Abstract
Biofilmer är utanpå bifogade mikrobiella samhällen som har komplexa strukturer och producerar betydande rumsliga heterogeniteter. Biofilm utveckling är starkt reglerad av omgivande flödet och näringsmiljö. Biofilm tillväxt ökar också heterogenitet den lokala mikromiljön genom att generera komplexa flödesfält och lösta ämnen transportmönster. För att undersöka utvecklingen av heterogenitet i biofilmer och interaktioner mellan biofilmer och deras lokala mikro livsmiljö, växte vi mono-arter biofilmer av Pseudomonas aeruginosa och dual-arter biofilmer av P. aeruginosa och Escherichia coli enligt närings gradienter i ett mikroflödesflödescell. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att skapa närings gradienter inom flödescellen och för att odla och visualisera biofilm utveckling under dessa förhållanden. Vi har även aktuella protokoll för en serie av optiska metoder för att kvantifiera rumsliga mönster i biofilm struktur, flödes distribubutions över biofilmer och masstransport runt och inom biofilm kolonier. Dessa metoder stödjer omfattande undersökningar av gemensam utveckling av biofilm och livsmiljö heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer fäster ytor och bilda biofilmer - cellaggregat inneslutna i en extracellulär-polymermatris 1. Biofilmer beter väldigt annorlunda från enskilda mikrobiella celler, eftersom biofilmer har dramatiska rumslig heterogenitet följd av en kombination av interna begränsningar löst ämne transport- och rumsliga variationer i cellulär metabolism 2,3. Syre och näringskoncentrationer drastiskt minska i gränssnittet mellan biofilm och omgivande vätska och få utarmat ytterligare inom i biofilmen 2. Rumsliga variationer i biofilm andning och proteinsyntes kan också uppstå som en reaktion på lokal syre och näringsämnen tillgänglighet 2.
I akvatiska och markmiljöer, de flesta bakterier bo i biofilmer. Naturliga biofilmer utför viktiga biogeokemiska processer inklusive cykling kol och kväve och minska metaller 4,5. Kliniskt är biofilmbildning responsosynligt för långvarig pulmonell och urininfektioner 6. Biofilmrelaterade infektioner är mycket problematiskt eftersom celler i biofilmer har extremt hög motståndskraft mot antibiotika jämfört med deras plankton motsvarigheter 6. Eftersom biofilmer är viktiga i olika miljöer, har en betydande mängd forskning varit inriktad på att förstå de miljöfaktorer som styr biofilmaktiviteter och den rumsliga heterogenitet i biofilmer och omgivande mikromiljö.
Tidigare studier har visat att biofilm utvecklingen är starkt reglerat av ett antal miljöfaktorer: biofilmer utveckla olika morfologier under olika flödesförhållanden; syre och näringsämnen tillgänglighet inflytande biofilmen morfologi; och hydrodynamiska skjuvspänning påverkar fastsättning av planktonceller till ytor och avskiljandet av celler från biofilmer 7-9. Dessutom påverkar extern flödestillstånd leverans av substrat into och inom biofilmer 10. Tillväxten av biofilmer förändrar också omgivande fysiska och kemiska förhållanden. Till exempel leder biofilmtillväxten till lokal utarmning av syre och näringsämnen 2; biofilmer ackumuleras oorganiska och organiska föreningar från den omgivande miljön 11; och biofilm kluster avleda flöde och ökad friktion 12,13. Eftersom biofilmer samspelar med sin omgivning i mycket komplexa sätt, är det viktigt att samtidigt få information om biofilm egenskaper och miljöförhållanden, och tvärvetenskapliga metoder måste användas för att utförligt karaktärisera interaktioner biofilm-miljö.
Här presenterar vi en rad integrerade metoder för att karakterisera rumsliga mönster i mikrobiell tillväxt inom mono arter och biofilmer dubbla arter under en införde närings lutning, och att notera vilken modifiering av lokala kemiska och vätskemikromiljö. Vi first beskriver användningen av ett nyligen utvecklat dubbelinlopp mikroflödesflödescell för att observera biofilm tillväxt under väl definierade kemiska gradienter. Vi visar sedan användningen av denna mikroflödesflödescell för att observera tillväxt av två arter av bakterier, Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli, i biofilmer under vitt skilda näringsmässiga förhållanden. Vi visar hur in situ visualisering av fluorescerande spårämne förökning i biofilm kolonier kan användas för att kvantitativt bedöma mönster transport av lösta ämnen i biofilmer. Slutligen visar vi hur mikropartikelspårning Velocimetry, utförs under konfokalmikroskopi, kan användas för att få lokal flödesfält runt de växande biofilmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flödescellformat och Ympning
OBS:. Använd en dubbelinlopp mikroflödesflödescell beskrivs i Song et al, 2014 14 att växa biofilmer. Denna flödescell kan skapa väldefinierade släta kemiska gradienter. Flödescellen konstruktion visas i figur 1 och flödescelltillverkning har tidigare beskrivits i Song et al., 2014 14. Här har vi detalj våra metoder genom att använda P. aeruginosa och E. coli att bilda biofilmer, men andra arter kan vara lämpliga för. Vi använde P. aeruginosa PAO1- GFP, som konstitutivt uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP), som modellorganism för biofilm utveckling. Dessutom använde vi E. coli DH5a att bilda blandad arter biofilmer med P. aeruginosa. P. aeruginosa och E. coli-stammar odlades på LB-agarplattor.
- Förbered flödescell med användning av polydimetylsiloxan (PDMS) bunden till entäckglas via syrgasplasmabehandling som beskrivs i 14. Måtten på flödescellen kammaren är 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (längd x bredd x djup).
- Förbered modifierat FAB tillväxtmedium 15. För att observera biofilmstillväxt under ett närings gradient i flödescellen, introducerar modifierat FAB-medium 15 med 0,6 | iM glukos i ett inlopp och införa FAB medium utan någon kolkälla genom den andra inloppsöppningen. Filter-sterilisera (porstorlek = 0,2 mikrometer) glukosstamlösning (60 mM) innan den läggs till FAB mediet. Också autoklav FAB medium med cykel 1 (vätska, 15 min, 121 ° C, 17 psi) före användning.
- Sterilisera flödessystemet. Före ympning, autoklav hela flödesvägen (medel flaskor, slangar, bubbelfällor, flödesceller) med hjälp av cykel 1, med undantag för de plast trevägsventilerna (engångs och pre-steriliserade) belägna uppströms flödescellen. (Tre-vägs ventiler används för injicering cell culture, fluorescerande spårämne och mikrokorn.) För att undvika kontaminering under monteringen, täcka alla slangar och anslutningsöppningar med aluminiumfolie eller autoklav väskor innan autoklavering.
- Anslut flödessystemet. Montera komponenterna i flödescellsystemet noggrant (se video för flödessystem montering) och leverera tillväxtmedium till flödescellen via en peristaltisk pump som exakt kontrollerar flödeshastigheten.
- Förbered cellodling för ympning genom att överföra en koloni av P. aeruginosa eller E. coli från LB-plattor till 3 ml LB-buljong och skaka odlingen O / N vid 225 rpm och 37 ° C. Späd O / N-cellodlingar i en ml sterilt vatten till en slutlig OD 600 = 0,01 som inokulat. (Kultur och späd bakterierna i ett laminärt flöde huva för att undvika kontaminering.)
- För experimenten med biofilmer blandad-arter, späd de två bakteriekulturer till ett förhållande av 1: 1 i 1 ml med en ekvivalent OD 600 = 0,01 för varje bakterie.
- Inokulera flödescellen. Injicera 1 ml av inokulumet till flödescellen inloppet från tre-vägsventilen. Efter injektionen, pausa flödet under 1 h för att medge bakterieceller fästa till täckglaset. (Se till att flödescellen är placerad med täcksidan nedåt för att tillåta suspenderade cellerna att sedimentera på täckglas.)
- Efter en timme, återuppta flödet och pumpa tillväxtmediet till flödescellen med en konstant hastighet av 0,03 ml / min för varje inlopp för tre dagar.
2. karakterisera Biofilm utveckling som svar på näringsämnen övertoningar Använda konfokalmikroskopi
OBS: P. aeruginosa kan avbildas med konstitutivt uttryckt GFP, men E. coli i biofilmer blandad arter måste avbildas av motfärgning.
- Beakta 3-dagars biofilmer använder konfokalmikroskopi. För representativa resultat, observera biofilmer med en konfokalmikroskop med 63X objektiv. Före avbildning, märkedubbel-inloppsflödescell med ett rutnät på omslaget glassidan. (Syftet med detta nät är att låta försöksledaren att lokalisera avbildningsregionerna i flödescellen kammaren.)
- Att Motfärga, späd 10 ìl av cell genomträngande röd fluorescerande nukleinsyra fläcken, såsom grönt fluorescerande nukleinsyra fläcken som STYO 62, stamlösning (1 mM) i 990 ul steriliserat vatten och sedan långsamt injicera det utspädda fläcken med hjälp av en spruta i flödescellen kammaren från den uppströms belägna tre-vägsventilen. Håll flödescellen stagnerande och i mörker under 30 minuter, därefter återuppta flödet att tvätta ut det obundna fläcken under 15 minuter.
- Utför konfokal avbildning. Aktivera 488 nm Argon laser för excitation och utsläpp samla kanaler för GFP (500-535 nm) och nukleinsyra fläcken (för grönt fluorescerande nukleinsyra fläcken, 650-750 nm). Justera vinster och förskjutningar för båda kanalerna att ha ljusa och rena bilder. Välj xyz och samtidig bildåtergivningsläge. Använd z-vredet till idenderrätta botten och toppen av biofilmen på fältet. Ställa in Z-steget till 0,5 ^ m för att förvärva en 3-D-bildstapel. (För att säkerställa hög bildkvalitet, använd en linje genomsnitt av fyra för bildtagning.)
- För att avbilda de rumsliga mönster för biofilmutveckling inom flödescellen, bild biofilmer vid tre eller flera längsgående (x) avstånd längs flödescellen inlopp och vid tre tvärgående (y) lägen i förhållande till den pålagda närings gradienten, såsom visas i fig 1 .
3. karakterisera Intern transport av lösta ämnen genom Injektioner av konservativa Fluorescerande Tracer
ANMÄRKNING: En konservativ fluorescerande spårämne, såsom Cy5, kan användas för att karakterisera löst ämne transportmönster inom biofilmen.
- Lös Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) i vatten till en slutkoncentration av 10 mg / ml som en förrådslösning. Förvara Cy5 stamlösning i en -20 ° C frys.
OBS: Eftersom Cy5 är ljus SENSITive, lagra, utspädd och injicera Cy5 lösningar i mörker. - Före injektioner av fluorescerande spårämne, ta en 3-D bild bunt med den 3-dagars biofilm med konfokalmikroskopi (med en 63X objektiv). (Wide regioner biofilm kolonier är idealiska för tidsserier observationer av färgtransport.) Också välja en z-plan med väl separerade kolonier för avbildning (som visas i figur 5A).
- För varje Cy5 injektionsexperiment, späd 2 pl av Cy5 stamlösning i 998 pl sterilt vatten för erhållande av en injektionslösning med en Cy5 koncentration av 20 pg / ml.
- Stanna pumpen att pausa flödet och injicera Cy5 lösningen i uppströms flödescellen med hjälp av en spruta via 3-vägsventilen. (Det är viktigt att förhindra att luftbubblor kommer in i flödesvägen medan du injicerar. Bubble fällor bör hållas öppen under ryggen injektionen.)
- När du har injicerat Cy5 lösningen, stänga bubbelfällor, justera 3-vägsventil, och starta ompump för att leverera den injicerade Cy5 lösningen in i flödescellen.
- Växla confocal bildåtergivningsläget att xyt. Aktivera Cy5 och GFP kanaler under samtidig bildåtergivningsläge. Justera konfokala inställningarna på Cy5 intensitet (laserintensitet, vinna och offset) för att undvika mätt signaler, vilket är avgörande för kvantifiering. (Hög tidsupplösning är att föredra för att visualisera färgpenetration. Men snabb skanning minskar bildkvaliteten.) Välj korrekt skanningshastighet och linje genomsnitt att balansera tiden upplösning bildbehandling och bildkvalitet. För detta protokoll använder en linje i genomsnitt fyra och en bildfrekvens på 0,15 Hz.
- Återuppta flöde för att leverera Cy5 in i flödescellen (fortfarande vid en flödeshastighet av 0,03 ml / min). Samtidigt börjar tidsserier konfokal avbildning.
- Kvantifiera Cy5 penetration av radiellt genomsnitt Cy5 intensitet inom en 2-D cirkulär biofilm koloni. Att medelvärdes, först identifiera kanten av en biofilm kluster, sedan generera ett avstånd kartan för en 2-D-sektion av klustretOch slutligen genomsnittliga radiella mönster av Cy5 intensiteter för att generera en penetrationskurva (se Figur 6).
- Till beräknings inser steg 3,8, använd BioSPA (Biofilm Spatial mönsteranalys) mjukvara (opublicerade, programpaket och manuell på begäran) eller andra program bildanalys.
- För att använda BioSPA, först importera en bild satt i BioSPA. Välj sedan lämplig tröskel för GFP och Cy5 kanaler för att göra binära bilder. I analysen / beräkningsmenyn väljer Advanced Analys och sedan Diffusion analys. Använd GFP kanalen för att definiera kanten av ett kluster och använda polygonen verktyget för att markera ett kluster som regionen av intresse (ROI).
- Dubbelklicka på den valda biofilm klustret att utföra diffusion analys. Spara diffusion analysresultaten och kalibrera Cy5 intensitet till Cy5 koncentration med hjälp av en kalibreringskurva.
- För att generera Cy5 kalibreringskoncentrationen kurva, mät Cy5 intensiteter över en Cy5 concentration lutning enligt konfokalmikroskopi. (Cy5 intensitet och koncentration har ett linjärt förhållande.)
4. Characterizing omnejden Flow Field med spårnings fluorescerande partiklar
OBS: Fluorescerande partiklar, såsom fluorescerande mikropärlor, kan användas för att karakterisera strömningsfältet runt biofilmer. Flödesfält runt biofilmer kan beräknas från tidsserie observationer av partikelpositionerna genom partikelspårning Velocimetry programvara. De resultat som visas här erhölls med Strömmar 2,02 programpaket 16 (nedladdning och användarhandbok finns på http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Späd de fluorescerande mikropärlor (diameter ~ 1 | im) i steriliserat vatten till en slutlig fast koncentration av 0,2% och en slutlig volym av 0,5 ml. Vortex att se till att mikropärlornaär väl dispergerade.
- Spruta och leverera de utspädda fluorescerande mikrokulor i flödescellen efter procedurer från steg 3,3-3,5. För att möjliggöra en korrekt spårning av partikelbanan, använd en relativt låg flödeshastighet (0,01 ml / h för spårning partikel ger detta papper).
- Växla konfokala inställningar för att xyt läget att spåra partikelrörelse vid en z-skiva och ta tidsseriebilder. (En bildfrekvens på 1 Hz användes för de representativa resultat som visas i detta dokument.) Upprepa partikelinjektion och bild vid olika z platser för att generera flödesfält 3-D.
- Pre-processen tidsserien konfokala bilder genom att subtrahera bakgrundsfluorescenssignalen (signalen i den första förvärvade bilden av bilden set) med ImageJ (nedladdning och manuell tillgänglig på http://imagej.nih.gov/ij/ ) eller andra program.
- I ImageJ, öppna den första bilden av en bild set och sedan importera bilden uppsättningen. Under Process / Image Calculator, subtrahera den första bilden från bilduppsättning. Spara förbehandlade bilduppsättning.
- För att beräkna flödes vektorer, import tidsserie konfokala bilder i Strömmar 2,02. Under "Öppna process view", välja och köra "Identifiera partiklar". Använd lämplig tröskel för att identifiera partiklar. Använd 0,5 och 5 pm som minsta och största diameter tröskelvärden för en fim partiklar.
- Sedan under "Open process view", välja och köra "PTV analys pipeline" för att skapa partikelbanor. Kontrollera partikelbanorna för att se om de representerar partikelrörelse. Slutligen, välja och köra "Skapa hastighetsfältet" för att generera ett flöde vektorkarta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den dubbelinloppsmikroflödesflödescell medger observation av biofilmtillväxten enligt en väldefinierad kemisk gradient bildad genom blandning av två lösningar i flödeskammaren. Den resulte kemiska gradienten var tidigare observerats av färgämne injektion och karakteriseras i detalj av Song et al. 14. Släta koncentrationsgradienter bildades i den tvärgående riktningen, såsom visas i figur 1. Koncentrationsprofilen var brant nära inloppet och fick luckras nedströms på grund av diffusion (Figur 1). För att observera biofilm utveckling under ett närings lutning, använde vi ett definierat minimalt tillväxtmedium (FAB medium) med glukos bara läggas till ett inlopp som enda kolkälla. Detta gav ett glukos-gradient i flödescellkammare medan alla andra näringsämnen var homogent fördelade. Tillväxten av P. aeruginosa PAO1 biofilmer var starkt korrelerad till den lokala leveransen av glukos (Figur 2).Som tvärglukos koncentrationsgradient var brant nära inloppet, visade biofilmen biomassa en dramatisk minskning från hög glukos region till den låga glukos region. Som tvärglukos lutning avslappnad nedströms blev biofilmen biomassa mer homogen. Vi demonstrerade användningen av denna flödescell för att studera inverkan av P. vidare aeruginosa och E. coli i biofilmer enligt en glukos gradient (Figur 3). Resultaten visade att dessa två arter uppvisade tydliga rumsliga mönster i tillväxt i förhållande till närings lutning, och därför ockuperade distinkta ekologiska nischer: P. aeruginosa dominerade biofilm biomassa i regioner med höga glukoskoncentrationer och E. coli dominerade i regioner med låga glukoskoncentrationer (Figur 3).
För att förstå återkoppling mellan biofilm tillväxt och den omgivande flödet miljön, vi känneströmningsfältet kring växande biofilmer av fluorescerande spårning partikel Velocimetry enligt konfokalmikroskopi. Den observerade rörelse de injicerade fluorescerande mikropärlorna visas i Movie 1. Lokal flödesvektorinformation extraherades från i genomsnitt minst 4.200 diskreta mätningar av partikelhastigheter använder Strömmar programpaketet. Tredimensionell kartläggning av fältet flödet erhölls genom att spåra partiklar vid flera vertikala positioner (Figur 4). Biofilm tillväxt avsevärt ökat flöde heterogenitet (Figur 4). Flöde nära biofilm bas avledas runt biofilm kluster, vilket leder till ökad heterogenitet och minskad hastighet (Figur 4). Flöde vid biofilm toppen har högre hastighet och är mer homogen (Figur 4).
För att förstå den interna heterogeniteten orsakad av begränsad transport lösta ämnen inom biofilmer, observerade vi transport av Cy5 inom biofilmer med konfokalmikroskopi. Tidsserie penetrationav Cy5 i en biofilm kluster visas i Movie 2. tidsserier Cy5 penetrationskurvor visas i Movie 3. Den effektiva diffusionskoefficient Cy5 i biofilmer beräknades genom att montera en 1-D diffusion modellen koncentrationsprofiler Cy5:
där C är den radiellt medelvärdes Cy5 koncentration beräknad från fluorescensintensitet, och är avståndet i biofilmen 17. Cy5 visade den högsta koncentrationen i bulkflödet och minskade kraftigt vid inträdet i biofilmen (Figur 5).
Figur 1. Dubbel inlopp mikroflödesflödescell. Släta glukos gradienter skapades inom flödeskammaren genom att införa FAB medium till de två inlopp med en kolkälla (gluko SE) tillhandahålls endast i en inlopp. Resultemönster glukos i flödescellen indikeras med skuggning. Mörk skuggning representerar högre glukoskoncentrationer. Konfokal avbildning utfördes vid nio platser i flödescellen. Resultat presenteras i Figurerna 2 och 3 hänvisar till platser numrerade 1-9 i figuren. Denna siffra är modifierad efter Song et al. (2014), Fig. 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. PAO1 biofilm tillväxt i glukos lutningar. 3-dagars PAO1 biofilmer avbildades på nio platser som visas i figur 1. Grid mellanrum = 18 pm för bild 1-8 och 24 pm för bild 9.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utvecklingen av P. aeruginosa och E. coli dubbla arter biofilmer enligt glukos gradienter. P. aeruginosa uttrycker konstitutivt GFP, och biofilmen var också motfärgades genom SYTO 62, som är ett allmänt nukleinsyra fläcken. Bilder som visas här är överlägg av GFP (grön) och SYTO 62 (röd) kanaler. P. aeruginosa förefaller därför grönt eller gult (grön + röd), och E. coli verkar rött. Skala barer = 47 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Flödeshastighet vektorfält vid z = 4, 10 och 16 | im kring en biofilm kluster. Längden på pilen representerar storleken på hastigheten. Låg flödeshastigheten visar på biofilm bas (z = 4, blå pilar). Flow är mer homogen nära biofilm topp (z = 16, röda pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cy5 inträngning i biofilmer. (A) Confocal mikroskop vid z = 18 nm visar partiell penetration av Cy5 i biofilm kluster vid t = 190 sek. Skala barer = 10 mikrometer. (B) Resulte mönster av Cy5 koncentrationskartan. (C) Cy5 koncentrationsprofil i en biofilm kluster. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Rutiner för att generera en Cy5 penetration profil Vänster:. Valt ROI innehåller en 2-D biofilm kluster. Mitten: Avstånd karta över biofilmen klustret. Höger: Radiellt-genomsnitt Cy5 intensitetsprofilen. Klicka här för att se en större version av bilden.
Film 1 : Motion av injicerade fluorescerande partiklar runt biofilm kluster (konfokal video).
Film 2 : Förökning av Cy5 i biofilm kluster (konfokal video).
_content "> Film 3 : Förökning av Cy5 i biofilm kluster (koncentration profiler video).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visade en svit av metoder för att karakterisera tre viktiga biofilm-miljö interaktioner: biofilm svar på kemiska gradienter, effekter av biofilm tillväxt på den omgivande flödet mikromiljö, och biofilm heterogenitet följd av interna begränsningar transport.
Vi visade först att använda en ny cell mikroflödesflöde att införa en väldefinierad kemisk gradient för biofilm utveckling. För att generera en väldefinierad kemisk gradient i flödescellen, är det viktigt att bibehålla samma flöde för båda inloppen. Se till att den peristaltiska pumpen är väl justerad för båda flödeskanalerna för att leverera odlingsmediet med samma hastighet. Se också till att det inte finns någon igensättning i flödesbanan under biofilm tillväxt. Observationer av tillväxten av biofilmer dubbla arter i denna flödescell visar att kemiska gradienter påverkas kraftigt biofilm tillväxt och interaktioner mellan arter inom biofilmer. Kemiska gradienter är vanliga imiljöer där biofilmer växa, på grund av en kombination av begränsningar transporter, kemisk bindning och reaktioner, samt mikrobiell upptag och metabolism 18-20. Denna mikroflödesflödescell möjliggör undersökningar av olika biofilm verksamhet enligt ett definierat antal kemiska förhållanden inom en och samma enhet. Till exempel har det flödescell visats sig vara användbara för att studera biofilm dödande under en antimikrobiell lutning 14.
Vi visade då användningen av spårning partikel Velocimetry att observera strömningsfältet kring biofilm kluster. För att säkerställa en korrekt spårning av de injicerade fluorescerande partiklar, måste flödet optimeras. Vanligtvis tillåter låg flödeshastighet rörelsen av partiklar som skall fångas på konfokal synfält. Också avsökningsbildhastighet behöver optimeras för att balansera bildkvalitet och tidsupplösning. Om partiklarna rör sig för fort för att fånga rörelsen, använd nedre raden eller ram genomsnittlig eller steg omase skanningshastighet. Vi kartlade strömningsfältet vid tre vertikala positioner under en biofilm kluster, och fann att biofilm tillväxten ökade flödet heterogenitet. Characterizing strömningsfältet kring biofilmer låter nyckelflödes biofilm interaktioner på att utforskas. Exempelvis kan detta användas för att utvärdera mekanismerna som reglerar strömningsmotstånd och skjuvning över biofilmen, och den erhållna biofilm misslyckande och lösgörande av celler från ytan 1,21. Dessa processer är viktiga för att förstå både effekterna av biofilmer på flödessystem (t.ex. biologisk förorening) och reglering av biofilm morfologi 8. Flödesförhållanden runt biofilmer kontrollerar också masstransport, vilket är viktigt för ett brett spektrum av biofilmsprocesser. Till exempel, den lokala vätskehastigheten vid biofilmen ytan påverkar leveransen av näringsämnen och substrat mot biofilmer genom advektion 22.
Slutligen visade vi att använda injicera fluorescerande spårämnen för att analyseralösta ämnen transportmönster inom biofilmen. Vi använde Cy5 här som en konservativ spårämne, och detta fluor verkar ofta beter sig konservativt i biofilmer 23. Resultaten bör därför vara representativa för de transportmönster av icke-reaktiva, neutrala lösta ämnen i biofilmer. Resultaten visade en brant minskning av Cy5 koncentration nära biofilmen ytan, vilket ger en Cy5 koncentration i det inre av biofilmen endast ~ 50% av koncentrationen i bulkflödet. Sådana branta koncentrationsprofiler överensstämmer med tidigare rapporterade mätningar av syre, näringsämnen och antimikrobiella medel inom biofilmer 2,24. Cy5 penetrationskurvor ge information om lösta ämnen diffusion i biofilm kluster. Dock är den metod vi presenterar här begränsade för att analysera 2D-transport av lösta ämnen i horisontella (xy) plan i biofilmer. Med nyare snabbt imaging kapacitet, till exempel spinning disk konfokalmikroskopi, färgpenetration kan också visualiseras i 3-D inom biofilmer, which tillåter en undersökning på vertikala transportprocesser. Dessutom kan fluorescerande spårämne och partiklar injiceras tillsammans för att få information om de yttre strömningsförhållanden och interna transporter löst ämne samtidigt. Sådan information är användbar för att skilja advektiv och diffusiv transport av lösta ämnen mellan bulkflöde och biofilmer och bedöma effekten av externa flödet på intern transport av lösta ämnen i biofilmer.
Sammantaget presenterar vi detaljerade protokoll för att använda en ny mikroflödesflödescell som ger väldefinierade kemiska gradienter för studier av biofilm svar på kemiska signaler i miljön. För att bättre karaktärisera heterogenitet i biofilmer och deras omgivande microhabitat, presenterar vi här metoder för att karaktärisera mönster i både flödesfält som omger biofilmer och interna transporter lösta ämnen inom biofilmer. Varje metod ger distinkt information om biofilm egenskaper och / eller miljöförhållanden. Eftersom dessa metoderär integrerade, kan flera aspekter av information erhållas samtidigt. Kombinerad information gör det möjligt för forskare att närma mer komplexa problem. Till exempel genom att använda dessa metoder, framgångsrikt analyserade vi biofilm utveckling och mellan arter interaktioner i biofilmer under ett näringsämne lutning. Dessa metoder ger också experimentell förmåga att öka komplexiteten i den mikrobiella miljön och den kemiska miljön, vilket gör utredningar på biofilmsprocesser på ett mer realistiskt sammanhang. Potentiella tillämpningar av dessa metoder omfattar olika aspekter av biofilm forskning, inklusive biofilm livscykel, flerarts biofilmer, biofilm heterogenitet, transportprocesser i biofilmer, och biofilm-flöde samspel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Matt Parsek vid University of Washington (Seattle, WA) för att tillhandahålla P. aeruginosa och E. coli-stammar och Roger Nokes vid University of Canterbury (Nya Zeeland) för att ge tillgång till Streams mjukvara. Detta arbete stöddes av bidrag R01AI081983 från National Institutes of Health, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. Confocal avbildning utfördes vid Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
