Abstract
Biofilme sind oberflächengebundenen mikrobiellen Gemeinschaften, die komplexe Strukturen aufweisen und signifikante räumliche Heterogenitäten. Biofilm Entwicklung wird stark von der umgebenden Strömung und Ernährungsumwelt geregelt. Biofilmwachstum steigt auch die Heterogenität der lokalen Mikroumgebung durch die Generierung komplexer Strömungsfelder und Stofftransport Mustern. Um die Entwicklung von Heterogenität in Biofilmen und Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihre lokalen Mikrolebensraum zu untersuchen, wuchsen wir Mono-Arten Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Zwei-Spezies-Biofilmen von P. aeruginosa und Escherichia coli unter Ernährungs Gradienten in einer mikrofluidischen Flusszelle. Wir stellen ausführliche Protokolle für die Erstellung von Nährstoff Gradienten innerhalb der Flusszelle und zum Züchten und Visualisierung Biofilmentwicklung unter diesen Bedingungen. Wir weisen das Protokolle für eine Reihe von optischen Verfahren, um räumliche Muster in Biofilmstruktur Quantifizierung fließen distriträge über Biofilme und Massentransport um und in Biofilmkolonien. Diese Methoden unterstützen umfassende Untersuchungen der Co-Entwicklung von Biofilm und Habitatheterogenität.
Introduction
Mikroorganismen auf Oberflächen befestigen und bilden Biofilme - Zellaggregate in einer extrazellulären-Polymermatrix 1 umschlossen. Biofilme ganz anders verhalten als einzelne mikrobielle Zellen, da Biofilme dramatische räumliche Heterogenität aus einer Kombination von internen Stofftransportbeschränkungen und räumlichen Veränderungen im Zellstoffwechsel 2,3 resultiert. Sauerstoff und Nährstoffkonzentration drastisch an der Grenzfläche zwischen den Biofilm und die umgebende Flüssigkeit und innerhalb der Biofilm-2 weiter abgereichert erhalten verringern. Räumliche Variationen Biofilm Atmung und Proteinsynthese kann auch als Reaktion auf die lokalisierten Sauerstoff und Nährstoffverfügbarkeit 2 auftreten.
In Gewässern und Boden-Umgebungen, wohnen die meisten Bakterien in Biofilmen. Natürliche Biofilme die wichtigen biogeochemische Prozesse wie Radfahren Kohlenstoff und Stickstoff und reduzierende Metalle 4,5. Klinisch ist die Bildung von Biofilmen responsIVK längere Lungen- und Harnwegsinfektionen 6. Biofilm-assoziierten Infektionen sind sehr problematisch, weil Zellen in Biofilmen im Vergleich zu ihren Pendants Plankton 6 haben extrem hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da Biofilme sind in verschiedenen Einstellungen wichtig, ist ein wesentlicher Teil der Forschung auf das Verständnis der Umweltfaktoren, die Biofilm-Aktivitäten und die räumliche Heterogenität in Biofilmen und die umliegende Mikroumgebung steuern konzentriert.
Frühere Studien haben festgestellt, dass Biofilmentwicklung wird stark durch eine Reihe von Umweltfaktoren reguliert: Biofilme entwickeln unterschiedliche Morphologien unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen; Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit Einfluss Biofilm Morphologie; und hydrodynamische Schubspannung wirkt sich auf die Befestigung der planktonischen Zellen auf Oberflächen und die Ablösung von Zellen von Biofilmen 7-9. Darüber hinaus beeinflusst externen Strömungsbedingungen die Lieferung von Substraten into und in Biofilmen 10. Das Wachstum von Biofilmen verändert auch umgebenden physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispielsweise führt das Biofilmwachstum zu lokalen Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, 2; Biofilme akkumulieren anorganischen und organischen Verbindungen aus der Umgebung 11; und Biofilm Cluster umleiten Flusses und Erhöhung der Oberflächenreibung 12,13. Da Biofilme interagieren mit ihrer Umgebung auf sehr komplexe Weise, ist es entscheidend, um gleichzeitig Informationen über die Biofilmeigenschaften und Umgebungsbedingungen, und multidisziplinäre Ansätze müssen verwendet werden, um umfassend zu charakterisieren Biofilm-Umwelt-Interaktionen werden.
Hier stellen wir eine Reihe von integrierten Methoden räumliche Muster in mikrobiellen Wachstums innerhalb mono-Arten und Zwei-Spezies Biofilmen unter einem auferlegten Nahrungs Gradienten zu charakterisieren, und die resultierende Änderung der lokalen chemischen und Flüssigkeitsmikroumgebung zu beobachten. Wir Tannest beschreiben die Verwendung eines kürzlich entwickelten Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle, um die Biofilmwachstum unter definierten chemischen Gradienten zu beobachten. Dann zeigen die Verwendung dieser Mikrofluid-Durchflusszelle, um das Wachstum von zwei Arten von Bakterien, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, in Biofilmen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beobachten. Wir zeigen, wie in situ Visualisierung von fluoreszierenden Tracers Ausbreitung in Biofilmkolonien verwendet werden, um quantitativ zu erfassen Muster der Stofftransport in Biofilmen werden. Schließlich zeigen wir, wie Mikropartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie durchgeführt wird, kann zur lokalen Strömungsfeld um den wachsenden Biofilmen zu erhalten.
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Protocol
1. Durchflusszelle einrichten und Inokulation
. HINWEIS: Verwenden Sie ein im Song et al Doppeleinlass mikrofluidischen Durchflusszelle, 2014 14, Biofilme wachsen. Diese Durchflusszelle ist in der Lage, gut definierte glatte chemische Gradienten erstellen. Die Durchflusszelle ist in Abbildung 1 unter Verwendung von P. gezeigt und Durchflusszellenherstellung wurde zuvor in Song et al., 2014 14. Hier werden wir ausführlich unsere Methoden aeruginosa und E. coli, Biofilme zu bilden, aber andere Arten können geeignet zu sein. Wir verwendeten P. aeruginosa PAO1- gfp, die konstitutiv exprimiert ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), als Modellorganismus für die Biofilmentwicklung. E. Zusätzlich verwendeten wir coli DH5a zu Mischarten Biofilmen mit P. bilden aeruginosa. P. aeruginosa und E. coli-Stämme wurden auf LB-Agar-Platten gezüchtet.
- Bereiten Sie die Durchflusszelle mit Polydimethylsiloxan (PDMS) gebunden an einDeckglas über Sauerstoffplasmabehandlung, wie in 14 beschrieben. Die Abmessungen der Strömungszellenkammer sind 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (Länge x Breite x Tiefe).
- Bereiten geändert FAB Wachstumsmedium 15. Um Biofilmwachstum unter einer Nahrungsgefälle innerhalb der Durchflusszelle zu beobachten, stellen modifizierte FAB Medium 15 mit 0,6 uM Glucose in einem Einlass und FAB Medium einzuführen ohne Kohlenstoffquelle durch die andere Einlass. Filter sterilisieren (Porengröße = 0,2 um) der Glucosestammlösung (60 mM), bevor Sie die Ware in den FAB Medium. Auch Autoklavieren den FAB-Medium mit dem Zyklus 1 (Flüssigkeit, 15 min, 121 ° C, 17 psi) vor dem Gebrauch.
- Sterilisieren Sie die Durchflusssystem. Vor der Beimpfung autoklaviert den gesamten Strömungsweg (mittel Flaschen, Schläuche, Luftblasenfallen, Durchflusszellen) mit Zyklus 1, mit Ausnahme der Kunststoffdreiwegeventile (Einweg- und vorsterilisiert) stromaufwärts von der Strömungszelle angeordnet ist. (Drei-Wege Ventile zum Einspritzen Zelle c verwendet,ultur, fluoreszierender Tracer und Mikrokügelchen.) Um eine Kontamination während der Montage zu vermeiden, decken alle Schläuche und Anschlussöffnungen mit Aluminiumfolie oder Autoklav Beutel vor dem Autoklavieren.
- Schließen Sie das Stromsystem. Montieren Sie die Komponenten des Durchflusszellensystem sorgfältig (siehe Video zum Flusssystem Montage) und liefern Wachstumsmedium, um die Durchflusszelle über eine peristaltische Pumpe, die exakt den Durchfluss steuert.
- Vorbereitung der Zellkultur zur Beimpfung durch Übertragen einer Kolonie von P. aeruginosa oder E. coli von LB-Platten zu 3 ml LB-Brühe, und schütteln Sie die Kultur O / N bei 225 rpm und 37 ° C. Verdünne die O / N-Zellkulturen in 1 ml sterilisiertem Wasser auf eine endgültige OD 600 = 0,01 als Inokulum. (Kultur und verdünnen die Bakterien in einer Steril um Verunreinigungen zu vermeiden.)
- Für die Versuche mit gemischten Spezies Biofilmen, verdünnt den zwei Bakterienkulturen mit einem Verhältnis von 1: 1 in 1 ml mit einer äquivalenten OD 600 = 0,01 für jedes Bakterium.
- Impfen Sie die Durchflusszelle. Injizieren 1 ml des Inokulums zu der Strömungszelleneingang von dem Dreiwegeventil. Nach der Injektion unterbrechen den Fluss für 1 Stunde, damit der Bakterienzelle an das Deckglas zu befestigen. (Stellen Sie sicher, dass die Durchflusszelle mit der Deckseite nach unten, damit suspendierten Zellen, um auf dem Deckglas absetzen gestellt.)
- Nach 1 Stunde wieder die Strömung und die Pumpe des Wachstumsmediums, um die Durchflusszelle mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,03 ml / min für jeden Einlaß für 3 Tage.
2. Charakterisierung von Biofilm-Entwicklung in Reaktion auf Nährstofffarbverläufe Mit konfokale Mikroskopie
HINWEIS: P. aeruginosa mit konstitutiv exprimierten GFP abgebildet werden, aber E. coli in Mischarten Biofilme müssen durch Gegenfärbung abgebildet werden.
- Beachten Sie die 3-Tages-Biofilmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Für die repräsentative Ergebnisse, beachten Biofilmen mit einem konfokalen Mikroskop mit 63X Ziel. Vor der Bildgebung, Markedas Doppel-Einlassströmungszelle mit einem Raster auf dem Deckglas Seite. (Der Zweck dieser Gitter ist es, dass der Experimentator die Abbildungsbereiche in dem Strömungszellenkammer zu lokalisieren.)
- Zur Gegenfärbung, verdünnte 10 ul zelldurchdringenden rot fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, wie grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff wie STYO 62 Stammlösung (1 mM) in 990 ul sterilisiertes Wasser und dann langsam zu injizieren die verdünnte Fleck mit einer Spritze in die Durchflusszelle Kammer von dem stromaufwärts Dreiwegeventil. Halten Sie die Durchflusszelle stagniert und im Dunkeln für 30 Minuten, dann wieder den Fluss für 15 Minuten Auswaschen der ungebundenen Fleck.
- Führen konfokale Bildgebung. Aktivieren Sie die 488-nm-Argon-Laser für die Anregung und die Emission Sammelkanäle für GFP (500-535 nm) und Nukleinsäurefarbstoff (für grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, 650 bis 750 nm). Passen Gewinne und Offsets für beide Kanäle zu hell und sauber Bilder haben. Wählen xyz und gleichzeitige Bildgebungsmodus. Verwenden Sie die z-Drehknopf auf idenfizieren die Unterseite und die Oberseite der Biofilm auf dem Feld. Stellen Sie die z-Schritt von 0,5 & mgr; m zur Erfassung eines 3-D-Bildstapel. (Um eine hohe Bildqualität zu gewährleisten, verwenden Sie eine Linie durchschnittlich vier für die Bildaufnahme.)
- Um die räumlichen Muster der Biofilmentwicklung innerhalb der Flusszelle, Bild Biofilmen an drei oder mehr Längs Karte (x) Abständen entlang der Strömungszelleneingang und an drei Querrichtung (y) positioniert relativ zu dem auferlegten Nahrungs Gradienten, wie in Figur 1 gezeigt, .
3. Charakterisierung Interne Stofftransport durch Injektionen von Conservative Fluoreszierende Tracer
HINWEIS: Eine konservative fluoreszierender Tracer, wie Cy5, kann verwendet werden, um Stofftransportmuster innerhalb des Biofilms zu charakterisieren.
- Löse Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml als Stammlösung. Bewahren Sie die Cy5-Stammlösung in einem -20 ° C Tiefkühltruhe.
HINWEIS: Wie Cy5 ist licht sensitive, speichern, zu verdünnen und injizieren Cy5-Lösungen in der Dunkelheit. - Vor der Injektion des fluoreszierenden Tracers, nehmen Sie ein 3-D-Bildstapel der 3-Tages-Biofilm mit der konfokalen Mikroskopie (mit einem 63X Objektiv). (Wide Regionen Biofilm Kolonien sind ideal für Zeitreihen Beobachtungen der Farbstofftransport.) Wählen, auch die Z-Ebene mit gut getrennte Kolonien zur Bildgebung (wie in 5A gezeigt).
- Für jede Injektion Cy5 Experiment verdünnen 2 ul des Cy5-Stammlösung in 998 & mgr; l sterilisiertem Wasser, um eine Injektionslösung mit einem Cy5-Konzentration von 20 ug / ml zu ergeben.
- Stoppen der Pumpe, um den Fluß anzuhalten, und spritzen die Cy5-Lösung in die stromaufwärts von der Durchflusszelle mit einer Spritze über das 3-Wege-Ventil. (Es ist wichtig, Luftblasen in die Strömungsbahn während der Injektion zu verhindern. Blasenfallen sollten während des Hinterspritz offen gehalten werden.)
- Nach dem Einspritzen des Cy5-Lösung, schließen Sie die Blasenfallen, stellen Sie die 3-Wege-Ventil, und starten Sie diezu pumpen, um den eingespritzten Cy5-Lösung in die Durchflusszelle zu liefern.
- Schalten konfokalen Abbildungsmodus zu XYT. Aktivieren Cy5 und GFP-Kanälen unter gleichzeitiger Bildmodus. Passen konfokalen Einstellungen auf Cy5 Intensität (Laserintensität, Gain und Offset), um zu vermeiden Sättigung Signale, die von entscheidender Bedeutung für die Quantifizierung. (Hohe zeitliche Auflösung zur Visualisierung Farbeindringprüfung bevorzugt. Allerdings nimmt schnelle Scan-Bildqualität.) Wählen Sie die richtige Scan-Geschwindigkeit und Rauh um die Zeitauflösung der Bildverarbeitung und der Bildqualität auszugleichen. Aus diesem Protokoll eine Linie durchschnittlich vier und eine Bildrate von 0,15 Hz.
- Fortsetzen der Strömung zu Cy5 in die Durchflußzelle (noch bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,03 ml / min) zu liefern. Gleichzeitig beginnen Zeitreihen konfokale Bildgebung.
- Quantifizieren Cy5 Eindringen von radial durchschnittlich Cy5 Intensität innerhalb eines 2-D-Kreisbiofilmkolonie. Zu mitteln, zuerst den Rand eines Biofilms Cluster zu identifizieren, dann ein Abstandskarte für ein 2-D-Teil des ClustersUnd schließlich durchschnittlichen radialen Muster von Cy5 Intensitäten einen Durchdringungskurve (siehe Figur 6) zu erzeugen.
- Um rechen realisieren Schritt 3.8, verwenden BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) Software-Paket (unveröffentlicht, Softwarepaket und Hand auf Anfrage erhältlich) oder andere Bildanalyseprogramme.
- Um BioSPA verwenden, zuerst ein Bild in BioSPA gesetzt importieren. Wählen Sie dann die richtige Schwelle für GFP und Cy5 Kanäle binäre Bilder zu machen. Bei der Analyse / Berechnung Menü wählen Sie Advanced Analysis und Diffusion Analyse. Verwenden Sie das GFP-Kanal an den Rand eines Clusters definieren und das Polygon-Werkzeug, um einen Cluster als Region of Interest (ROI) zu wählen.
- Doppelklicken Sie auf das ausgewählte Biofilm-Cluster, um eine Diffusion Analyse durchzuführen. Speichern Sie die Diffusionsanalyseergebnisse und kalibrieren Cy5 Intensität Cy5 Konzentration anhand einer Eichkurve.
- Um Cy5 Konzentration Eichkurve zu erzeugen, messen Cy5 Intensitäten über einen Cy5 concentration Gradienten unter der konfokalen Mikroskopie. (Cy5 Intensität und Konzentration haben eine lineare Beziehung.)
4. Charakterisierung der Umgebung Fluss Feld von Tracking-Fluorescent Particles
HINWEIS: Fluoreszierende Teilchen, wie fluoreszierende Mikroperlen verwendet werden, um das Strömungsfeld herum Biofilmen zu charakterisieren. Strömungsfeld um Biofilme aus den Zeitreihenbeobachtungen Partikelpositionen mit Particle Tracking Velocimetry Software berechnet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit dem Streams 2.02 Softwarepaket 16 (Software-Download und Benutzerhandbuch finden Sie unter erhalten http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Verdünne die fluoreszierenden Mikrokügelchen (Durchmesser ca. 1 & mgr; m) in sterilisiertem Wasser auf ein Feststoffkonzentration von 0,2% und einem Endvolumen von 0,5 ml. Vortex, um sicherzustellen, dass die Mikroperlensind gut verteilt.
- Einzuspritzen und den gewünschten verdünnt fluoreszierenden Mikroperlen in die Durchflußzelle folgenden Verfahren aus den Schritten 3.3 bis 3.5. Damit eine genaue Überwachung der Partikelbahn, mit einem relativ niedrigen Flussrate (0,01 ml / h für die Partikelverfolgung Ergebnisse in diesem Dokument).
- Schalten konfokalen Einstellungen XYT Modus, um Partikelbewegung an einem z-Scheibe zu verfolgen und nehmen Sie Zeitreihen-Bildern. Wiederholen Partikelinjektion und Bild an verschiedenen Stellen Z (A Frame-Rate von 1 Hz wurde für die in dieser Veröffentlichung gezeigten repräsentativen Ergebnissen verwendet.), Um 3-D-Strömungsfeld zu erzeugen.
- Pre-Prozess die Zeitreihen konfokale Bilder durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz Signal (das Signal in der ersten aufgenommenen Bildes der Bildsatz) mit ImageJ (Software-Download und Anleitung auf http://imagej.nih.gov/ij/ ) oder andere Programme.
- In ImageJ, öffnen Sie das erste Bild einer Bildsatz und importieren Sie die Bildmenge. Unter Prozess / Bild Calculator subtrahieren Sie das erste Bild aus dem Bild Set. Speichern Sie die vorverarbeiteten Bildmenge.
- Zur Berechnung der Strömungsvektoren, Import Zeitreihen konfokalen Bildern in Streams 2,02. Unter "Open Prozesssicht", wählen Sie und führen Sie "Identifizieren Partikel". Verwenden Sie die richtige Schwelle, um Partikel zu identifizieren. Verwenden Sie 0,5 und 5 & mgr; m als Mindest- und Höchstdurchmesser Schwellenwerte für 1 & mgr; m-Partikel.
- Dann unter "Open Prozesssicht", wählen Sie und führen Sie "PTV Analyse-Pipeline", um Partikelbahnen zu generieren. Überprüfen Sie die Partikelbahnen zu sehen, ob sie Partikelbewegung darstellen. Schließlich wählen Sie und führen Sie "Neues Geschwindigkeitsfeld", um einen Fluss Vektorkarte zu generieren.
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Representative Results
Der Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle ermöglicht die Beobachtung von Biofilmwachstum unter einer gut definierten chemischen Gradienten durch Mischen von zwei Lösungen innerhalb der Durchflusskammer gebildet. Die sich ergebende chemische Gradienten wurde früher von Farbstoff Injektion beobachtet und detailliert charakterisiert von Song et al. 14. Glatten Konzentrationsgradienten wurden in der Querrichtung ausgebildet sind, wie in 1 gezeigt. Das Konzentrationsprofil war steil nahe dem Einlass und wurde stromabwärts durch Diffusion (Figur 1) entspannt. Biofilmentwicklung unter ernährungs Gradienten beobachten, verwendeten wir einen definierten Minimalwachstumsmedium (FAB-Medium) mit Glucose nur ein Einlass als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt. Dies ergab eine Glucose-Gradienten in der Strömungszellenkammer, während alle anderen Nährstoffe wurden homogen verteilt. Das Wachstum von P. aeruginosa PAO1 Biofilme wurde stark an die lokale Verabreichung von Glucose (2) korreliert.Da der Quer Glucose Konzentrationsgradienten nahe dem Einlaß war steil zeigte die Biofilm Biomasse eine dramatische Abnahme von hohem Glucosebereich zum niedrigem Glucose Region. Da der Quer Glucose Gradienten abwärts entspannt wurde der Biofilm Biomasse homogener. Wir Verwendung dieser Durchflusszelle, um die Wechselwirkungen von P. studieren weiter gezeigt, aeruginosa und E. coli in Biofilmen unter Glucose-Gradienten (Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden Arten zeigten deutliche räumliche Muster des Wachstums in Bezug auf die Ernährungs Gradienten und damit unterschiedliche ökologische Nischen besetzt: P. aeruginosa Biofilm dominiert Biomasse in Regionen mit hohen Glucosekonzentrationen und E. coli dominierten Regionen mit niedrigem Glucosekonzentrationen (Abbildung 3).
Um die Rückkopplung zwischen Biofilmwachstum und die umliegende Fluss Umwelt zu verstehen, sind wir für das Strömungsfeld um wachsenden Bio-Filme von Leuchtstoffpartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie. Die beobachtete Bewegung der fluoreszierenden Mikroperlen injiziert wird in Film gezeigt 1. Lokale Strömungsvektor Informationen wurden von durchschnittlich mindestens 4.200 diskrete Messungen der Partikelgeschwindigkeiten mit dem Streams-Software-Paket extrahiert. Die dreidimensionale Abbildung des Strömungsfeldes bestimmt wurde, indem Teilchen in mehreren vertikalen Stellungen (Figur 4) erhalten. Biofilmwachstum deutlich erhöht Flußheterogenität (Abbildung 4). Durchfluss in der Nähe von Biofilm Basis um Biofilm-Cluster umgeleitet, was zu einer erhöhten Heterogenität und verringerte Geschwindigkeit (Abbildung 4). Durchfluss bei Biofilm oben hat eine höhere Geschwindigkeit und homogener ist (Abbildung 4).
Um den internen Heterogenität durch begrenzte Stofftransport in Biofilmen verursacht zu verstehen, beobachteten wir den Transport von Cy5 in Biofilmen durch konfokale Mikroskopie. Eindringen ZeitreihenCy5 in einem Biofilm-Cluster in Film 2. Der Zeitreihen Cy5 Durchdringungskurven gezeigt in Film 3. Der effektive Diffusionskoeffizient von Cy5 in Biofilmen gezeigt wurde, indem eine 1-D-Diffusionsmodell an die Cy5 Konzentrationsprofile berechnet:
wobei C der radial gemittelten Cy5-Konzentration von der Fluoreszenzintensität berechnet, und ist der Abstand in den Biofilm 17. Cy5 zeigte die höchste Konzentration in der Massenströmung und verringerten steil bei Eintritt in den Biofilm (Abbildung 5).
Abbildung 1. Doppelklicken Einlass mikrofluidischen Durchflusszelle. Glatte Glucose Gradienten wurden innerhalb der Strömungskammer durch Einführen FAB Medium zu den zwei Einlässen mit einer Kohlenstoffquelle erzeugt (gluco SE) nur in einer Eintritts. resultierenden Muster von Glucose innerhalb der Strömungszelle werden durch Schattierung angezeigt. Dunkle Schattierung stellt höhere Glukosekonzentrationen. Konfokale Bildgebung wurde an neun Stellen in der Durchflusszelle durchgeführt wird. Ergebnisse in den 2 und 3 beziehen sich auf die nummerierten Positionen 1-9 in der Abbildung. Diese Zahl wird nach dem Song et al modifiziert. (2014), Abb. 1. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. PAO1 Biofilmwachstum unter Glukose Steigungen. 3-Tages-PAO1 Biofilme wurden an den neun Standorten in Abbildung 1 abgebildet. Rasterabstand = 18 & mgr; m für Bild 1-8 und 24 um für Bild 9.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Die Entwicklung von P. aeruginosa und E. coli Zwei-Spezies-Biofilmen unter Glukose Steigungen. P. aeruginosa konstitutiv exprimiert GFP und die Biofilme wurden auch von SYTO 62, die eine allgemeine Nukleinsäurefarbstoff ist gegengefärbt. Bilder hier gezeigten sind Überlagerungen von GFP (grün) und SYTO 62 (rot) Kanäle. P. aeruginosa scheint daher, grün oder gelb (grün + rot) und E. coli erscheint rot. Maßstabsbalken = 47 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Durchflussgeschwindigkeitsvektorfelder bei z = 4, 10 und 16 um um einen Biofilm Cluster. Die Länge des Pfeils stellt den Betrag der Geschwindigkeit. Niedrige Fließgeschwindigkeit zeigt an Biofilm Basis (z = 4, blaue Pfeile). Flow ist homogener in der Nähe von Biofilm oben (z = 16, rote Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Cy5 Eindringen in Biofilmen. (A) Die konfokale mikroskopische Aufnahme bei z = 18 um, die teilweise Durchdringung von Cy5 in Biofilm-Cluster bei t = 190 sec. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. (B) Die resultierenden Muster der Cy5 Konzentration Karte. (C) Cy5 Konzentrationsprofil in einem Biofilm-Cluster. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Verfahren ein Cy5 Einbrandprofil zu erzeugen. Links: Ausgewählte ROI, die ein 2-D-Biofilm-Cluster. Mitte: Entfernung Karte des Biofilms Cluster. Rechts: Radial gemittelten Cy5 Intensitätsprofil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Film 1 : Bewegung des eingespritzten fluoreszierenden Partikeln um Biofilm-Cluster (konfokale Video).
Movie 2 : Ausbreitung von Cy5 in Biofilm-Cluster (konfokale Video).
_content "> Movie 3 : Ausbreitung von Cy5 in Biofilm-Cluster (Konzentrationsprofile Video).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben gezeigt, eine Reihe von Methoden, um drei wichtige Biofilm-Umwelt-Interaktionen zu charakterisieren: Biofilm Reaktion auf chemische Gradienten, Auswirkungen von Biofilmwachstum auf die umliegende Flussmikroumgebung und Biofilm Heterogenität von internen Transportbeschränkungen resultieren.
Wir haben gezeigt, zuerst die Verwendung eines neuartigen Mikrofluid-Durchflusszelle, um eine gut definierte chemische Gradient für Biofilmentwicklung verhängen. Um eine gut definierte chemische Gradienten innerhalb der Flusszelle zu erzeugen, ist es wichtig, den gleichen Flussrate für beide Öffnungen zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Schlauchpumpe ist gut für beide Strömungskanäle, die wachsen Medium mit der gleichen Geschwindigkeit zu liefern angepasst. Stellen Sie außerdem sicher, dass keine Verstopfung im Strömungspfad während Biofilmwachstum. Beobachtungen des Wachstums von Zwei-Spezies Biofilmen in dieser Durchflusszelle zeigen, daß chemische Gradienten Biofilmwachstum und Interspezies-Interaktionen in Biofilmen stark beeinflusst. Chemische Gradienten sind gemeinsamUmgebungen, in denen sich Biofilme, aufgrund einer Kombination von Transportlimitierungen, chemische Bindung und Reaktion, sowie mikrobielle Aufnahme und Metabolismus 18-20. Diese mikrofluidischen Durchflusszelle ermöglicht Untersuchungen verschiedener Biofilm-Aktivitäten unter einem definierten Bereich der chemischen Bedingungen in einem einzigen Gerät. Beispielsweise hat sich diese Strömungszelle nachgewiesen, die für die Untersuchung der Biofilm Töten unter einem antimikrobiellen Gradient 14 zu sein.
Wir haben dann gezeigt, die Verwendung von Particle Tracking Velocimetry, um die Strömungsfeld um Biofilm-Clustern zu beobachten. Um eine genaue Überwachung der injizierten fluoreszierenden Teilchen zu gewährleisten, dass die Strömungsrate zu optimieren. Normalerweise können geringer Strömungsgeschwindigkeit der Bewegung von Teilchen in der konfokalen Sichtfeld erfasst werden. Auch das Scannen Bildrate muss optimiert werden, um die Bildqualität und Zeitauflösung auszugleichen. Wenn die Teilchen zu schnell für die Erfassung der Bewegung zu verschieben, verwenden untere Zeile oder Rahmen durchschnittliche oder increase Scangeschwindigkeit. Wir kartiert das Strömungsfeld an drei vertikalen Positionen über einen Biofilm-Cluster, und fanden, dass das Biofilmwachstum erhöhte die Flußheterogenität. Charakterisierung des Strömungsfeld um Biofilme können Schlüsselstrom-Biofilm-Interaktionen untersucht werden. Zum Beispiel kann dies verwendet werden, um Mechanismen, die den Strömungswiderstand und Scher über den Biofilm und die resultierende Biofilm Versagen und Ablösung von Zellen von der Oberfläche 1,21 regulieren auszuwerten. Diese Verfahren sind wichtig für das Verständnis sowohl die Effekte von Biofilmen auf Strömungssystemen (zB Biofouling) und Regelung der Biofilm Morphologie 8. Umströmung Biofilm auch den Massentransport, die wichtig für eine breite Palette von Biofilmverfahren ist. Zum Beispiel kann die lokale Fluidgeschwindigkeit an der Biofilmoberfläche beeinflusst die Lieferung von Nährstoffen und Substrate, Biofilme durch Advektion 22.
Schließlich zeigten wir den Einsatz von Injektion fluoreszierende Tracer zu analysierenStofftransport Muster innerhalb des Biofilms. Wir haben hier Cy5 als konservativer Tracer, und das Fluor scheint oft konservativ verhalten sich in Biofilmen 23. Daher sollten die Ergebnisse repräsentativ für die Transportmuster nicht-reaktiven, neutral gelösten Stoffe in Biofilmen zu sein. Die Ergebnisse zeigten eine steile Abnahme der Cy5 Konzentration nahe der Biofilmoberfläche, wodurch ein Cy5-Konzentration im Inneren der Biofilm nur ~ 50% der in dem Massenstrom. Solche steile Konzentrationsprofile sind konsistent mit zuvor berichteten Messungen von Sauerstoff, Nährstoffen und antimikrobiellen Mitteln in Biofilmen 2,24. Cy5 Durchdringungskurven Informationen über gelösten Biofilm Diffusion in Clustern. Jedoch ist die Methode, die wir hier gegenwärtig auf 2-D-Stofftransport in horizontalen (xy) Ebenen in Biofilmen analysieren. Bei neueren schnell Imaging-Fähigkeit, zum Beispiel Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie, Durchfärbung kann auch in 3-D in Biofilmen visualisiert, which eine Untersuchung auf vertikale Transportprozesse ermöglichen. Weiterhin können fluoreszierende Tracer und Teilchen miteinander injiziert werden, um Daten von externen Strömungsbedingungen und inneren Stofftransport bei gleichzeitig erhalten. Solche Informationen sind nützlich, um advektiven und diffusive Stofftransport zwischen den Schüttstrom und Biofilme zu unterscheiden und um die Wirkung der Außenströmung auf der internen Stofftransport in Biofilmen zu bewerten.
Insgesamt stellen wir ausführliche Protokolle der Verwendung eines neuen mikrofluidischen Flusszelle, die gut definierte chemische Gradienten für die Untersuchung der Biofilm Reaktionen auf chemische Signale in der Umgebung bietet. Um besser zu charakterisieren Heterogenität in Biofilmen und der sie umgebenden Mikrohabitat, hier präsentieren wir Methoden, um Muster in beiden Strömungsfeld umgebenden Biofilmen und innere Stofftransport innerhalb von Biofilmen zu charakterisieren. Jede Methode bietet unverwechselbare Informationen zu Biofilmeigenschaften und / oder Umgebungsbedingungen. Da diese Verfahrenintegriert sind, können mehrere Aspekte der Informations gleichzeitig erhalten werden. Kombinierte Informationen ermöglicht es Forschern, komplexere Probleme anzugehen. Zum Beispiel kann durch Verwendung dieser Verfahren, die wir erfolgreich analysiert Biofilmentwicklung und Interspezies-Interaktionen in Biofilmen unter Nährstoff Gradienten. Diese Methoden stellen auch experimentelle Möglichkeit, die Komplexität in der mikrobiellen Gemeinschaft und die chemische Umgebung, die Untersuchungen an Biofilmverfahren in einer realistischeren Kontext ermöglicht erhöhen. Mögliche Anwendungen dieser Methoden decken verschiedene Aspekte der Biofilm-Forschung, einschließlich der Biofilm-Lebenszyklus, Multispezies Biofilme Biofilm Heterogenität, Transportprozesse in Biofilmen und Biofilm-flow Spiel.
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Acknowledgments
Wir danken Matt Parsek an der University of Washington (Seattle, WA) zur Bereitstellung von P. aeruginosa und E. coli-Stämme und Roger Nokes an der University of Canterbury (Neuseeland) für den Zugriff auf Streams Software. Diese Arbeit wurde durch Zuschuss R01AI081983 von den National Institutes of Health, Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Konfokale Bildgebung wurde an der Northwestern Biological Imaging Facility (BIF) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
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