بيوفيلم للبيئة: استجابة بيوفيلم إلى التدرجات الكيميائية، وآثار نمو بيوفيلم على المكروية تدفق المحيطة بها، وعدم التجانس بيوفيلم الناجمة عن القيود النقل الداخلي.

أظهرنا لأول مرة استخدام خلية تدفق ميكروفلويديك جديدة لفرض التدرج كيميائية محددة جيدا للتنمية بيوفيلم. لتوليد التدرج كيميائية محددة جيدا داخل الخلية التدفق، فمن المهم للحفاظ على نفس معدل التدفق لكل من مداخل. تأكد من أن مضخة تحوي يتم تعديل بشكل جيد لكلا قنوات تدفق لتقديم المتوسطة النمو بنفس المعدل. وتأكد أيضا من عدم وجود انسداد في مسار تدفق أثناء نمو بيوفيلم. ملاحظات نمو الأغشية الحيوية ثنائي الأنواع في هذا المعرض خلية تدفق التدرجات الكيميائية التي أثرت بشكل كبير نمو بيوفيلم والتفاعلات بين الأنواع داخل الأغشية الحيوية. التدرجات الكيميائية شائعة فيالبيئات التي تنمو الأغشية الحيوية، وذلك بسبب مجموعة من القيود والنقل، وملزمة الكيميائية وردود الفعل، وامتصاص والتمثيل الغذائي الميكروبي 18-20. هذه الخلية تدفق الموائع الدقيقة تمكن التحقيقات من الأنشطة المتنوعة بيوفيلم تحت مجموعة محددة من الظروف الكيميائية داخل جهاز واحد. على سبيل المثال، وقد تجلى هذا خلية تدفق لتكون مفيدة لدراسة مقتل بيوفيلم تحت التدرج مضادات الميكروبات 14.

نحن ثم أثبت استخدام velocimetry تتبع الجسيمات لمراقبة تدفق الحقل حول مجموعات بيوفيلم. لضمان تتبع دقيق للجزيئات الفلورسنت حقن، يحتاج معدل التدفق إلى أن يكون الأمثل. عادة، ومعدل التدفق المنخفض يسمح للحركة الجسيمات ليتم القبض في الحقل متحد البؤر نظر. أيضا يحتاج معدل الإطار المسح إلى أن يكون الأمثل لتحقيق التوازن بين جودة الصورة ودقة الوقت. إذا كانت الجزيئات تتحرك بسرعة كبيرة لالتقاط الحركة، واستخدام أقل أو خط المتوسط ​​الإطار أو increسرعة المسح الضوئي بورصة عمان. نحن تعيين مجال تدفق في ثلاثة مواقع العمودية على مجموعة بيوفيلم، ووجد أن نمو بيوفيلم زيادة التجانس التدفق. تميز مجال التدفق حول الأغشية الحيوية يسمح التفاعلات تدفق بيوفيلم الرئيسية التي يجب استكشافها. على سبيل المثال، وهذا يمكن أن تستخدم لتقييم الآليات التي تنظم السحب السوائل والقص على بيوفيلم، وفشل بيوفيلم الناتجة عنها، ومفرزة من الخلايا من سطح 1،21. هذه العمليات هي مهمة لفهم كل من آثار الأغشية الحيوية على أنظمة تدفق (على سبيل المثال، biofouling) وتنظيم بيوفيلم التشكل 8. ظروف تدفق حول الأغشية الحيوية أيضا التحكم في النقل الجماعي، وهو أمر مهم لمجموعة واسعة من العمليات بيوفيلم. على سبيل المثال، وسرعة السائل المحلية على سطح بيوفيلم يؤثر على إيصال المواد المغذية وركائز إلى الأغشية الحيوية من خلال حركة الهواء الأفقية 22.

وأخيرا، أظهرنا استخدام حقن استشفاف الفلورسنت لتحليلأنماط النقل المذاب داخل بيوفيلم. كنا Cy5 هنا كما التتبع المحافظ، ويبدو أن هذا فلوري لفي كثير من الأحيان تتصرف بتحفظ في الأغشية الحيوية 23. ولذلك ينبغي أن تكون النتائج ممثلة أنماط النقل من غير رد الفعل، والمواد المذابة محايدة في الأغشية الحيوية. وأظهرت النتائج انخفاض حاد التركيز Cy5 بالقرب من سطح بيوفيلم، مما أسفر عن تركيز Cy5 في المناطق الداخلية من بيوفيلم فقط ~ 50٪ من تركيز في تدفق بكميات كبيرة. هذه لمحات تركيز حاد متسقة مع قياسات عنها سابقا من الأكسجين والمغذيات ومضادات الميكروبات داخل الأغشية الحيوية 2،24. توفر منحنيات اختراق Cy5 معلومات عن المذاب نشر في مجموعات بيوفيلم. ومع ذلك، الأسلوب نقدم هنا يقتصر على تحليل 2-D النقل المذاب في الأفقي (س ص) طائرات في الأغشية الحيوية. وفقا لأحدث القدرة على التصوير السريع، على سبيل المثال الغزل القرص المجهري متحد البؤر، تغلغل الصبغة يمكن أيضا تصور في 3-D داخل الأغشية الحيوية، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل سيسمح باجراء تحقيق في عمليات النقل العمودية. وعلاوة على ذلك، التتبع الفلورسنت والجسيمات يمكن حقنها معا للحصول على معلومات من ظروف تدفق الخارجية والنقل الداخلي المذاب في نفس الوقت. هذه المعلومات مفيدة لتمييز النقل المذاب عبر الهوائي الأفقي وناشر بين تدفق بالجملة والأغشية الحيوية وتقييم تأثير تدفق خارجي على النقل الداخلي المذاب في الأغشية الحيوية.

وبشكل عام، فإننا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية من استخدام خلية تدفق الموائع الدقيقة الرواية التي توفر محددة جيدا التدرجات الكيميائية لدراسة الردود بيوفيلم لمنبهات الكيميائية في البيئة. لتوصيف أفضل عدم التجانس في الأغشية الحيوية وموئل دقيق المحيطة بها، نقدم هنا طرق لتوصيف أنماط في كل مجال تدفق المحيطة الأغشية الحيوية والنقل الداخلي المذاب داخل الأغشية الحيوية. يوفر كل أسلوب معلومات مميزة على خصائص بيوفيلم و / أو الظروف البيئية. منذ هذه الأساليبتتكامل، ويمكن الحصول على جوانب متعددة من المعلومات في وقت واحد. تمكن المعلومات جنبا إلى جنب الباحثين الاقتراب مشاكل أكثر تعقيدا. على سبيل المثال، باستخدام هذه الأساليب، نجحنا في تحليل تطور بيوفيلم وبين الأنواع التفاعلات في الأغشية الحيوية في ظل الانحدار المغذيات. هذه الأساليب أيضا توفر القدرة التجريبية لزيادة تعقيد في المجتمع الميكروبي والبيئة الكيميائية، والذي يسمح تحقيقات بشأن عمليات بيوفيلم في سياق أكثر واقعية. التطبيقات المحتملة لهذه الأساليب تغطي جوانب متنوعة من البحوث بيوفيلم، بما في ذلك بيوفيلم دورة الحياة، والأغشية الحيوية متعددة الأنواع، بيوفيلم التجانس، وعمليات النقل في الأغشية الحيوية، والتفاعل بيوفيلم التدفق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر مات Parsek في جامعة واشنطن (سياتل، WA) لتوفير P. الزنجارية وE. سلالات القولونية وروجر Nokes في جامعة كانتربري (نيوزيلندا) لتوفير الوصول إلى تيارات البرمجيات. وأيد هذا العمل من قبل R01AI081983 منحة من المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. تم إجراء التصوير متحد البؤر في مرفق نورث وسترن التصوير البيولوجية (BIF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic Pump Gilson Miniplus 3 Flow cell setup and inoculation
Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow Gilson F117934 Flow cell setup and inoculation
Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock Smiths Medical  MX9311L Flow cell setup and inoculation
Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels ML Solar LLC Flow cell setup and inoculation
Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 VWR 16157-191 Flow cell setup and inoculation
C-FLEX Tubing Cole-Parmer 06422-02 Flow cell setup and inoculation
1 ml TB Syringe BD 309659 Flow cell setup and inoculation
Polymer Tubing IDEX 1520G Flow cell setup and inoculation
Sterile Intramedic Luer Stub Adapter Clay Adams 427564 Flow cell setup and inoculation
PrecisionGlide Needle BD 305195 Flow cell setup and inoculation
Spectrophotometer HACH Flow cell setup and inoculation
Syringe filters - sterile (0.2 μm) Fisherbrand 09-719A Flow cell setup and inoculation
MAXQ Shaker Thermo Scientific Flow cell setup and inoculation
Ammonium sulfate Sigma Aldrich A4418 Growth media
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma Aldrich RES20908-A7 Growth media
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P5655 Growth media
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 Growth media
Magnisium chloride Sigma Aldrich M8266 Growth media
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 Growth media
Calcium sulfate dihydrate Sigma Aldrich C3771 Growth media
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 215422 Growth media
Manganese(II) sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634 Growth media
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich 451657 Growth media
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251 Growth media
Cobalt(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich C6768 Growth media
Sodium molybdate Sigma Aldrich 243655 Growth media
Boric acid Sigma Aldrich B6768 Growth media
Dextrose Sigma Aldrich D9434 Growth media
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Growth media
TCS SP2 Confocal Microscopy Leica Fluorescent imaging
SYTO 62 Life Technology S11344 Fluorescent imaging
Cy5 GE Healthcare Life Sciences PA15100 Fluorescent imaging
Red Fluorescent (580/605) FluoSphere Life Technology F-8801 Fluorescent imaging
BioSPA Packman Lab Image Processing
ImageJ NIH Image Processing
Volocity PerkinElmer Image Processing
Streams 2.02 University of Cantebury Image Processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, (2), 95-108 (2004).
  2. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, (3), 199-210 (2008).
  3. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64, (10), 4035-4039 (1998).
  4. Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  5. Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426, (6965), 439-442 (2003).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284, (5418), 1318-1322 (1999).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65, (1), 83-92 (1999).
  9. Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36, (19), 4775-4784 (2002).
  10. Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28, (2), 187-198 (2012).
  11. Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32, (8), 27-33 (1995).
  12. Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44, (5), 636-641 (1994).
  13. Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121, (1), 44-51 (1999).
  14. Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111, (3), 597-607 (2014).
  15. Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62, (5), 1264-1277 (2006).
  16. Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
  17. Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59, (3), 261-272 (1998).
  18. Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2, (6), 680-686 (2000).
  19. Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9, (3-4), 159-168 (1998).
  20. Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43, (11), 1131-1138 (1994).
  21. Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36, (7), 1653-1665 (2002).
  22. Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108, (11), 2571-2582 (2011).
  23. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, (10), 2865-2878 (2013).
  24. Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60, (12), 4339-4344 (1994).
طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).More

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter