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Neuroscience

मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन्स द्वारा डायाफ्राम INNERVATION के कार्यात्मक और morphological आकलन

Published: May 25, 2015 doi: 10.3791/52605
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, Farber Institute for Neurosciences, Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University, 2Department of Biology, Arcadia University

Introduction

Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) के ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स और फलस्वरूप मांसपेशी पक्षाघात दोनों की हानि के साथ जुड़े एक दुर्बल करने वाली मोटर न्यूरॉन बीमारी है। निदान पर, मरीज ​​अस्तित्व औसत केवल 2-5 साल 1 पर है। मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन (PhMN) हानि ए एल एस के रोगजनन का एक महत्वपूर्ण घटक है। मरीजों को अंततः कारण डायाफ्राम की PhMN विन्यास, प्रेरणा 2,3 के प्राथमिक पेशी के नुकसान के लिए मर जाते हैं। घाव रीढ़ की हड्डी में चोट (एससीआई) ने भी जुड़े साँस लेने में कठिनाई के साथ एक गंभीर समस्या है। एससीआई के लगभग 12,000 नए मामले की वजह से रीढ़ की हड्डी के लिए दर्दनाक क्षति के लिए हर साल 4 से होते हैं। स्थान, प्रकार और गंभीरता के संबंध में रोग विविधता के बावजूद, एससीआई मामलों के बहुमत अक्सर दुर्बल और लगातार सांस समझौता में जो परिणाम ग्रीवा रीढ़ की हड्डी, को आघात शामिल है। ए एल एस और एससीआई के अलावा, अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों डब्ल्यू संबद्ध किया जा सकताith मध्यपटीय सांस की शिथिलता 5,6।

मध्यच्छद तंत्रिका ipsilateral हेमी-डायाफ्राम innervates कि एक अपवाही मोटर तंत्रिका है और कहा कि ipsilateral ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की सी 3-सी 5 के स्तर में स्थित PhMN सेल शरीर से निकलती है। PhMN उत्पादन व्याख्यान चबूतरे उदर सांस समूह (rVRG) 7 के रूप में जाना एक क्षेत्र में brainstem से bulbospinal इनपुट उतरते द्वारा नियंत्रित किया जाता है। rVRG-PhMN-डायाफ्राम सर्किट नि: श्वसन साँस लेने की है, साथ ही अन्य गैर-जीवन रक्षक प्रणाली डायाफ्राम व्यवहार के नियंत्रण के लिए केंद्रीय है। इस circuitry के प्रभावित करने वाले विभिन्न दर्दनाक चोटों और neurodegenerative विकारों श्वसन समारोह और जीवन के मरीज की गुणवत्ता में एक गहरा गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। डायाफ्राम neuromuscular जंक्शन (NMJ) में rVRG, PhMN अस्तित्व, मध्यच्छद तंत्रिका अखंडता और उचित विन्यास से PhMNs के लिए इनपुट उतरते सामान्य डायाफ्राम समारोह के लिए सभी आवश्यक हैं। यह तकनीक काम करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है किमात्रात्मक ए एल एस, एससीआई और अन्य सीएनएस रोगों के कृंतक मॉडल में vivo में इस सर्किट का मूल्यांकन कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल के साथ, लक्ष्य electrophysiological और रूपात्मक दोनों स्तरों पर डायाफ्राम की PhMN विन्यास का आकलन करने के लिए प्रायोगिक उपकरणों का वर्णन करने के लिए है। यौगिक मांसपेशियों कार्रवाई क्षमता (CMAPs) एक दिया मोटर तंत्रिका के सभी अपवाही मोटर न्यूरॉन एक्सोन उत्तेजक और फिर लक्ष्य myofibers का हासिल विध्रुवण प्रतिक्रिया का विश्लेषण करके दर्ज कर रहे हैं। इस तकनीक PhMNs 8 से हेमी-डायाफ्राम के कार्यात्मक स्फूर्तिदान यों के लिए anesthetized चूहों और चूहों में vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है। कारण CMAPs हेमी-डायाफ्राम पूरे, यह भी बीमारी को ट्रैक करने के क्रम में डायाफ्राम NMJ पर अलग-अलग मोटर axons और myofibers की phenotypes के जांच करने के लिए उपयोगी है सब (या कम से कम कई / सबसे) myofibers के साथ रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं तथ्य यह है कि - और इस तरह के आंशिक और comple के रूप में चिकित्सा-प्रासंगिक morphological परिवर्तनते वितंत्रीभवन, पुनर्जन्म का अंकुरण और reinnervation। यह पेशी 9 भर में अलग-अलग NMJs की विस्तृत रूपात्मक आकलन के द्वारा पीछा किया, डायाफ्राम के पूरे माउंट immunohistochemistry (आईएचसी) के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। CMAPs का मेल और NMJ विश्लेषण मात्रात्मक सीएनएस और पीएन रोग के कृंतक मॉडल में मध्यपटीय विन्यास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रक्रिया थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है और (86/609 / EEC और 87-848 / ईईसी 2010/63 / यूरोपीय संघ,) यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक, के लिए एनआईएच गाइड के अनुपालन में आयोजित की गई देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग, और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में जानवरों के इस्तेमाल पर तंत्रिका विज्ञान की नीतियों के लिए सोसायटी।

1. यौगिक स्नायु कार्रवाई क्षमता (CMAPs)

  1. पशु की तैयारी:
    1. इंजेक्शन (Ketamine, xylazine, acepromazine) प्रभाव के लिए या द्वारा वितरित 1-2% से कम एक inhalant (isoflurane) का उपयोग कर चूहा anesthetize। Ketamine का 95.0 मिलीग्राम / किग्रा, 10.0 मिलीग्राम / xylazine किलो, 0.075 मिलीग्राम / acepromazine किलो प्रकार है: इंजेक्शन संज्ञाहरण की खुराक है।
      नोट: हम सफलतापूर्वक दोनों inhalant का उपयोग करें और इस CMAP रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल का आयोजन जब इंजेक्शन संवेदनाहारी कोई वरीयता के साथ, दृष्टिकोण।
    2. पशु उपयुक्त एक पर बनाए रखा जाना चाहिएसर्जरी से पहले nesthetic गहराई सर्जरी के समापन के माध्यम से शुरू कर दिया है, और पोस्ट ऑपरेटिव buprenorphine तक प्रभाव में ले लिया है। एक वापसी प्रतिक्रिया हासिल नहीं है कि निर्धारित करने के लिए संक्षिप्त पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें। इसके अतिरिक्त, एक कपास झाड़ू के साथ कॉर्निया पलटा परीक्षण। शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, दिल की दर और श्वसन दर संवेदनाहारी गहराई भी प्रकाश हो गया है कि पता चलता है, जो वृद्धि नहीं हुई है कि निर्धारित करते हैं।
    3. संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए पशु की आंखों पर एक पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
    4. सर्जन सर्जरी की शुरुआत से पहले एक कीटाणुनाशक (chlorhexidine हाथ धोने) के साथ / उसके हाथ उसे धोने चाहिए। सर्जन बाँझ दस्ताने, facemask, और गाउन या साफ प्रयोगशाला कोट पहनना चाहिए। सभी उपकरणों धोया और सर्जरी से पहले autoclaved किया जाना चाहिए। कि नसबंदी पूरा हो गया है सत्यापित करने के लिए उपकरणों के स्तर पर autoclaving से पहले उपकरण किट के अंदर एक नसबंदी सूचक पट्टी जोड़ें। सर्जन चाहिएपट्टी पर पूरी लाइन की सर्जरी की शुरुआत से पहले काला है सत्यापित करें कि। के रूप में अच्छी तरह से आटोक्लेव टेप का संकेत के साथ बॉक्स के बाहर टेप। सर्जरी एक ही दिन में कई जानवरों पर प्रदर्शन किया जा रहा है, सर्जरी के बीच उपकरणों को साफ और एक गिलास मनका अजीवाणु में बाँझ। यदि आवश्यक हो, एक बाँझ hemostat के साथ साधन को दूर करने, उचित समय के लिए अजीवाणु में साधन की संभाल रखकर एक बाँझ क्षेत्र में यह ठंडा है और फिर से कार्यात्मक अंत रखकर गिलास मनका अजीवाणु में साधन के दोनों सिरों बाँझ समय की उचित अवधि के लिए ग्लास मनका अजीवाणु में साधन।
    5. पशु anesthetized है, एक बार नीचे पृष्ठीय सतह के साथ शल्य चिकित्सा बोर्ड पर और इतनी है कि टेप का सामना करना पड़ पेट जगह शल्य चिकित्सा बोर्ड को जानवर की forelimbs सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    6. खोपड़ी के आधार पर शुरुआत उदर सतह दुमदारी दाढ़ी, और midline के दोनों ओर पेट के आसपास के क्षेत्र श है कि यह सुनिश्चित करने केaved हेमी-डायाफ्राम दर्ज की जा रही है जिस पर निर्भर करता है। त्वचा की मुंडा की सतह के लिए povidone आयोडीन लागू करें।
  2. CMAP रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी:
    1. पूंछ में पशु तैयारी, जगह जमीन इलेक्ट्रोड subcutaneously निम्न (चित्रा 1)।
    2. प्रतिपक्षी कम पेट क्षेत्र में संदर्भ इलेक्ट्रोड subcutaneously रखें।
    3. स्वयं चिपकने वाला सतह पट्टी या डिस्क रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (सतह पट्टी इलेक्ट्रोड के आयाम: 0.5 एक्स 3 सेमी) पर प्रवाहकीय जेल प्लेस, और फिर एकतरफा तटीय मार्जिन के साथ transversely सतह इलेक्ट्रोड रखें।
    4. Transcutaneously 0.5 सेमी अलग श्वासनली के लिए पार्श्व और हंसली के लिए बेहतर उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखें। त्वचा के माध्यम से लगभग 1.0 सेमी गहरे इलेक्ट्रोड डालें। उनके स्थान बाद में stimulations के साथ कदम नहीं करता है, ताकि हाथ से इलेक्ट्रोड सुरक्षित।
      नोट: insertio के स्थल पर त्वचा के लिए 90 ° सापेक्ष कोण उत्तेजक इलेक्ट्रोडएन।
  3. यौगिक स्नायु संभावित कार्रवाई (CMAP) रिकॉर्डिंग:
    1. कंप्यूटर सहायता डेटा विश्लेषण के बाद एक उत्तेजक / एम्पलीफायर का उपयोग electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करते हैं।
    2. एकल पुल उत्तेजना की उत्तेजना मापदंडों 0.5 मिसे, 1.0 हर्ट्ज supramaximal दालों होना चाहिए। उत्तेजना के आयाम वी 6.0 के बीच और 8.0 (2A चित्रा) होना चाहिए।
      नोट: एक प्रयोग के भीतर, जानवरों भर में एक ही आयाम के साथ एक उत्तेजना तीव्रता का उपयोग करें। उद्देश्य उत्तेजना के न्यूनतम आयाम का उपयोग करके प्रतिक्रिया आयाम को अधिकतम है। यह उत्तेजना के समय पर होता है कि प्रारंभिक प्रतिक्रिया एक उत्तेजना विरूपण साक्ष्य है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, देखभाल फिर तेजी से CMAP प्रतिक्रिया द्वारा पीछा किया जाता है, जो उत्तेजना विरूपण साक्ष्य, के बाद एक स्थिर / फ्लैट आधारभूत से पहले है कि एक CMAP प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए। ऐसी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए आदेश में, यह उत्तेजना का स्थान बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है और / यारिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड।
    3. Stimulations के बीच 30 सेकंड प्रतीक्षा करें, और औसत प्रतिक्रिया (चित्रा 2 बी - सी) प्राप्त करने के लिए एक पंक्ति में 10 stimulations के दोहराएँ। शिखर (2A चित्रा) के लिए आधारभूत से आयाम को मापने। मध्यच्छद तंत्रिका / डायाफ्राम सक्रिय नहीं है जब जानवर की श्वसन चक्र के चरण के दौरान मध्यच्छद तंत्रिका उत्तेजना आचरण। प्रक्रिया प्रतिपक्षी हेमी-डायाफ्राम के लिए एक ही जानवर पर दोहराया जा सकता है।
    4. NMJ धुंधला आयोजित किया जाएगा यदि अंतिम CMAP रिकॉर्डिंग सत्र के बाद, पशु छिड़कना। लगभग एक बार में एक ही जानवर पर बार-बार हर हफ्ते CMAP रिकॉर्डिंग आचरण (या पसंद के अंतराल पर)।
    5. अस्तित्व CMAP रिकॉर्डिंग के बाद, जानवर जाग और sternally लेटा हुआ जब तक वसूली के दौरान एक परिसंचारी गर्म पानी हीटिंग पैड पर ठीक है, और लगातार नजर रखने के लिए अनुमति देते हैं। पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक जानवर वापस नहीं है। </ ली>
    6. एक बार जब sternally लेटा हुआ, पशु पहले 48 घंटा (एक बार दैनिक उसके बाद) के लिए हर 12 घंटे की निगरानी। (साइटों घुमाया साथ, इंजेक्शन प्रति 1-2 मिलीलीटर;; subcutaneously Lactated ringers के समाधान के 2 दिन प्रति बार) पशु निर्जलित (झूलता हुआ त्वचा, उदास) प्रतीत होता है, तरल पदार्थ के लिए प्रशासन शल्य चिकित्सा के बाद वजन और द्रव नुकसान स्थिर तक। वे तार बार ढक्कन फीडर तक पहुँच नहीं कर सकते, तो खाने को प्रोत्साहित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो तीव्र पोस्ट ऑपरेटिव अवधि के दौरान छोटे बर्तन में नरम भोजन के साथ जानवरों प्रदान करें।
    7. सर्जरी के अंत से पहले 0.05 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक पर buprenorphine प्रशासन और फिर 12 घंटे के अंतराल पर पहले 24 घंटे के लिए (और उसके बाद दर्द / तनाव के लक्षण पर निर्भर) चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से (साइट घुमाया)। दर्द या संकट के लक्षण उसके बाद गौर कर रहे हैं, buprenorphine साथ पशुओं का इलाज। संकेत दर्द / संकट के लक्षण श्रम का अभाव, vocalizations, भोजन की कमी या पीने (निर्जलीकरण), अत्यधिक वजन घटाने, रखवाली, exc शामिलgnawing या चीरा के स्थल पर scratching essive। दर्द और संकट को निर्धारित करने में इस्तेमाल किया अतिरिक्त मापदंड बाहरी उत्तेजनाओं को unresponsiveness, क्षणिक या अकारण वोकलिज़ेशन, परिश्रम या असामान्य श्वास, लगातार लाल-भूरे रंग Naso-occular मुक्ति, चिह्नित piloerection शामिल हैं। इसके अलावा बीमार जानवरों का सुझाव होगा कि खराब स्वास्थ्य के सबूत की निगरानी। पशु अभी भी इलाज के 72 घंटे के बाद संकट में हो मनाया जाता है जानवर euthanize (ऊपर की रूपरेखा तैयार दर्द / तनाव मापदंड के अनुसार, और प्राप्त करने के बाद एनाल्जेसिक प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है)।

2. डायाफ्राम neuromuscular जंक्शन (NMJ) विश्लेषण

  1. पशु विच्छेदन:
    1. पशु इंजेक्शन संज्ञाहरण की अधिक मात्रा प्रशासन (:; intraperitoneally प्रशासित 0.225 मिलीग्राम / किग्रा में 30.0 मिलीग्राम / किग्रा, acepromazine में 285.0 मिलीग्राम / किग्रा, xylazine पर ketamine 3 बार से ऊपर का इस्तेमाल किया खुराक)। अधिक मात्रा के बाद, सभी जानवरों टी इच्छामृत्यु (thoracotomy) का एक दूसरा तरीका होना चाहिएहे मृत्यु सुनिश्चित करते हैं। मौत हृदय और सांस की गिरफ्तारी को देख कर और जानवर की तय की और फैली हुई विद्यार्थियों टिप्पण द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए।
    2. स्केलपेल या विच्छेदन कैंची दुमदारी midline के साथ zyphoid प्रक्रिया से छांटना देने के साथ एक laparotomy आचरण। ध्यान से स्केलपेल और संदंश का उपयोग अंतर्निहित मांसपेशियों से त्वचा और संयोजी ऊतक अलग।
    3. Zyphoid प्रक्रिया पर खींच जबकि, डायाफ्राम हड्डी आसपास के साथ जुड़ा रहता है यह सुनिश्चित करना कि पूरे डायाफ्राम दूर करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। यह पूरे डायाफ्राम के सफल विच्छेदन के लिए अनुमति देगा, डायाफ्राम की मांसपेशियों को नुकसान को रोकने जाएगा और बाद में धुंधला के लिए मांसपेशियों को साफ करने में सहायता करेगा के रूप में यह महत्वपूर्ण है।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो इस बिंदु पर, पशु perfused किया जा सकता है।
  2. साफ सफाई और डायाफ्राम के धुंधला:
    1. पूरे विच्छेदित डायाफ्राम नीचे पिन, बेहतर सतह एक गिलास 100 मिमी पेट्री डिश में में सिलिकॉन रबर के लिए, ऊपर का सामना करना पड़एक stereomicroscope का उपयोग कर 20 मिनट के लिए - 4% paraformaldehyde (पीबीएस 1% फॉस्फेट में किए गए खारा बफर)। यह तना हुआ बनाने के लिए डायाफ्राम खिंचाव, और कीट पिन का उपयोग कर, डायाफ्राम मांसपेशियों में ही (चित्रा 3) लगाए से बचने के लिए आसपास के ऊतकों को नीचे पिन।
    2. ध्यान से # 5 संदंश और छोटे कैंची के साथ पेशी के केवल बेहतर सतह से संयोजी ऊतक को साफ।
      नोट: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट इस धुंधला प्रोटोकॉल धीरे-धीरे प्रकाश से कवर कमरे के तापमान पर कमाल के बाद के सभी चरणों को पूरा। डायाफ्राम मांसपेशियों हमेशा पूरी तरह से बाहर सुखाने से बचने के लिए तरल में डूबे हुए है कि सुनिश्चित करें।
    3. (0.2 1x पीबीएस, 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) / पीबीएस, बीएसए / पीबीएस, 4% paraformaldehyde के 1x पीबीएस में (पीएफए), और 0.2% TBP 2% में की गई 0.1 एम ग्लाइसिन: पहले धुंधला करने के लिए, सभी आवश्यक अभिकर्मकों को तैयार 2% बीएसए / पीबीएस) में% ट्राइटन X100। -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल शांत पूर्व करना सुनिश्चित करें।
    4. 1X पीबीएस में 10 मिनट के लिए धो 3x।
    5. 2 में किए गए 0.1 एम ग्लाइसिन (में सेते% BSA के 30 मिनट के लिए / पीबीएस)।
    6. 15 मिनट के लिए RBTX (rhodamine संयुग्मित α-bungarotoxin) समाधान में सेते हैं। इस प्रकार के रूप RBTX के लिए समाधान है: rhodamine-संयुग्मित अल्फा bungarotoxin 1: 1x पीबीएस में 400 कमजोर पड़ने।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, Rhodamine प्रयोग किया जाता है, लेकिन पसंद के किसी भी फ्लोरोफोरे धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    7. 1X पीबीएस में 10 मिनट के लिए धो 3x।
    8. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में, 5 मिनट के लिए MeOH साथ सेते हैं।
      नोट: ठंडे बस्ते में पेशी रखने से पहले MeOH जोड़ने के लिए, और तुरंत ऊष्मायन अवधि के बाद समाधान न निकालें।
    9. 1X पीबीएस में 10 मिनट के लिए धो 3x।
    10. 1 घंटे के लिए 0.2% TBP में ब्लॉक (0.2% ट्राइटन 2% बीएसए / पीबीएस में किए गए)।
    11. कमाल है, जबकि 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (0.2% में TBP) के साथ सेते हैं। एंटीबॉडी के dilutions इस प्रकार है: SV2 (1:10) और SMI-312 (1: 1000)।
    12. 0.2% TBP के साथ 10 मिनट के लिए 3x धो लें।
    13. FGM1 (FITC संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी के 100 कमजोर पड़ने: 1 का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते1; 1 घंटे के लिए कमाल की है, जबकि 0.2% TBP) में बनाया है।
      नोट: धुंधला के लिए प्रोटोकॉल के आराम के लिए प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    14. 1x पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए धो 3x।
    15. पुन: स्वच्छ पूर्व बढ़ते और coverslipping को पेशी के बेहतर (ऊपर देखें) सतह पर संयोजी ऊतक आसपास।
      नोट: यह साफ है और फिर धुंधला के बाद तुरंत नमूना माउंट करने के लिए सिफारिश की है। हालांकि आवश्यक है, नमूना 1x पीबीएस में कवर किया जा सकता है, तो, वाष्पीकरण को रोकने के लिए parafilm में लपेटा और दैनिक पीबीएस के बदलने के साथ, 1 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
    16. गिलास स्लाइड, गैर hardset Vectashield के साथ coverslip पर बढ़ते पर। बाहर सुखाने को रोकने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील। लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में गत्ता स्लाइड फ़ोल्डर में फ्लैट झूठ बोल दुकान स्लाइड्स।
  3. विश्लेषण और confocal इमेजिंग:
    1. मात्रात्मक दाग की आकृति विज्ञान का विश्लेषण और एक ईमानदार epifluorescence का उपयोग कर 20X और 40x बढ़ाई के तहत अर्ध-डायाफ्राम घुड़सवारमाइक्रोस्कोप।
      नोट: डायाफ्राम से सना हुआ और एक पूरे माउंट फैशन में विश्लेषण किया गया है, क्योंकि मांसपेशी काफी मोटी है। एक स्थिर छवि गैर confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया जाता है जब नतीजतन, प्रतिदीप्ति धुंधला की सबसे पूरी तरह से ध्यान से बाहर है। इस कारण से, यह है कि यह आप लगातार ठीक से व्यक्तिगत NMJs में से प्रत्येक की आकृति विज्ञान की पहचान करने के लिए "ऊपर" और "नीचे" मांसपेशियों के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है के रूप में माइक्रोस्कोप पर वास्तविक समय में NMJ विश्लेषण का संचालन करने के लिए सबसे अच्छा है। वे बाद synaptic रिसेप्टर समूहों के लिए स्थानिक संबंध में ऊतक के माध्यम से कदम के रूप में इस दृष्टिकोण का प्रयोग, एक बड़ी आसानी से अलग-अलग मोटर axons की प्रक्षेपवक्र का पालन कर सकते हैं।
    2. पेशी के उदर-टू-पृष्ठीय लंबाई मापने के द्वारा, विशिष्ट रीढ़ की हड्डी का स्तर (चित्रा 4H) से स्थलाकृतिक स्फूर्तिदान पैटर्न के आधार पर विश्लेषण के लिए 3 अलग अलग वर्गों में पेशी विभाजित करते हैं।
    3. मांसपेशियों और बढ़ के उदर क्षेत्र में शुरूपीछे की ओर आईएनजी, सतह मांसपेशी फाइबर पर स्थित चेहरे NMJs एन सब का विश्लेषण। RBTX वजह से लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया बड़ा एंटीबॉडी की तुलना में विष के छोटे आकार की मांसपेशी में बहुत गहरे प्रवेश (कारण गरीब एंटीबॉडी प्रवेश करने के लिए व्याख्या मुश्किल हो सकता है के रूप में गहरी सतह से पहले 3-4 तंतुओं से मांसपेशियों तंतुओं का विश्लेषण न करें न्यूरॉन्स)।
    4. न्यूरॉन के पूर्व टर्मिनल अक्षतंतु व्यास में मोटी है और तंत्रिका टर्मिनल के सभी क्षेत्रों को पूरी तरह से अंतर्निहित मांसपेशियों acetylcholine रिसेप्टर्स (AChRs) के साथ ओवरलैप यदि अक्षुण्ण रूप में प्रत्येक NMJ को पहचानें।
    5. अंतर्निहित मांसपेशियों AChRs के किसी भी क्षेत्र तंत्रिका टर्मिनल इसी के साथ खाली है यदि आंशिक रूप से denervated के रूप में प्रत्येक NMJ को पहचानें।
    6. के रूप में पूरी तरह से denervated प्रत्येक NMJ पहचानें अगर पेशी AChRs है कोई इसी तंत्रिका टर्मिनल (एक तंत्रिका टर्मिनल की कमी की वजह से बस नहीं है सुनिश्चित कर सकते हैं कि यह ऐसा है, ध्यान की एक ही क्षेत्र में लेबल न्यूरॉन्स के साथ अन्य NMJs पास करने के लिए भी महत्वपूर्ण है पूआर पेशी के लिए उस क्षेत्र में एंटीबॉडी पैठ)।
    7. एक से अधिक पूर्व टर्मिनल अक्षतंतु innervating एक व्यक्ति NMJ (यह इस जंक्शन पर वितंत्रीभवन और reinnervation की संभावना के प्रयास के कुछ स्तर की हुई है कि इंगित करता है) अगर वहाँ प्रत्येक NMJ के रूप में गुणा innervated को पहचानें।
    8. के रूप में बारीकी NMJ तंत्रिका टर्मिनल और अंतर्निहित AChRs के बीच पूर्ण ओवरलैप है, लेकिन एक पतली पूर्व टर्मिनल अक्षतंतु है अगर innervated प्रत्येक NMJ (यह भी reinnervation पर वितंत्रीभवन और प्रयास के कुछ स्तर का संकेत है) को पहचानें।
    9. प्रत्येक जानवर के लिए ऊपर NMJ सभी श्रेणियों के लिए 3 पहचान क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए विश्लेषण का संचालन। एक ही प्रयोगात्मक समूह से अन्य जानवरों से परिणामों के साथ प्रत्येक जानवर से डेटा औसत। माउस हेमी-डायाफ्राम में चूहे हेमी-डायाफ्राम मांसपेशियों और 150-200 में लगभग 200-300 जंक्शनों प्रायोगिक समूह के अनुसार कम से कम 3 (अधिमानतः 5-6 या अधिक) पशुओं में मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए।
    10. उच्च संकल्प confocal छवियों को प्राप्त करते हैं, का उपयोगएक confocal खुर्दबीन के साथ प्रकाशन के लिए विकास,।
    11. 20-40 माइक्रोन गहराई के लिए 0.3 माइक्रोन कदम आकार में जेड के ढेर प्राप्त है, और पूरे अन्तर्ग्रथनी प्रोफाइल शामिल है जो सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और प्रत्येक जंक्शन नीचे अतिरिक्त ऑप्टिकल वर्गों इकट्ठा।
    12. अधिकतम तीव्रता के अनुमानों में जेड श्रृंखला छवियों को फिर से संगठित करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।

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Representative Results

वयस्क Sprague-Dawley चूहों सी 4 रीढ़ की हड्डी स्तर 10-12 में या तो laminectomy के केवल (रिहाई का नियंत्रण) या एकतरफा हेमी-कुचलन एससीआई प्राप्त किया। 5 हफ्तों के बाद सर्जरी में, शिखर CMAP आयाम से दर्ज हेमी-डायाफ्राम काफी laminectomy के केवल नियंत्रण (चित्रा 2 बी) की तुलना में एससीआई चूहों (चित्रा -2) में कम हो गया था laminectomy / चोट साइट पर ipsilateral। हेमी-डायाफ्राम के सभी NMJs नियंत्रण गैर रोगग्रस्त जंगली प्रकार चूहों (चित्रा -4 ए, सी) में पूरी तरह से बरकरार रहे थे। इसके विपरीत, SOD1 G93A चूहों (ए एल एस के कृंतक मॉडल) पूरा वितंत्रीभवन (चित्रा 4 जी, नोक), आंशिक वितंत्रीभवन सहित अर्ध-डायाफ्राम NMJs (चित्रा 4 बी), कम से महत्वपूर्ण विकृति से पता चला है (चित्रा 4E, नोक, चित्रा 4G, पर NMJ दाएं), कई विन्यास (चित्रा 4D) और पतली पूर्व टर्मिनल एक्सोन (चित्रा 4F, Arrowhead)।

चित्र 1
चित्रा 1: CMAP इलेक्ट्रोड नियुक्ति। जमीन इलेक्ट्रोड पूंछ में subcutaneously रखा गया है। संदर्भ इलेक्ट्रोड पेट में रखा गया है। सतह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड transversely एकतरफा तटीय मार्जिन के साथ रखा गया है। उत्तेजक इलेक्ट्रोड दोनों लाल और काले रंग के रूप में चित्रित कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। CMAP रिकॉर्डिंग और विश्लेषण (ए) CMAP प्रतिक्रिया के आयाम पीक करने के लिए आधारभूत से मापा जा सकता है। एक ठेठ CMAP प्रतिक्रिया प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य दोनों दिखाना चाहिएऔर प्रतिक्रिया वक्र। (बी - सी) प्रतिनिधि औसत CMAP के हिमायती हैं। उत्तेजना प्रतिक्रिया का एक दोहराया औसत प्राप्त करने के लिए कम से कम दस लगातार बार बाहर किया जाना चाहिए। एक laminectomy के केवल रिहाई चूहा (बी) और एक एकतरफा सी 4 हेमी-कुचलन (सी) में प्राप्त किए गए एक घायल चूहे के लिए CMAP प्रतिक्रियाओं की तुलना कर रहे हैं यहाँ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पूरे माउंट धुंधला के लिए डायाफ्राम की तैयारी। कीट पिन Sylgard के लिए अर्ध-डायाफ्राम सुरक्षित करने के लिए आसपास के ऊतकों में रखा जाना चाहिए। मांसपेशी ही में पिंस रखने से बचें। इस छवि में, दोनों अर्ध-डायाफ्राम मांसपेशियों को दिखाया गया है और SEPA नीचे टिकी रहे हैंrately। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: NMJ phenotypes। Confocal इमेजिंग (हरे रंग में क्रमश: SMI के -32 और SV2 एंटीबॉडी के साथ लेबल) और axonal फाइबर और पूर्व synaptic टर्मिनलों (rhodamine संयुग्मित α bungarotoxin के साथ लेबल लाल रंग में) के बाद synaptic acetylcholine रिसेप्टर्स कल्पना करने के लिए आयोजित किया गया। हेमी-डायाफ्राम के सभी NMJs नियंत्रण गैर रोगग्रस्त जंगली प्रकार चूहों (ए, सी) में पूरी तरह से बरकरार रहे थे। इसके विपरीत, SOD1 G93A चूहों (एक कृंतक ए एल एस मॉडल) पूरा वितंत्रीभवन (जी, नोक), आंशिक वितंत्रीभवन (ई, नोक सहित अर्ध-डायाफ्राम NMJs (बी), कम से महत्वपूर्ण विकृति दिखाया, जी (डी) और पतली पूर्व टर्मिनल एक्सोन (एफ, नोक)। डायाफ्राम मांसपेशियों उप-विभाजित है NMJ आकृति विज्ञान विश्लेषण (एच) 13 के लिए तीन अलग-अलग वर्गों में। स्केल बार:। 25 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

श्वसन समारोह सांस लेने और विशेष रूप से डायाफ्राम स्फूर्तिदान कि लक्ष्य के उपचारों के विकास, घाव एससीआई और ए एल एस दोनों में समझौता किया है के रूप में चिकित्सकीय 5,6 प्रासंगिक हैं। व्यापक श्वसन समारोह का अध्ययन करने के लिए, एक संयुक्त दृष्टिकोण विधि का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। CMAPs बाहरी मध्यच्छद तंत्रिका उत्तेजना के माध्यम से डायाफ्राम के कार्यात्मक तंत्रिका वितरण की मात्रा को मापने, लेकिन नहीं अंतर्जात bulbospinal श्वसन ड्राइव 8। इसके अलावा, ये रिकॉर्डिंग विशेष रूप से अलग-अलग मोटर axons और बाद synaptic acetylcholine रिसेप्टर्स के स्तर पर, NMJ पर morphological परिवर्तन की परीक्षा के लिए अनुमति नहीं है। वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक मात्रात्मक ऐसे डायाफ्राम मांसपेशियों 9 के व्यक्तिगत NMJs पर पूरा वितंत्रीभवन, आंशिक वितंत्रीभवन और यहां तक कि पुनर्जन्म का अंकुरण और reinnervation के रूप में प्रासंगिक रूपात्मक phenotypes के आकलन कर सकते हैं।

फिर भी, इन दो आद्यकर्नल अभी भी पूरी तरह से सांस की विकृति के सभी पहलुओं पर कब्जा नहीं है। चोट PhMN पूल या मध्यच्छद तंत्रिका करने के लिए किसी भी क्षति के बिना उतरते bulbospinal एक्सोन के लिए होता है अगर उदाहरण के लिए, CMAP आयाम अभी भी मध्यच्छद तंत्रिका बाह्य 14 प्रेरित है क्योंकि इस circuitry में महत्वपूर्ण हानि होती है, भले ही सामान्य दिखाई दे सकते हैं। महत्वपूर्ण बात है, CMAPs अंतर्जात supraspinal सांस की ड्राइव की माप के लिए अनुमति नहीं है। इसके अलावा, CMAPs समग्र वेंटिलेशन का एक उपाय प्रदान नहीं करते हैं। यह संचालन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, उदाहरण के लिए, पूरे शरीर plethysmography अंतर्जात PhMN सक्रियण परीक्षण करने के लिए समग्र सांस लेने व्यवहार और सहज इंट्रा-पेशी ईएमजी रिकॉर्डिंग और मध्यच्छद तंत्रिका रिकॉर्डिंग की जांच करने के लिए। इसके अलावा, इस तरह के मापने रक्त गैस के स्तर के रूप में अन्य तरीकों श्वसन समारोह में 15 के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यह भी मोटर इकाई संख्या के आकलन के लिए वर्णित डायाफ्राम CMAP रिकॉर्डिंग तकनीक को रोजगार के लिए संभव हो सकता है16 है, हालांकि हम इस प्रयास कभी नहीं किया है। यह इन दो प्रोटोकॉल केवल एक ही सांस की पेशी, डायाफ्राम के लिए वर्णित किया गया है ध्यान दें कि यह भी महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस तरह का अध्ययन किया जा सकता है और ऐसी है कि एससीआई और ए एल एस जैसे रोगों से प्रभावित हैं कि intercostals के रूप में अन्य नि: श्वसन और निःश्वास सांस की मांसपेशियों रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे मॉडल में विशेष रूप से डायाफ्राम CMAP और NMJ विश्लेषण का वर्णन है। चूहों और चूहों के बीच समानता सीधा चूहों को इन दोनों तकनीकों के हस्तांतरण कर सकते हैं। हम पहले ग्रीवा कुचलन निम्नलिखित PhMNs के आंशिक नुकसान एससीआई रूपात्मक NMJ वितंत्रीभवन के सापेक्ष होती डायाफ्राम CMAP आयाम में मात्रात्मक कम हो जाती है में परिणाम है कि पता चला है। इसके अलावा, हम दोनों माउस 17 और चूहे 10-12 एससीआई मॉडल में इन घाटों का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, हम दोनों माउस 18 में मात्रात्मक डायाफ्राम CMAP कमी से पता चला है और (ए एल एस के 13,19 मॉडल चूहे 19 में स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के रूप में हस्तक्षेप के CMAP आयाम पर अपेक्षाकृत छोटे उपचारात्मक प्रभाव का पता लगा सकते हैं कि दिखा दिया है कि SOD1 G93A मॉडल) । सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों मात्रात्मक एससीआई और ए एल एस के दोनों चूहा और माउस मॉडल में PhMNs से डायाफ्राम विन्यास के दोनों कार्यात्मक और रूपात्मक मूल्यांकन का आकलन करने के लिए इन विश्लेषण के उपयोग की उपयोगिता प्रदर्शित करता है।

ऊतकीय और NMJ में सांस लेने और तंत्रिका वितरण की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल में विस्तृत कार्यात्मक तकनीक, के संयोजन से बेहतर जानकारी इस प्रकार के रोगियों में अंततः अधिक से अधिक पशु मॉडल में उपचारों को लक्षित करने के बारे में जागरूकता और उपलब्ध कराने, डायाफ्राम रोग के साथ जुड़े तंत्रिका तंत्र के रोगों में प्राप्त किया जा सकता है ।

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Fisher T353-500 Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4
1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0.1 M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Concentration 1:400
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 Concentration 1:1,000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1 Roche 3117731001 Concentration 1:100
Silicone rubber Sylgard, Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium Vector laboratories H-1000 This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51
Software for CMAP recordings Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes Natus neurology 019-409000
Subdermal needle electrodes Natus neurology 019-453100
Conductive gel Aquasonic 122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings BioAMP

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References

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  5. Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
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  7. Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
  8. Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
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  19. Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 99 यौगिक मांसपेशियों कार्रवाई की क्षमता मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन मध्यच्छद तंत्रिका डायाफ्राम विन्यास वितंत्रीभवन अंकुरण neuromuscular जंक्शन NMJ रीढ़ की हड्डी में चोट एससीआई Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस ए एल एस श्वसन समारोह
मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन्स द्वारा डायाफ्राम INNERVATION के कार्यात्मक और morphological आकलन
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Martin, M., Li, K., Wright, M. C.,… More

Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52605, doi:10.3791/52605 (2015).

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