Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Funktionel og Morfologisk vurdering af Membran innervation af phrenic Motor neuroner

Published: May 25, 2015 doi: 10.3791/52605

Introduction

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en invaliderende motorisk neuron sygdom forbundet med tabet af både øvre og nedre motorneuroner og deraf følgende muskel lammelse. Efter diagnosen, patientoverlevelse er i gennemsnit kun 2-5 år 1. Phrenic motor neuron (PhMN) tab er en kritisk komponent i patogenesen af ​​ALS. Patienter i sidste ende dør på grund af tab af PhMN innervation af membranen, den primære muskel til inspiration 2,3. Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er også et alvorligt problem med tilknyttede åndedrætsbesvær. Ca. 12.000 nye tilfælde af SCI opstår hvert år 4 på grund traumatisk skade på rygmarven. Trods sygdom heterogenitet med hensyn til placering, type og sværhedsgrad, de fleste SCI sager vedrører traumer til cervikal rygmarv, hvilket ofte resulterer i invaliderende og vedvarende respiratorisk kompromis. Foruden ALS og SCI, andre centralnervesystem (CNS) sygdomme kan være forbundet wed diafragma respiratorisk dysfunktion 5,6.

Phrenic nerve er en efferente motoriske nerve, der innerverer den ipsilaterale hemi-membran og som stammer fra PhMN cellelegemer placeret i C3-C5 niveauer af den ipsilaterale cervikale rygmarv. PhMN udgang styres ved faldende bulbospinal input fra hjernestammen i et område kendt som den rostrale ventrale respiratoriske gruppe (rVRG) 7. Den rVRG-PhMN-membran kredsløb er central for kontrol af inspiratorisk vejrtrækning, samt andre ikke-ventilatoriske membran adfærd. Forskellige traumatiske skader og neurodegenerative lidelser, som påvirker dette kredsløb kan føre til en dyb nedgang i respiratorisk funktion og patientens livskvalitet. Faldende input til PhMNs fra rVRG, PhMN overlevelse, phrenic nerve integritet og korrekt innervation ved mellemgulvet neuromuskulære junction (NMJ) er alle nødvendige for normal membran funktion. Det er derfor vigtigt at ansætte teknikker,kan kvantitativt vurdere dette kredsløb in vivo i gnaver modeller af ALS, SCI og andre CNS-sygdomme.

Med denne protokol, målet er at beskrive eksperimentelle værktøjer til vurdering PhMN innervation af membranen på både elektrofysiologiske og morfologiske niveauer. Forbindelse muskel aktionspotentialer (CMAP'er) registreres ved at stimulere alle efferente motor neuron axoner af en given motor nerve og derefter analysere fremkaldte depolarisering respons målet myofibre. Denne teknik kan anvendes in vivo i bedøvede rotter og mus til at kvantificere funktionel innervation af hemi-membran ved PhMNs 8. På grund af det faktum, at CMAP'er repræsenterer samtidig optagelse af alle (eller i det mindste mange / de fleste) myofibre i hele hemi-membran, er det nyttigt at også undersøge de fænotyper enkelte motoriske axoner og myofibre på mellemgulvet NMJ for at spore sygdomme - og terapi-relevant morfologiske ændringer såsom delvis og komplete denervering, regenerativ spiring og reinnervation. Dette kan opnås via hel-mount immunhistokemi (IHC) af membranen, efterfulgt af detaljeret morfologisk vurdering af individuelle NMJs hele musklen 9. Kombination CMAP'er og NMJ analyse giver en kraftfuld metode til kvantitativ studere diafragma innervation i gnaver modeller af CNS og PNS sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle procedurer blev godkendt af Thomas Jefferson University institutionel dyr pleje og brug udvalg og gennemføres i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv (2010/63 / EU, 86/609 / EØF og 87-848 / EØF), NIH Guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og Society for Neuroscience politik om brugen af ​​dyr i Neuroscience Research.

1. Forbindelse Muskel Action Potentials (CMAP'er)

  1. Klargøring af dyret:
    1. Bedøver rotten under anvendelse af en inhalant (isofluran) på 1-2% leveret til virkning eller ved injektion (ketamin, xylazin, acepromazin). Dosering af injicerbar bedøvelse er som følger: 95,0 mg / kg af ketamin, 10,0 mg / kg xylazin, 0,075 mg / kg acepromazin.
      BEMÆRK: Vi kunne bruge både inhalant og injicerbar bedøvelse tilgange, når der udføres denne CMAP optagelse protokol, med ingen præference.
    2. Dyret skal holdes på et passende ennesthetic dybde før operationen påbegyndes, gennem indgåelse af operationen, og indtil postoperativ buprenorphin har fået virkning. Bekræft ordentlig bedøvelse ved kort tå knivspids at fastslå, at en tilbagetrækning svar ikke fremkaldes. Derudover teste hornhinde refleks med en vatpind. I hele den kirurgiske procedure, fastlægge, at puls og respirationsfrekvens ikke er steget, hvilket antyder, at anæstetisk dybde er blevet for lys.
    3. Påfør en dyrlæge salve på dyrets øjne til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.
    4. Kirurgen skal vaske hende / hans hænder med et desinficerende middel (klorhexidin krat), før du begynder operation. Kirurgen bør bære sterile handsker, ansigtsmaske og kjole eller ren kittel. Alle instrumenter skal vaskes og autoklaveres før operation. Tilføj et steriliseringsindikatoren strimmel inde i instrumentet kit før autoklavering på niveau med de instrumenter for at verificere, at steriliseringen er gennemført. Kirurgen skalkontrollere, at hele linien på strip er sort før påbegyndelse kirurgi. Tape uden for boksen med angivelse af autoklave tape så godt. Hvis operation skal udføres på flere dyr på samme dag, rense instrumenterne mellem operationer og sterilisere i en glaskugle sterilisator. Hvis det er nødvendigt, sterilisere begge ender af instrument i glaskugle sterilizer ved at placere håndtaget på instrumentet i sterilisatoren for passende tid, fjerne instrumentet med en steril hæmostat, afkøling i et sterilt felt, og derefter placere den funktionelle ende af instrumentet i glasset perle sterilizer for passende tidsrum.
    5. Når dyret er bedøvet, kan sted på kirurgisk bord med dorsale overflade ned og maven opad, så tape bruges til at sikre dyrs forlemmer til kirurgisk bord.
    6. Barbere ventral overflade kaudalt begynder i bunden af ​​kraniet, og sikre, at området omkring maven på hver side af midterlinjen er shaved afhængigt af hvilken hemi-membran bliver optaget. Anvende povidon-iod til den barberede overfladen af ​​huden.
  2. Forberedelse til CMAP optagelser:
    1. Efter fremstilling dyr, sted jordelektrode subkutant i halen (figur 1).
    2. Placer referenceelektroden subkutant i den kontralaterale nedre abdominale region.
    3. Placere ledende gel på selvklæbende overflade strimmel eller skive optagelse elektrode (dimensioner overflade strimmel elektrode: 0,5 x 3 cm), og derefter placere overfladeelektrode tværs langs den ensidige ribbenskurvaturen.
    4. Placer stimulerende elektroder transcutant 0,5 cm fra hinanden laterale til luftrøret og overlegne til kravebenet. Sæt elektroderne ca. 1,0 cm dybe gennem huden. Fastgør elektroderne i hånden, så deres placering ikke bevæger sig med efterfølgende stimuleringer.
      BEMÆRK: Angle stimulerende elektroder 90 ° i forhold til huden på stedet for insertion.
  3. Forbindelse Muscle Action Potentielle (CMAP) optagelser:
    1. Opnå elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af en stimulator / forstærker efterfulgt af computerstøttet dataanalyse.
    2. Stimulusparametrene af enkelt pull stimulation bør være 0,5 msek, 1,0 Hz supramaksimale pulser. Amplituden af stimulus skal være mellem 6,0 og 8,0 V (figur 2A).
      BEMÆRK: Inden et eksperiment, skal du bruge en stimulus intensitet med samme amplitude tværs dyr. Målet er at maksimere responsamplituden ved hjælp af minimal amplitude af stimulation. Det er vigtigt at bemærke, at den første reaktion, der finder sted på tidspunktet for stimulering er en stimulering artefakt. Desuden bør der drages omsorg for at opnå en CMAP respons, der indledes med en stabil / lejlighed basislinien efter stimuleringen artefakt, som derefter følges af den hurtige CMAP respons. For at opnå et sådant svar, kan det være nødvendigt at flytte stimulering og / ellerregistreringselektroder.
    3. Vent 30 sek mellem stimulationer, og gentag 10 stimulationer i træk at få den gennemsnitlige respons (figur 2B - C). Mål amplituden fra baseline til top (figur 2A). Gennemføre phrenic nervestimulation under fasen af ​​dyrets respirationscyklus når phrenic nerve / membranen ikke er aktiveret. Proceduren kan gentages på det samme dyr til den kontralaterale hemi-membran.
    4. Efter den sidste CMAP indspilningen, perfundere dyret, hvis vil blive gennemført NMJ farvning. Gennemføre CMAP optagelser gentagne gange på det samme dyr cirka en gang hver uge (eller i interval valg).
    5. Efter overlevelse CMAP optagelser, tillade dyret kan komme på en cirkulerende varmt vand varmepude, og løbende overvåge under restitution indtil vågen og sternally liggecykel. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. </ Li>
    6. Når sternally liggende, overvåge dyret hver 12 timer for den første 48 timer (en gang dagligt derefter). Hvis dyret synes at være dehydreret (slap hud, sløvhed), administrere væsker (lakteret Ringers opløsning, subkutant, 1-2 ml pr injektion, med de steder roteret, 2 gange om dagen), indtil post-kirurgisk vægt og væsketab stabiliserer. Give dyr med blødgjort mad i små retter i den akutte postoperative periode, hvis nødvendigt for at tilskynde spise, hvis de ikke kan nå wire bar låg feeder.
    7. Administrere buprenorphin i en dosis på 0,05 mg / kg inden udgangen af ​​kirurgi og derefter ved 12 timers intervaller i de første 24 timer (og afhængig af tegn på smerte / stress derefter) via subkutan injektion (site roteret). Ved tegn på smerte eller lidelse er bemærket derefter behandler dyr med buprenorphin. Tegn vejledende af smerte / angst omfatter manglende aktivitet, vokaliseringer, manglende spise eller drikke (dehydrering), overdreven vægttab, bevogtning, excessive gnave eller kradse på stedet af indsnit. Yderligere kriterier, der anvendes til at bestemme smerte og lidelse omfatter manglende respons til uvedkommende stimuli, forbigående eller uprovokeret vokalisering, anstrengt eller unormal vejrtrækning, vedvarende rødbrun naso-okulær udledning, mærket piloerektion. Også overvåge tegn på dårlig hygiejne, der ville foreslå syge dyr. Hvis dyret stadig er observeret at være i nød efter 72 timers behandling (ifølge de smerter / stress kriterier skitsere ovenfor, og efter at have modtaget den analgetiske protokollen beskrevet ovenfor) aflive dyret.

2. Membran Neuromuskulær Junction (NMJ) Analyse

  1. Animal dissektion:
    1. Administrere dyret en overdosis af injicerbar anæstesi (3 gange dosis anvendt ovenfor: ketamin på 285,0 mg / kg, xylazin på 30,0 mg / kg, acepromazin ved 0,225 mg / kg; indgivet intraperitonealt). Efter overdosering skal alle dyr have en anden metode til eutanasi (thoracotomi) to sikre død. Døden bør bekræftes ved at observere hjerte- og respirationsstop og ved at bemærke dyrets faste og forstørrede pupiller.
    2. Gennemføre en laparotomi med skalpel eller dissektion saks udvide excision fra zyphoid proces kaudalt langs midterlinjen. Adskil forsigtigt hud og bindevæv fra underliggende muskel under anvendelse skalpel og pincet.
    3. Mens du trækker op på zyphoid proces, brug dissektion saks til at fjerne hele mellemgulvet, der sikrer, at membranen forbliver fastgjort til omgivende knogle. Dette er vigtigt, da det vil forhindre beskadigelse af membranen muskel, vil give mulighed for en vellykket dissektion af hele membranen og vil hjælpe med at rense muskel til efterfølgende farvning.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan dyret perfunderes om nødvendigt.
  2. Rengøring og farvning af membranen:
    1. Pin ned det hele dissekeret membran, overlegen opad, til silikonegummi i et glas 100 mm petriskål i4% paraformaldehyd (fremstillet i 1% phosphatpufret saltopløsning - PBS) i 20 minutter under anvendelse af et stereomikroskop. Strække membranen for at gøre det stramt, og under anvendelse af insektceller stifter, pin ned det omgivende væv for at undgå pinning mellemgulvet musklen selv (figur 3).
    2. Rengør forsigtigt bindevæv fra kun den overlegne overflade af muskler med # 5 pincet og en lille saks.
      BEMÆRK: Foretag alle efterfølgende trin i denne farvningsprotokol langsomt vuggende ved stuetemperatur dækket fra lys medmindre andet er angivet. Sørg for, at mellemgulvet musklen altid er helt nedsænket i væske for at undgå udtørring.
    3. Før farvning, forberede alle nødvendige reagenser: 1x PBS, 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M glycin fremstillet i 2% BSA / PBS, 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS, og 0,2% TBP (0,2 % Triton X100 i 2% BSA / PBS). Vær sikker på at pre-cool methanol ved -20 ° C.
    4. Wash 3x i 10 minutter i 1 x PBS.
    5. Inkuber i 0,1 M glycin (made in 2% BSA / PBS) i 30 minutter.
    6. Der inkuberes i RBTX (rhodamin-konjugeret α-bungarotoxin) opløsningen i 15 minutter. Løsning for RBTX er som følger: Rhodamine-konjugeret alfa bungarotoxin 1: 400 fortynding i 1x PBS.
      BEMÆRK: I denne protokol, der Rhodamin bruges, men enhver fluorophor valg kan bruges til farvning.
    7. Wash 3x i 10 minutter i 1 x PBS.
    8. I -20 ° C fryser, inkuberes med MeOH i 5 min.
      BEMÆRK: Du må ikke tilføje MeOH før placere muskel i fryseren, og straks fjerne løsning efter inkubationsperioden.
    9. Wash 3x i 10 minutter i 1 x PBS.
    10. Blok i 0,2% TBP i 1 time (0,2% Triton lavet i 2% BSA / PBS).
    11. Inkuber med primær antistofopløsning (i 0,2% TBP) ved 4 ° C natten over under vipning. Fortyndinger af antistoffer som følger: SV2 (1:10) og SMI-312 (1: 1000).
    12. Vask 3 x i 10 minutter med 0,2% TBP.
    13. Inkuber med sekundært antistof under anvendelse af 1: 100 fortynding af FGM1 (FITC-konjugeret gede-anti-muse-IgG1; fremstillet i 0,2% TBP), mens rokkende i 1 time.
      BEMÆRK: Beskyt mod lys i resten af ​​protokollen for farvning.
    14. Wash 3x i 10 minutter med 1 x PBS.
    15. Re-clean omgivende bindevæv på den overlegne (se ovenfor) overflade af muskel før montering og dækglas.
      BEMÆRK: Det anbefales at rengøre og montere prøven umiddelbart efter farvning derefter. Om nødvendigt, kan prøven være dækket i 1 x PBS, pakket ind i parafilm at forhindre fordampning og opbevaret ved 4 ° C i op til 1 uge, med skiftende PBS dagligt.
    16. Ved montering på objektglas, dækglas med ikke-hardset Vectashield. Seal kanter dækglas med klar neglelak for at forhindre udtørring. Opbevar dias liggende fladt i pap slide mapper i -20 ° C til lang sigt.
  3. Analyse og konfokal Imaging:
    1. Kvantitativt analysere morfologi farves og monteres hemi-membran under 20X og 40X forstørrelse med anvendelse en opretstående epifluorescensmikroskop.
      BEMÆRK: Da membranen er farvet og analyseret i en hel-mount mode, musklen er ganske tyk. Derfor kan de fleste af fluorescensen farvningen er helt ude af fokus, når et statisk billede er taget ved hjælp af ikke-konfokal fluorescensmikroskopi. Af denne grund, er det bedst at gennemføre NMJ analyse i realtid på mikroskopet, da dette giver dig mulighed for konstant at fokusere "op" og "ned" gennem musklen til korrekt at identificere morfologi af hver af de enkelte NMJs. Ved hjælp af denne metode, kan man nemt følge bane individuelle motoriske axoner som de bevæger sig gennem vævet i rumlige forhold til de post-synaptiske receptor klynger.
    2. Ved at måle den ventrale-til-dorsale musklens længde, opdele musklen i 3 separate sektioner til analyse baseret på topografiske innervation mønstre fra specifikke rygmarven niveauer (figur 4H).
    3. Begyndende ved den ventrale region af musklen og moving dorsalt, analysere alle en ansigt NMJs placeret på overfladen muskelfibre. Ikke analysere muskelfibre dybere end de første 3-4 fibre fra overfladen som fortolkning kan være vanskelig på grund af ringere antistof penetration (RBTX trænger meget dybere ind i musklen på grund af den lille størrelse af toksin i forhold til de større antistoffer anvendes til mærkning neuroner).
    4. Identificere hver enkelt NMJ som intakt, hvis præ-terminale axon af neuron er tyk i diameter og alle regioner i nerveterminalen helt overlapper de underliggende muskel acetylcholin receptorer (AChRs).
    5. Identificere hver enkelt NMJ som delvist denerveres hvis nogen region i de underliggende muskel AChRs er ubeboet med tilsvarende nerve terminal.
    6. Identificere hver enkelt NMJ som fuldstændig denerveres hvis muskel AChRs har ingen tilsvarende nerve terminal (er det også vigtigt at have andre NMJs med mærkede neuroner i samme område af fokus, så man kan være sikker på den manglende nerve terminal er ikke bare på grund af poor-antistof penetration i denne region af muskel).
    7. Identificere hver enkelt NMJ som formere innerveret hvis der er mere end én pre-terminal Axon innerverer en individuel NMJ (dette indikerer, at der har været en vis grad af denervering og sandsynlige forsøg på reinnervation på dette kryds).
    8. Identificere hvert NMJ så tynde skiver innerverede hvis NMJ har fuldstændig overlapning mellem nerve terminal og underliggende AChRs men har en tynd pre-terminal Axon (også det er tegn på en vis grad af denervering og forsøg på reinnervation).
    9. Foretage analyse for hver af de 3 identificerede regioner for alle ovennævnte NMJ kategorier for hvert dyr. Gennemsnittet af data fra hvert dyr med resultater fra andre dyr fra samme forsøgsgruppe. Ca. 200-300 kryds i rotte hemi-mellemgulvet muskler og 150-200 i muse hemi-membran skal kvantificeres i mindst 3 (helst 5-6 eller mere) dyr pr forsøgsgruppe.
    10. Opnå høj opløsning konfokale billeder, brugd til offentliggørelse, med en konfokal mikroskop.
    11. Opnå Z-stakke på 0,3 um trinstørrelse i 20-40 um dybder, og indsamle yderligere optiske sektioner over og under hvert forbindelsessted at sikre, at hele synaptiske profil er inkluderet.
    12. Brug erhvervelse software til at rekonstruere z-serien billeder i maksimal intensitet fremskrivninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voksne Sprague-Dawley rotter modtog enten laminektomi kun (ubeskadigede kontrol) eller ensidig hemi-kontusion SCI på C4 rygmarven niveau 10-12. Ved 5 uger efter kirurgi, indspillet peak CMAP amplituden fra hemi-membranen ipsilaterale til laminektomi / læsionsstedet blev reduceret betydeligt i SCI rotter (figur 2C) sammenlignet med laminektomi-only kontrol (figur 2B). Alle NMJs i hemi-membranen var fuldstændig intakt i kontrol ikke sygdomsangrebne vildtype-rotter (figur 4A, C). Tværtimod SOD1 G93A rotter (en gnaver model af ALS) viste signifikant patologi ved hemi-membran NMJs (figur 4B), herunder komplet denervering (figur 4G, pilespids), delvis denervering (figur 4E, pilespids, figur 4G, NMJ på højre), flere innervation (figur 4D) og tynde præ-terminale axoner (figur 4F, pilespids).

Figur 1
Figur 1: CMAP elektrodeplacering. Jordelektroden placeres subkutant i halen. Referenceelektroden anbringes i maven. Overfladen optagelse elektrode anbringes på tværs langs den ensidige ribbenskurvaturen. Stimulerende elektroder er afbildet som både rød og sort. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Cmap optagelser og analyse (A) Amplituden af CMAP respons kan måles fra baseline til top. En typisk CMAP respons skal vise både stimulus artefaktog respons kurve. (B - C) Repræsentative gennemsnitlige Cmap svar. Stimulering bør udføres mindst ti på hinanden følgende gange for at opnå en gentagen gennemsnit af svaret. Vist her er en laminektomi kun skadede rotte (B) og en sammenligning af CMAP reaktioner for en skadet rotte, der har modtaget en ensidig C4 hemi-kontusion (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Fremstilling af membran til hel-mount-farvning. Insekt stifter bør placeres i det omgivende væv for at fastgøre hemi-membran til Sylgard. Undgå at placere stifter ind i musklen selv. I dette billede, er begge hemi-membran muskler vist og holdt nede SEPAfor sig. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: NMJ fænotyper. Konfokal billeddannelse blev udført for at visualisere postsynaptiske acetylcholin receptorer (i rødt mærket med rhodamin-konjugeret α bungarotoxin) og axonale fibre og præsynaptiske terminaler (i grøn mærket med SMI-32 og SV2 antistoffer, henholdsvis). Alle NMJs i hemi-membran var fuldstændig intakt i kontrol ikke-syge vildtype rotter (A, C). Tværtimod SOD1 G93A rotter (en gnaver ALS model) viste signifikant patologi ved hemi-membran NMJs (B), herunder komplet denervering (G, pilespids), delvis denervering (E, pilespids; G (D) og tynde præ-terminale axoner (F, pilespids). Membranen musklen er opdelt i tre separate afsnit for NMJ morfologi analyse (H) 13. Målestok:. 25 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som åndedrætsfunktionen er kompromitteret i både traumatisk SCI og ALS, udvikle behandlinger, der er målrettet vejrtrækning og specifikt membran innervation er klinisk relevant 5,6. For at omfattende undersøgelse respiratoriske funktion, bør en kombineret fremgangsmåde metode anvendes. CMAP'er måle graden af funktionel innervation af membranen ved hjælp af ekstern phrenic nerve stimulation, men ikke endogent bulbospinal respiratorisk drive 8. Hertil kommer, at disse optagelser ikke mulighed for undersøgelse af morfologiske ændringer på NMJ, især på de enkelte motordrevne axoner og postsynaptiske acetylcholin receptorer. Ved at bruge den beskrevne farvningsprotokol, kan man kvantitativt vurdere relevante morfologiske fænotyper som fuldstændig denervering, delvis denervering og endda regenerativ spiring og reinnervation på de enkelte NMJs af mellemgulvet musklen 9.

Alligevel disse to protocols stadig ikke fuldt indfange alle aspekter af respiratorisk patologi. For eksempel, hvis skaden sker til de faldende bulbospinal axoner uden skader på PhMN poolen eller phrenic nerve, CMAP amplituder kan stadig blive vist normalt, selvom der er en betydelig forringelse i dette kredsløb, fordi phrenic nerve eksternt stimuleret 14. Vigtigere, behøver CMAP'er ikke mulighed for måling af endogen supraspinale respiratorisk drive. Desuden har CMAP'er ikke tilvejebringe et mål for den samlede ventilation. Det kan være en fordel at foretage, for eksempel, at hele kroppen plethysmografi undersøge overordnede vejrtrækning adfærd og spontane intra-muskulære EMG optagelser og phrenic nerve optagelser til at teste endogen PhMN aktivering. Desuden kan andre metoder såsom måling af blod gas niveauer give vigtige oplysninger om åndedrætsfunktionen 15. Det kan også være muligt at anvende den beskrevne membran CMAP optagelse teknik til motorenhed nummer estimering16, selvom vi aldrig har forsøgt dette. Det er også vigtigt at bemærke, at disse to protokoller blev beskrevet for kun én respiratorisk muskel, mellemgulvet. Men der er andre inspiratoriske og eksspiratoriske respiratoriske muskler såsom intercostals som kan studeres, og som er ramt af sygdomme som SCI og ALS.

I denne protokol, beskriver vi mellemgulvet CMAP og NMJ analyse specifikt i rotte-modellen. Ligheder mellem rotter og mus gør overførsel af både disse teknikker til mus ligetil. Vi har tidligere vist, at delvist tab af PhMNs efter livmoderhalskræft kontusion SCI fører til kvantificerbare fald i mellemgulvet CMAP amplitude, der korrelerer med morfologisk NMJ denervering. Vi har endvidere påvist disse underskud i både mus og rotter 17 10-12 SCI-modeller. Derudover har vi vist kvantificerbar membran CMAP reduktion i både mus 18 og rotte 13,19 modeller af ALS ( G93A model), der er forbundet med mere subtile membran denervering ved PhMNs forhold til cervikal SCI, og vi har vist, at vi kan påvise relativt mindre terapeutiske virkninger på CMAP amplituden af indgreb såsom stamcelletransplantation i disse ALS modeller 19 . Kollektivt, disse resultater viser nytten af ​​at anvende disse analyser til kvantitativt at vurdere både funktionel og morfologisk vurdering af mellemgulvet innervation af PhMNs i både rotte og musemodeller af SCI og ALS.

Ved at kombinere den histologiske og funktionelle teknikker beskrevet i denne protokol til at undersøge vejrtrækning og innervation på NMJ, bedre indsigt kan opnås i nervesystemet sygdomme forbundet med membran dysfunktion, hvilket giver større bevidsthed om, hvordan man kan målrette behandlinger i dyremodeller og i sidste ende hos patienter .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Fisher T353-500 Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4
1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0.1 M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Concentration 1:400
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 Concentration 1:1,000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1 Roche 3117731001 Concentration 1:100
Silicone rubber Sylgard, Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium Vector laboratories H-1000 This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51
Software for CMAP recordings Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes Natus neurology 019-409000
Subdermal needle electrodes Natus neurology 019-453100
Conductive gel Aquasonic 122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings BioAMP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
  2. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  3. Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
  4. Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
  5. Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
  6. Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
  7. Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
  8. Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
  9. Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
  11. Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
  12. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  13. Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
  14. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  15. Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
  16. Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
  17. Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
  18. Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
  19. Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).

Tags

Neurovidenskab Compound muskel handling potentiale phrenic motor neuron phrenic nerve mellemgulvet innervation denervering spiring neuromuskulære junction NMJ rygmarvsskader SCI amyotrofisk lateral sklerose ALS respiratorisk funktion
Funktionel og Morfologisk vurdering af Membran innervation af phrenic Motor neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Li, K., Wright, M. C.,More

Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52605, doi:10.3791/52605 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter