Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

方法表征的共同发展生物膜和生境异质性

doi: 10.3791/52602 Published: March 11, 2015

Abstract

生物膜是具有复杂的结构,并产生显著的空间异质性表面附着的微生物群落。生物膜发展被周围流动和营养环境强烈调节。生物膜生长也通过产生复杂的流场和溶质运输模式增加了局部微环境的不均一性。为了研究异质性的生物膜及其局部微栖息地之间的生物膜和互动发展,我们长大绿脓杆菌的单种生物膜和P.双种生物膜根据营养梯度的微流体流动池假单胞菌大肠杆菌 。我们对流动单元内创建养分梯度和用于生长和在这些条件下可视化生物膜发展提供详细协议。我们还进行了一系列的光学方法本协议来量化空间模式在生物膜结构,流DISTRIbutions在周围生物膜,和大众交通和生物膜殖民地之内。这些方法支持联合开发的生物膜和生境异质性的全面调查。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

微生物附着于表面,并形成生物膜-封闭在细胞外聚合物基质1细胞集合体。生物膜表现非常不同,从单个微生物细胞,由于生物膜具有戏剧性的空间异质性,从 ​​内部溶质运移限制和空间变化的细胞代谢2,3的组合产生。氧气和营养物浓度急剧降低,在生物膜和周围的流体并获得内生物膜2进一步贫化之间的接口。在生物膜呼吸和蛋白质合成的空间变化,也可能发生由于局部氧和养分有效性2的响应。

在水体和土壤环境中,大部分细菌住在生物膜。天然生物膜进行重要的生物地球化学过程,包括骑自行车的碳和氮,减少金属4,5。在临床上,生物膜的形成是responsIBLE长时间肺部和泌尿系统感染6。生物膜相关的感染是很成问题,因为细胞在生物膜得抗菌素极高电阻相比,其浮游对口6。由于生物膜是在不同的设置很重要,研究了大量一直专注于了解控制生物膜活动和空间异质性的生物膜和周围的微环境中的环境因素。

先前的研究已经发现,生物膜发展强烈地受到许多环境因素的调节:生物膜发展的各种流动状态下不同的形态;氧气和养分供应影响生物膜形态;和流体剪切应力影响浮游细胞的附着于表面和细胞从生物膜7-9脱离。此外,外部流动状况影响的基板INT交付O和生物膜10中。生物膜的增长也改变了周围的物理和化学条件。例如,生物膜生长导致氧气和营养2的局部耗竭;生物膜积聚来自周围环境11的无机和有机化合物;和生物膜集群转移流动,增加表面摩擦力12,13。因为生物膜与其周围环境中非常复杂的方式相互作用,这是至关重要的,以同时获取对生物膜特性和环​​境条件的信息,和多学科的方法需要使用全面表征生物膜与环境的相互作用。

在这里,我们提出了一系列的综合方法,以在单种和双种生物膜中的微生物生长空间格局特征下强加的营养梯度,并观察所产生的局部化学和流体微环境的改变。我们杉ST描述了使用最近开发的双入口的微流体流动池的观察下明确定义的化学梯度生物膜生长。然后,我们说明如何使用该微流体流动池的观察下的范围内的营养条件2种细菌, 绿脓杆菌大肠杆菌 ,在生物膜的生长。我们展示了如何荧光示踪剂传播到生物膜集落原位可视可以用于定量评估生物膜溶质运输模式。最后,我们显示如何微尺度粒子跟踪测速,在共聚焦显微镜进行的,可以被用于获得周围生长生物膜局部流场。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.流通池设置和接种

注意使用在Song 等人所述的双入口的微流体流动池,2014 14生长生物膜。这个流动池是能够创造良好定义的平滑化学梯度。流动池设计示于图1和流动池制造以前在乐曲等人的,2014年14。在这里,我们详细我们的方法通过使用P。铜绿假单胞菌E.大肠杆菌以形成生物膜,但其他物种可能是合适的了。我们使用P.绿脓杆菌 PAO1- GFP,其中组成性表达绿色荧光蛋白(GFP),作为模式生物的生物膜发展。此外,我们使用E.大肠杆菌 DH5α形成混种生物膜与P.铜绿假单胞菌。P.铜绿假单胞菌E.大肠杆菌菌株生长在LB琼脂平板上。

  1. 准备使用聚二甲基硅氧烷流动池(PDMS)绑定到一个通过氧等离子处理的玻璃盖玻片如14所述。流动池室的尺寸是23毫米×13毫米×0.24毫米(长×宽×深)。
  2. 制备改性FAB生长培养基15。观察下的流动单元内的营养梯度生物膜生长,引入改性FAB用0.6μM的葡萄糖培养基15在一个进口和没有通过另一入口任何碳源引入FAB培养基。过滤器 - 杀菌(孔径= 0.2微米)加入到该FAB介质之前葡萄糖储液(60毫摩尔)。在使用之前,还高压灭菌FAB介质循环1(121°C,17磅的液体,15分钟)。
  3. 消毒流动系统。在接种前,高压釜用周期1中,除了位于所述流动池上游的塑料三通阀(一次性的预灭菌的)整个流路(介质瓶,管,气泡陷阱,流动池)。 (三途径阀用于注射小区culture,荧光示踪剂和微球)。要避免污染装配过程中,覆盖所有的管路和接头开口用铝箔或高压反应釜前袋。
  4. 连接流系统。仔细装配流动池系统的组件(参见流动系统组件的视频),并通过一个蠕动泵精确地控制流量递送生长培养基到流动池。
  5. 通过将P.的殖民地准备的细胞培养接种绿脓杆菌E.大肠杆菌 LB板至3ml LB肉汤,动摇文化O / N在225转,37℃。稀释在1ml无菌水中至最终OD 600的O / N的细胞培养物= 0.01作为接种物。 (文化和稀的细菌在层流罩,以避免污染。)
  6. 对于具有混合物种的生物膜的实验中,稀释2细菌培养物为1:1的比例在1ml用等效的OD 600 = 0.01对于每个细菌。
  7. 接种流动池。注射1毫升接种物从三通阀的流动池入口。注射后,暂停所述流1小时,以允许细菌细胞附着到玻璃盖。 (请确保流动池放置盖玻片的一面朝下,以使悬浮细胞定居到盖玻片)。
  8. 1小时后,恢复的流量和泵的生长培养基到流动池以0.03毫升/分的每个入口3天的恒定速率。

2.表征生物膜发展应对营养梯度利用共聚焦显微镜

:P.假单胞菌可以与组成型表达的GFP进行成像,但大肠杆菌大肠杆菌在混合物种的生物膜必须由复染进行成像。

  1. 观察使用共焦显微镜的3天的生物膜。对于代表性的结果,观察使用共焦显微镜用63X的目标生物膜。此前成像,标记双入口流动细胞上的玻璃盖侧的网格。 (此网格的目的是允许实验者流动池室中定位在成像区域)。
  2. 为了对,稀释10微升的细胞穿透物的红色荧光核酸染料,例如绿色荧光核酸染料,如STYO 62,在990微升原液(1毫米)的灭菌水,然后缓慢注入用注射器向稀释污点流动池室从上游三通阀。保持流动池停滞和在黑暗中30分钟,然后恢复流洗出未结合的染色15分钟。
  3. 执行共聚焦成像。激活488nm的氩激光激发和发射收集渠道的GFP(500-535纳米)和核酸染色(绿色荧光核酸染料,650-750纳米)。调节增益和偏移的两个通道有光洁的图像。选择XYZ和同步成像模式。使用Z-控制旋钮IDENtify在外地生物膜的底部和顶部。设置的Z轴步骤至0.5微米,用于获取三维图像栈。 (为了保证高的图像质量,使用线路平均四个用于图像采集。)
  4. 映射生物膜发展的流动单元内的空间模式,图像生物膜在三个或更多的纵向(x)的沿所述流动池入口的距离,和在三个横向(y)的位置相对于所施加的营养梯度, 如图1

3.内部表征溶质运移保守荧光示踪剂的注射

注:保守的荧光示踪物,如Cy5标记,可用于生物膜内表征溶质运输模式。

  1. 溶于水的Cy5(单活性NHS酯),以10毫克/毫升作为原液的最终浓度。存储Cy5的原液在-20℃的冰箱中。
    注:由于Cy5的是光SENSITIVE,存储,稀释并在黑暗中注入Cy5的解决方案。
  2. 在此之前的荧光示踪剂的注射剂,取3天的生物膜用共焦显微镜的三维图像栈(具有63X物镜)。 (生物膜菌落宽区域是理想的染料传输的时间序列的观察)。另外选择的z平面与用于成像以及分离的菌落( 如图5A)。
  3. 对于每个Cy5的注入实验中,稀释2微升Cy5的原液在998微升灭菌水,得到具有20微克/ ml的Cy5的浓度的注射溶液。
  4. 停止泵暂停流并注入所述Cy5的溶液成可经由三通阀使用注射器流动池的上游。 (重要的是要防止气泡进入流路,同时注入是非常重要的。气泡陷阱应保持开放的背面注射期间)。
  5. 注入Cy5的解决方案后,关闭泡沫陷阱,调整三通阀,并重新启动泵提供所注入的Cy5的溶液注入流动池。
  6. 开关共焦成像模式XYT。激活下同时成像模式的Cy5和GFP渠道。调整Cy5的强度共焦设置(激光强度,增益和偏移),以避免饱和的信号,这对于量化的关键。 (高时间分辨率是优选的可视化染料渗透,然而,快速扫描降低图像的质量。)选择适当的扫描速度和线平均平衡成像的时间分辨率和图像质量。此协议使用一条线平均4和0.15赫兹帧频。
  7. 恢复流来提供Cy5的入流通池(仍然以0.03毫升/分钟的流速)。同时启动的时间序列共聚焦成像。
  8. 通过径向平均不到2-D循环生物膜殖民地Cy5的强度量化Cy5的渗透。进行平均,首先确定一个生物膜簇的边缘,然后生成一个距离的地图为集群的2-D部,最后的Cy5强度的平均径向图案,以产生渗透曲线(参见图6)。
    1. 为了计算实现步骤3.8,使用BioSPA(生物膜空间格局分析)软件包(未出版,软件和手动可应要求提供)或其他图像分析程序。
    2. 要使用BioSPA,先导入设置成BioSPA图像。然后选择合适的阈值,GFP和Cy5渠道进行二值图像。在分析/计算菜单中,选择高级分析,然后扩散分析。使用GFP通道以限定一集群的边缘,并使用多边形工具选择一个簇作为感兴趣区域(ROI)的区域。
    3. 双击选定的生物膜集群进行扩散分析。保存扩散分析结果和使用校准曲线校准Cy5的强度,以Cy5的浓度。
      1. 以产生Cy5的浓度的校准曲线,过的Cy5 conce测量Cy5的强度根据共焦显微镜ntration梯度。 (Cy5的强度和浓度具有线性关系。)

4.定性周围流场跟踪荧光颗粒

注:荧光颗粒,如荧光微珠,可用来围绕生物膜流场的特征。生物膜周围流场可以使用粒子跟踪测速软件颗粒归仓的时间序列的观测来计算。此处显示的结果与流2.02软件包16(软件下载,并在可用的用户指南获得http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml )。

  1. 稀释的荧光微珠(直径约1微米)在无菌水中,以0.2%的最终固体浓度为0.5ml的最终体积。涡流以确保微珠被良好地分散。
  2. 注入和交付稀释荧光微球进入流通池下面的步骤,从3.3到3.5的过程。以允许粒子路径的精确跟踪,可使用相对低的流率(0.01毫升/小时的粒子追踪结果在本文中)。
  3. 切换共焦设置XYT模式在同一z轴切片来跟踪颗粒运动,并采取时间序列图像。 (1赫兹的帧速率被用于在本文中示出的代表性结果。)重复粒子注射和图像在不同的z轴位置,以产生三维流场。
  4. 预过程的时间序列的共焦图象中减去使用(可在软件下载和手动ImageJ的背景荧光信号(在图像组的第一获取的图像信号) http://imagej.nih.gov/ij/ )或其他程序。
  5. 在ImageJ的,打开一个图像集的第一张图像,然后导入图像集。在过程/图像钙lculator,从图像集合中减去第一图像。保存处理前的图像集。
  6. 要计算流动载体,导入时间序列共聚焦图像流2.02。在“开立流程视图”中,选择并执行“确定粒子”。使用适当的门槛,以确定粒子。用0.5和5微米的最小和最大直径阈值1微米的颗粒。
  7. 然后在“打开进程查看”,选择并执行“PTV分析管道”产生的粒子的路径。检查粒子的路径,看看他们是否代表粒子的运动。最后,选择并执行“创建速度场”,以产生流动矢量地图。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

双入口的微流体流动池允许观察生物膜生长的下由两种溶液的流动室中混合形成的明确定义的化学梯度。由此产生的化学梯度的前身是由染料注射观察其特征详细宋等人。14。形成平滑的浓度梯度在横向方向上, 如图1中的浓度分布是陡峭的邻近入口和下游得到放宽由于扩散( 图1)。观察下一个营养梯度生物膜发展,我们使用一个定义的最小生长培养基(FAB培养基)与葡萄糖只加一个入口作为唯一碳源。这产生了在流动池室中的葡萄糖梯度,而所有其他营养素均匀分布的。 P的增长假单胞菌 PAO1生物膜强烈相关,局部递送葡萄糖的( 图2)。作为横向的葡萄糖浓度梯度是陡接近所述入口,所述生物膜的生物量表现出显着降低由高葡萄糖区域到低血糖区域。作为横向葡萄糖梯度缓和下游,生物膜生物质变得更加均匀。我们进一步证明利用这个流动池来研究P的相互作用铜绿假单胞菌E.大肠杆菌中下一个葡萄糖梯度生物膜( 图3)。结果表明,这两个物种显示出相对生长明显的空间模式的营养梯度,并因此占据独特生态位:P。铜绿假单胞菌为主生物膜生物量的区域与高糖浓度和E.大肠杆菌为主的地区,低血糖浓度( 图3)。

为了了解生物膜的生长和周围流动的环境之间的反馈,我们的特点流场周围越来越多的生物通过荧光粒子跟踪测速电影共聚焦显微镜下。所注入的荧光微珠的观测到的运动表示在动画1.本地流矢量信息是从平均至少4200分立使用流软件包粒子速度的测量萃取。通过在多个垂直位置( 图4)跟踪粒子得到的流场的立体测绘的。生物膜生长显著增加的流动不均匀性( 图4)。附近生物膜基流改道绕生物膜集群,从而增加异质性和速度的下降( 图4)。流在生物膜顶部具有更高的速度和更均匀的( 图4)。

要了解引起生物膜内有限的溶质运移内部的异质性,我们通过激光共聚焦显微镜观察Cy5的生物膜内的运输。时间序列的渗透Cy5的成生物膜簇示于电影2时间序列Cy5的渗透曲线示于电影3的Cy5的生物膜中的有效扩散系数进行了计算拟合一维扩散模型的Cy5的浓度分布:

式(1)

其中C是从荧光强度计算出的径向平均Cy5的浓度,并且是距离进入生物膜17。 Cy5的显示最高浓度的总体流动并在进入生物膜( 图5)急剧减小。

图1
图1.双进微流体流动池。通过引入FAB介质的两个入口与碳源流动室内创建平滑葡萄糖梯度(葡糖本身)的一个入口仅提供的。所得的所述流动单元内的葡萄糖的图案由阴影表示。黑暗的阴影代表高血糖浓度。在流动池9的位置进行共焦成像。结果在图2和3指的位置呈现在图中编号1-9。 Song 等人之后这个数字被修改。(2014),图1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
根据葡萄糖梯度图2. PAO1生物膜生长3天的PAO1生物膜进行成像在图1中所示的9个位置。网格间距= 18微米为图像1-8和24微米的用于图像9。G“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3 P的发展铜绿假单胞菌E.在葡萄糖梯度大肠杆菌双种生物膜。P. 假单胞菌组成型表达绿色荧光蛋白,和生物膜也counterstained由SYTO 62,这是一个普通的核酸染色。这里显示图像的GFP(绿色)和SYTO 62(红色)通道的叠加。P.因此假单胞菌显示绿色或黄色(绿色+红色)和E.大肠杆菌显示为红色。比例尺= 47微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.流速矢量场在z = 4,10和16微米左右的生物膜群集。箭头的长度表示速度的大小。低流速显示,在生物膜基地(Z = 4,蓝色箭头)。流量接近生物膜顶部(Z = 16,红色箭头)更均匀。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5. Cy5的渗透到生物膜。(A)共聚焦显微镜在z = 18微米呈现在t = 190秒Cy5的部分渗透到生物膜集群。比例尺= 10微米。(B)中所得的的Cy5的浓度图的模式。在一个生物膜簇(C)的 Cy5的浓度分布。 602fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.用程序生成一个Cy5的穿透轮廓选定的ROI包含的2-D生物膜群集。中东:距离生物膜集群的地图。右:径向平均Cy5的强度分布。 请点击此处查看图的放大版本。

电影1 :周围生物膜集群注入荧光粒子运动(共聚焦视频)。

电影2 :繁殖的Cy5成生物膜集群(共聚焦视频)。

_content“> 电影3 :传播的Cy5成生物膜集群(浓度分布的视频)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

我们表现​​出了一套方法来描述三个重要的生物膜与环境的相互作用:生物膜反应化学梯度,生物膜生长在周围的微环境流量,和生物膜的异质性,从内部运输的局限性造成的影响。

我们首先显示了使用一种新颖的微流体流动池,以施加用于生物膜发展的一个明确定义的化学梯度。以产生流动单元内的明确定义的化学梯度,以维持相同的流速为两个入口是重要的。确保该蠕动泵是公调整两个流动通道,以在相同的速率输送成长介质。另外,还要确保有生物膜生长过程中的流动路径没有堵塞。双物种生物膜在这个流动池表明化学梯度很大影响生物膜内生物膜生长和种间相互作用的生长的观察。化学梯度是在共同环境中生长的生物膜,由于交通的限制,化学结合和反应,和微生物的吸收和代谢18-20的组合。这种微流体流动池使得能够多样生物膜活动的单个设备内下一个限定的化学条件范围进行调查。例如,该流动单元已被证明是用于杀灭生物膜下抗菌梯度14的研究是有用的。

然后,我们展示了使用粒子跟踪测速观察周围生物膜集群的流场。为了确保注射荧光发色粒子的精确跟踪,流速需要优化。通常情况下,低流速使得粒子的运动,以在视场共焦被捕获。还扫描帧速率需要被优化以平衡的图像质量和时间分辨率。如果颗粒移动过快,用于捕获的运动,使用较低的行或帧平均或间隔单位酶扫描速度。我们绘制了流场超过生物膜簇3的垂直位置,并发现生物膜生长增加的流动不均匀性。表征生物膜周围流场允许关键流生物膜的相互作用来加以探讨。例如,这可以被用来评价该调节细胞的流体阻力和剪切过生物 ​​膜,所得生物膜失败装卸从表面1,21的机制。这些过程是很重要的认识上都流动系统( 例如 ,生物结垢)和生物膜形态8调节生物膜的影响。周围生物膜流动条件也控制质量运输,这是很重要的一个广泛生物膜过程。例如,在生物膜表面上的局部流体速度影响通过平流22输送营养物和底物,生物膜。

最后,我们发现使用注射荧光示踪剂的分析生物膜中溶​​质运移模式。我们使用的Cy5这里作为一个保守的示踪剂,这氟似乎常常表现保守的生物膜23。因此,结果应该是代表在生物膜的非反应性的,中性溶质的传输模式。结果表明急剧减小Cy5的浓度的生物膜表面附近,产生在生物膜中的总体流动的浓度仅为〜50%的内部的Cy5的浓度。这种陡峭的浓度分布与氧气,生物膜2,24内的营养物质和抗生素以前报道的测量是一致的。 Cy5的渗透曲线,提供生物膜集群溶质扩散的信息。然而,我们在这里介绍的方法是有限的,分析在横向(XY)平面的2-D溶质运输的生物膜。与较新的快速成像能力,例如旋转盘共焦显微镜,染料渗透,也可以在三维生物膜内可视,WHI通道将允许在垂直输送过程进行调查。此外,荧光示踪剂和颗粒可以注射在一起以获得外部流动条件,并在同一时间内的溶质运输信息。这样的信息是有用的,以区分之间总体流动和生物膜对流和扩散溶质运输,从而评估对在生物膜的内部溶质运输外部流动的影响。

总体而言,我们提出使用提供良好定义的化学梯度为生物膜反应在环境中的化学线索的研究一种新的微流体流动池的详细协议。在生物膜及其周围微生更好地表征的异质性,我们在座的方法,无论周围的生物膜和生物膜的内部溶质运移的流场表征模式。每种方法提供生物膜性质和/或环境条件的独特信息。由于这些方法一体化,对信息的多个方面,可以同时获得。结合信息使研究人员能够接近更复杂的问题。例如,通过使用这些方法,我们成功地分​​析下一个养分梯度在生物膜的生物膜发展和种间的相互作用。这些方法还提供了实验的能力,增加的复杂性,在微生物群落和化学环境,它允许在更真实的环境上的生物膜的过程进行调查。这些方法的潜在应用包括生物膜研究的各个方面,包括生物膜的生命周期,多物种生物膜,生物膜的异质性,在生物膜运输流程,生物膜的流动相互作用。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

我们感谢马特Parsek在华盛顿大学(西雅图)提供P.铜绿假单胞菌E.大肠杆菌菌株和罗杰·诺克斯在坎特伯雷(新西兰)的大学提供访问流软件。这项工作是由卫生部国家过敏研究所全国学院和传染病资助R01AI081983支持。在西北大学的生物成像设备(BIF)进行聚焦成像。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic Pump Gilson Miniplus 3 Flow cell setup and inoculation
Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow Gilson F117934 Flow cell setup and inoculation
Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock Smiths Medical  MX9311L Flow cell setup and inoculation
Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels ML Solar LLC Flow cell setup and inoculation
Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 VWR 16157-191 Flow cell setup and inoculation
C-FLEX Tubing Cole-Parmer 06422-02 Flow cell setup and inoculation
1 ml TB Syringe BD 309659 Flow cell setup and inoculation
Polymer Tubing IDEX 1520G Flow cell setup and inoculation
Sterile Intramedic Luer Stub Adapter Clay Adams 427564 Flow cell setup and inoculation
PrecisionGlide Needle BD 305195 Flow cell setup and inoculation
Spectrophotometer HACH Flow cell setup and inoculation
Syringe filters - sterile (0.2 μm) Fisherbrand 09-719A Flow cell setup and inoculation
MAXQ Shaker Thermo Scientific Flow cell setup and inoculation
Ammonium sulfate Sigma Aldrich A4418 Growth media
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma Aldrich RES20908-A7 Growth media
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P5655 Growth media
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 Growth media
Magnisium chloride Sigma Aldrich M8266 Growth media
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 Growth media
Calcium sulfate dihydrate Sigma Aldrich C3771 Growth media
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 215422 Growth media
Manganese(II) sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634 Growth media
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich 451657 Growth media
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251 Growth media
Cobalt(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich C6768 Growth media
Sodium molybdate Sigma Aldrich 243655 Growth media
Boric acid Sigma Aldrich B6768 Growth media
Dextrose Sigma Aldrich D9434 Growth media
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Growth media
TCS SP2 Confocal Microscopy Leica Fluorescent imaging
SYTO 62 Life Technology S11344 Fluorescent imaging
Cy5 GE Healthcare Life Sciences PA15100 Fluorescent imaging
Red Fluorescent (580/605) FluoSphere Life Technology F-8801 Fluorescent imaging
BioSPA Packman Lab Image Processing
ImageJ NIH Image Processing
Volocity PerkinElmer Image Processing
Streams 2.02 University of Cantebury Image Processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, (2), 95-108 (2004).
  2. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, (3), 199-210 (2008).
  3. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64, (10), 4035-4039 (1998).
  4. Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  5. Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426, (6965), 439-442 (2003).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284, (5418), 1318-1322 (1999).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65, (1), 83-92 (1999).
  9. Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36, (19), 4775-4784 (2002).
  10. Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28, (2), 187-198 (2012).
  11. Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32, (8), 27-33 (1995).
  12. Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44, (5), 636-641 (1994).
  13. Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121, (1), 44-51 (1999).
  14. Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111, (3), 597-607 (2014).
  15. Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62, (5), 1264-1277 (2006).
  16. Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
  17. Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59, (3), 261-272 (1998).
  18. Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2, (6), 680-686 (2000).
  19. Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9, (3-4), 159-168 (1998).
  20. Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43, (11), 1131-1138 (1994).
  21. Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36, (7), 1653-1665 (2002).
  22. Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108, (11), 2571-2582 (2011).
  23. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, (10), 2865-2878 (2013).
  24. Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60, (12), 4339-4344 (1994).
方法表征的共同发展生物膜和生境异质性
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).More

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter