Introduction
Amyotrofisk lateralskleros (ALS) är en försvagande motorneuronsjukdom associerad med förlusten av både övre och undre motoriska neuroner och åtföljande muskelförlamning. Vid diagnos är patientöverlevnad i genomsnitt bara 2-5 år 1. Phrenic motorneuron (PhMN) förlust är en kritisk komponent i patogenesen för ALS. Patienter i slutändan dör på grund av förlust av PhMN innervation av membranet, den primära muskeln inspirations 2,3. Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är också ett allvarligt problem med tillhörande andningssvårigheter. Cirka 12.000 nya fall av SCI inträffar varje år 4 på grund av traumatisk skada på ryggmärgen. Trots sjukdom heterogenitet med avseende på plats, typ och svårighetsgrad, de flesta av SCI fall involverar trauma hals ryggmärgen, vilket ofta resulterar i försvagande och ihållande andningssvårigheter. Förutom ALS och SCI, andra centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar kan associeras wed diafragma andningsdysfunktion 5,6.
Den phrenic nerv är en efferenta motor nerv som innerverar ipsilaterala hemi-membran och som har sitt ursprung från PhMN cellkroppar ligger i C3-C5 nivåer av ipsilaterala hals ryggmärgen. PhMN utgång styrs av fallande bulbospinal input från hjärnstammen i ett område som kallas rostralt ventrala andnings grupp (rVRG) 7. Den rVRG-PhMN-membran kretsen är av central betydelse för kontroll av inandnings andning, liksom andra icke-ventilatoriska membran beteenden. Olika traumatiska skador och neurodegenerativa sjukdomar som påverkar dessa kretsar kan leda till en djup nedgång i lungfunktion och patientens livskvalitet. Fallande ingång till PhMNs från rVRG, PhMN överlevnad, phrenic nerv integritet och korrekt innervation på membran neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är alla nödvändiga för normal membranfunktion. Det är därför viktigt att använda tekniker somkan kvantitativt utvärdera denna krets in vivo i gnagarmodeller av ALS, SCI och andra CNS-sjukdomar.
Med detta protokoll, är målet att beskriva experimentella verktyg för att bedöma PhMN innervation av membranet på både elektrofysiologiska och morfologiska nivåer. Förening muskelaktionspotentialer (CMaps) registreras genom att stimulera alla efferenta motorneuron axoner av en given motor nerv och sedan analysera den framkallade depolarisation respons målet myofibers. Denna teknik kan användas in vivo i nedsövda råttor och möss för att kvantifiera funktionell innervation av hemi-membranet genom PhMNs 8. På grund av det faktum att CMaps representerar samtidig inspelning av alla (eller åtminstone många / de flesta) myofibers i hela hemi-membran, är det lämpligt att även undersöka fenotyper av enskilda motoriska axoner och myofibers på membran NMJ för att spåra sjukdomen - och terapi relevanta morfologiska förändringar såsom partiell och komplette denervering, regenerativ groning och reinnervation. Detta kan åstadkommas via hel-fäste immunohistokemi (IHC) av membranet, följt av detaljerad morfologisk bedömning av enskilda NMJs hela muskeln 9. Kombinera CMaps och NMJ analysen ger en kraftfull metod för att kvantitativt studera diaphragmatic innervation i gnagarmodeller av CNS och PNS sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella förfaranden har godkänts av Thomas Jefferson University institutionella djuromsorg och använda kommitté och genomförs i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådets direktiv (2010/63 / EU, 86/609 / EEG och 87-848 / EEG), NIH Guide för vård och användning av försöksdjur, och Society for Neuroscience: s politik om användning av djur i neurovetenskap Research.
1. Förening Muscle Action Potentials (CMaps)
- Förbereda djuret:
- Söva råttan med hjälp av en inhalator (isofluran) på 1-2% levereras till effekt eller genom injektion (ketamin, xylazin, acepromazin). Doseringen av injicerbara anestesi är följande: 95,0 mg / kg av ketamin, 10,0 mg / kg av xylazin, 0,075 mg / kg av acepromazin.
OBS: Vi använder framgångsrikt både inhalant och injicerbara bedövningsmedel närmar Vid utförande av denna CMAP inspelning protokoll, utan företräde. - Djuret måste upprätthållas på lämplig ennesthetic djup innan operationen påbörjas, genom ingående av kirurgi, och fram till postoperativ buprenorfin har trätt i kraft. Bekräfta korrekt anesthetization av kort tå nypa för att fastställa att ett tillbakadragande svar inte framkallas. Dessutom testar hornhinnans reflex med en bomullspinne. Under det kirurgiska ingreppet, bestämma att hjärtfrekvens och andningsfrekvens inte har ökat, vilket tyder på att anestesidjups har blivit för lätt.
- Applicera en veterinär salva på djurets ögon att förhindra torrhet under narkos.
- Kirurgen bör tvätta henne / händerna med ett desinfektionsmedel (klorhexidin skrubba) innan operationen. Kirurgen bör bära sterila handskar, ansiktsskydd och klänning eller ren labbrock. Alla instrument ska tvättas och autoklaveras före operationen. Lägg en steriliseringsindikatorremsa inuti instrumentsats innan autoklavering vid nivån för de instrument för att verifiera att steriliseringen är fullbordad. Kirurgen börkontrollera att hela linjen på remsan är svart innan operationen. Tejpa på utsidan av lådan med indikerar autoklav band också. Om operation ska utföras på flera djur på samma dag, rengöra instrumenten mellan operationer och sterilisera i en glaspärla autoklav. Om det behövs, sterilisera båda ändarna av instrumentet i glaspärla autoklav genom att placera handtaget på instrumentet i steriliserings för lämplig tidpunkt att ta bort instrumentet med en steril hemostat, kyla den i ett sterilt område och sedan placera den funktionella ände instrumentet i glaspärla autoklav för lämplig tidsperiod.
- När djuret bedövas, kan plats på kirurgisk ombord med dorsalytan ner och buken uppåt så att bandet kan användas för att säkra djurets framben kirurgisk ombord.
- Raka ventrala yta caudally börjar vid basen av skallen, och se till att området runt buken på ömse sidor om mittlinjen är shPARADE beroende på vilken hemi-membranet spelas in. Applicera povidonjod till den rakade ytan av huden.
- Söva råttan med hjälp av en inhalator (isofluran) på 1-2% levereras till effekt eller genom injektion (ketamin, xylazin, acepromazin). Doseringen av injicerbara anestesi är följande: 95,0 mg / kg av ketamin, 10,0 mg / kg av xylazin, 0,075 mg / kg av acepromazin.
- Förberedelser inför cmap inspelningar:
- Efter beredning djur, plats jordelektroden subkutant i svansen (Figur 1).
- Placera referenselektroden subkutant i den kontra nedre delen av buken.
- Placera ledande gel på självhäftande yta remsa eller skiv inspelning elektrod (dimensioner yta bandelektrod: 0,5 x 3 cm) och sedan placera ytelektrod tvären längs den ensidiga kust marginal.
- Placera stimulerande elektroder transkutant 0,5 cm avstånd i sidled till luftstrupen och överlägsna nyckelbenet. Sätt elektroderna ungefär 1,0 cm djup genom huden. Fäst elektroderna för hand, så att deras placering inte rör sig med efterföljande stimuli.
OBS: Vinkel stimulerande elektroder 90 ° i förhållande till huden vid stället för insertion.
- Förening Muscle Action potential (cmap) inspelningar:
- Skaffa elektrofysiologiska inspelningar med en stimulator / förstärkare följt av datorstödd dataanalys.
- Stimulans parametrar enda drag stimulering bör vara 0,5 msek, 1,0 Hz supramaximal pulser. Amplituden för den stimulans bör vara mellan 6,0 och 8,0 V (Figur 2A).
OBS: Inom ett experiment, använd en stimulans intensitet med samma amplitud över djur. Målet är att maximera svars amplitud genom att använda den minimala amplituden hos stimuleringen. Det är viktigt att notera att den första svar som sker vid tidpunkten för stimulering är en stimulerings artefakt. Dessutom bör försiktighet iakttas för att erhålla ett CMAP svar som föregås av en stabil / platt baslinje efter stimulering artefakt, som sedan följs av den snabba CMAP svaret. För att erhålla ett sådant svar, kan det vara nödvändigt att flytta stimulering och / ellerregistreringselektrod. - Vänta 30 sekunder mellan stimuli, och upprepa 10 stimuleringar i rad för att få den genomsnittliga svar (Figur 2B - C). Mät amplitud från baslinje till topp (Figur 2A). Genomför nervus phrenicus stimulering under fasen av djurets andningscykel när nervus phrenicus / membranet inte är aktiverad. Proceduren kan upprepas på samma djur för den kontralaterala hemi-membran.
- Efter den sista CMAP inspelningen, BEGJUTA djuret om NMJ färgning kommer att genomföras. Genomföra cmap inspelningar upprepade gånger på samma djur ungefär en gång i veckan (eller intervall av val).
- Efter överlevnad cmap inspelningar tillåta djur att återhämta sig på en cirkulerande varmt vatten värmedyna, och kontinuerligt övervaka under återhämtning förrän vaken och sternally liggande. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått operation för att företaget av andra djur tills återhämtat sig helt. </ Li>
- När sternally liggande, övervaka djuret var 12 timmar för första 48 timmar (en gång dagligen därefter). Om djuret verkar vara uttorkad (slapp hud, apati), administrera vätskor (lakterad Ringers lösning, subkutant, 1-2 ml per injektion, med de platser roteras; 2 gånger per dag) tills postkirurgisk vikt och vätskeförlust stabiliseras. Ge djur med uppmjukade mat i små rätter under den akuta postoperativa perioden vid behov för att uppmuntra att äta om de inte kan nå tråd bar lockmatar.
- Administrera buprenorfin vid en dos av 0,05 mg / kg före slutet av kirurgi och därefter vid 12 timmars intervall för de första 24 h (och beroende av tecken på smärta / påkänning därefter) via subkutan injektion (ställe roterade). Om tecken på smärta eller ångest är märkt därefter behandla djur med buprenorfin. Tecken som tyder på smärta / ångest är brist på aktivitet, läten, brist på äta eller dricka (dehydrering), överdriven viktminskning, bevakning, excessive gnaga eller repning vid platsen för snittet. Ytterligare kriterier som används för att fastställa smärta och ångest inkludera okänslighet för yttre stimuli, övergående eller oprovocerad läte, ansträngd eller onormal andning, ihållande rödbrun naso-okulär ansvarsfrihet märkt piloerektion. Också övervaka tecken på dålig hygien som skulle föreslå sjuka djur. Om djuret fortfarande observerades vara i nöd efter 72 timmar av behandling (enligt de kriterier smärta / spännings beskriva ovan, och efter att ha fått smärtstillande protokoll som beskrivs ovan) avliva djuret.
2. Membran neuromuskulära Junction (NMJ) Analys
- Djur dissektion:
- Administrera djuret av en överdos av injicerbar anestesi (3 gånger dosen används ovan: ketamin vid 285,0 mg / kg, xylazin vid 30,0 mg / kg, acepromazin vid 0,225 mg / kg, administrerad intraperitonealt). Efter överdosering ska alla djur ha en andra metod för dödshjälp (torakotomi) to se till döden. Döden ska bekräftas genom att observera hjärt- och andningsstillestånd och genom att notera djurets fasta och vidgade pupiller.
- Genomföra en laparotomi med skalpell eller dissektion sax förlänga excision från zyphoid processen caudally längs mittlinjen. Ta försiktigt loss hud och bindväv från underliggande muskler med hjälp av skalpell och pincett.
- Medan du drar upp på zyphoid processen använder dissekering sax för att ta bort hela membran och se till att membranet sitter kvar omgivande ben. Detta är viktigt eftersom det kommer att förhindra skada på diafragman, kommer att möjliggöra framgångsrik dissektion av hela membranet och kommer att hjälpa till vid rengöring muskel för efterföljande färgning.
OBS: Vid denna punkt, kan djuret perfusion vid behov.
- Rengöring och färgning av membranet:
- Pin ner hela dissekerade membranet, överlägsen yta uppåt, till silikongummi i ett glas 100 mm petriskål i4% paraformaldehyd (som gjorts i en% fosfatbuffrad saltlösning - PBS) under 20 min under användning av ett stereomikroskop. Sträck diafragman för att göra den spända, och med hjälp av insekter stift, stift ner den omgivande vävnaden för att undvika nålning diafragmamuskeln själv (Figur 3).
- Försiktigt rensa bort bindväv från bara den överlägsna ytan av muskler med # 5 pincett och en liten sax.
OBS: Utför alla efterföljande steg av denna färgningsprotokollet långsamt gungning vid rumstemperatur täckt från ljus om inte annat anges. Säkerställ att diafragmamuskeln alltid är helt nedsänkt i vätska för att undvika uttorkning. - Före färgning, förbereda alla nödvändiga reagenser: 1x PBS, 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M glycin som gjorts i 2% BSA / PBS, 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS, och 0,2% TBP (0,2 % Triton X 100 i 2% BSA / PBS). Var noga med att i förväg kyla metanol vid -20 ° C.
- Tvätta 3x under 10 min i 1 x PBS.
- Inkubera i 0,1 M glycin (gjord i 2% BSA / PBS) under 30 minuter.
- Inkubera i RBTX (rodamin-konjugerad α-bungarotoxin) lösning under 15 minuter. Lösning för RBTX är följande: rodamin-konjugerad alfa bungarotoxin 1: 400 spädning i 1 x PBS.
OBS: I detta protokoll är Rhodamine används, men varje fluoroforen val kan användas för färgning. - Tvätta 3x under 10 min i 1 x PBS.
- I -20 ° C frys, inkubera med MeOH under 5 min.
OBS: Lägg inte till MeOH innan du placerar muskel i frysen, och omedelbart ta bort lösningen efter inkubationstiden. - Tvätta 3x under 10 min i 1 x PBS.
- Block i 0,2% TBP under 1 timme (0,2% Triton gjordes i 2% BSA / PBS).
- Inkubera med primär antikroppslösning (i 0,2% TBP) vid 4 ° C över natten under skakning. Späd av antikroppar enligt följande: SV2 (1:10) och SMI-312 (1: 1000).
- Tvätta 3x under 10 min med 0,2% TBP.
- Inkubera med sekundär antikropp med användning av en: 100 spädning av FGM1 (FITC-konjugerad get-anti-mus-IgG1; gjordes i 0,2% TBP) medan gunga under 1 timme.
OBS: Skyddas från ljus under resten av protokollet för färgning. - Tvätta 3x under 10 min med 1 x PBS.
- Åter ren omgivande bindväv på den överlägsna (se ovan) ytan av muskel före montering och täck.
OBS: Vi rekommenderar att rengöra och sedan montera provet omedelbart efter färgning. Men om det är nödvändigt, prov kan täckas i 1x PBS, insvept i parafilm för att förhindra avdunstning och förvarades vid 4 ° C i upp till 1 vecka, med byte av PBS dagligen. - Vid montering på objektglas, täck med icke-hardset Vectashield. Täta kanterna på täck med genomskinligt nagellack för att förhindra uttorkning. Förvara diabilder liggande lägenhet i kartong glid mappar i -20 ° C under lång sikt.
- Analys och Confocal Imaging:
- Kvantitativt analysera morfologin hos färgade och monterade hemi-membran enligt 20X och 40X förstoring med användning av en upprätt epifluorescencemikroskop.
OBS! Eftersom membranet färgades och analyserades i en hel-mount mode, är ganska tjock muskeln. Följaktligen är helt ur fokus flesta av fluorescensfärgning när en statisk bild är tagen med icke-konfokal fluorescensmikroskopi. Av denna anledning är det bäst att genomföra NMJ analysen i realtid på mikroskopet eftersom detta ger dig möjlighet att ständigt fokusera "upp" och "ned" genom muskeln att korrekt identifiera morfologi varje enskild NMJs. Med hjälp av denna metod kan man lätt följa banan för enskilda motor axoner när de rör sig genom vävnaden i rumsliga förhållande till de postsynaptiska receptor kluster. - Genom att mäta den ventrala till rygg längd av muskeln, dela muskeln i 3 separata sektioner för analys baserat på topografiska innervation mönster från specifika ryggmärgsnivåer (figur 4H).
- Med början vid den ventrala regionen av muskel och moving dorsalt, analysera alla med eget ansikte NMJs ligger på ytan muskelfibrer. Analysera inte muskler fibrer djupare än de första 3-4 fibrer från ytan som tolkning kan vara svår på grund av sämre penetrations antikropp (RBTX tränger mycket djupare in i muskel på grund av den lilla storleken av toxinet i jämförelse med de större antikroppar som användes för att märka neuroner).
- Identifiera varje NMJ som intakt om pre-terminal axon av neuron är tjock i diameter och alla regioner i nervändsluten helt överlappar med de underliggande muskel acetylkolinreceptorer (AChRs).
- Identifiera varje NMJ som delvis denerverad om varje region i de underliggande muskel AChRs är obemannat med motsvarande nervändsluten.
- Identifiera varje NMJ så fullständigt denerverad om muskel AChRs har ingen motsvarande nervändsluten (det är också viktigt att ha andra NMJs med märkta neuroner i samma område av fokus, så att man kan vara säker på att bristen på nervändsluten är inte bara på grund av bajsr penetration antikropp i denna del av muskeln).
- Identifiera varje NMJ som multiplicera innerveras om det finns mer än en pre-terminal Axon innervating en enskild NMJ (detta tyder på att det har skett en viss nivå av denerveringen och sannolika försök reinnervation vid denna korsning).
- Identifiera varje NMJ så tunt innerveras om NMJ har fullständig överlappning mellan nervändsluten och underliggande AChRs men har en tunn pre-terminal axon (detta är också ett tecken på en viss nivå av denerveringen och försök till reinnervation).
- Genomföra analyser för var och en av de tre identifierade regionerna för alla ovanstående NMJ kategorierna för varje djur. Medelvärdet data från varje djur med resultat från andra djur från samma experimentgrupp. Cirka 200-300 korsningar i råtta hemi-diafragmamuskeln och 150-200 i mus hemi-membran bör kvantifieras i minst 3 (företrädesvis 5-6 eller fler) djur per experimentgrupp.
- Skaffa högupplösta konfokala bilder, användningd för publicering, med en konfokalmikroskop.
- Skaffa Z-stackar på 0,3 pm steg storlek för 20-40 um djup, och samla in ytterligare optiska avsnitten ovan och under varje korsning för att säkerställa att hela synaptiska profilen ingår.
- Använd förvärv programvara för att rekonstruera z-serien bilder till maximal intensitet projektioner.
- Kvantitativt analysera morfologin hos färgade och monterade hemi-membran enligt 20X och 40X förstoring med användning av en upprätt epifluorescencemikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxna Sprague-Dawley-råttor fick antingen laminektomi endast (oskadade kontroll) eller ensidig hemi-kontusion SCI vid C4 ryggmärgen nivå 10-12. Vid 5 veckor efter kirurgi, topp CMAP amplitud registrerades från hemi-membranet ipsilateralt laminektomistället / skadestället var signifikant reducerad i SCI-råttor (Figur 2C) jämfört med laminektomi-enbart kontroll (Figur 2B). Alla NMJs i hemi-membranet var helt intakta i kontroll icke-sjuka vildtyp råttor (figur 4A, C). Tvärtom SOD1 G93A råttor (en gnagare modell av ALS) visade signifikant patologi vid hemi-diafragma NMJs (Figur 4B), inklusive fullständig denervering (fig 4G, pilspets), partiell denervering (Figur 4E, pilspets, fig 4G, NMJ på höger), multipel innervation (Figur 4D) och tunna pre-terminal axoner (Figur 4F, pilspets).
Figur 1: CMAP elektrodplacering. Jordelektroden är placerad subkutant i svansen. Referenselektroden är placerad in i buken. Ytan inspelningen elektroden är placerad på tvären längs den ensidiga kust marginal. Stimulerande elektroder avbildas som både rött och svart. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Cmap inspelningar och analys (A) amplitud CMAP svar kan mätas från baslinjen till topp. En typisk CMAP svar ska visa både stimulans artefaktoch responskurva. (B - C) Representativa genomsnittliga cmap svar. Stimulering bör genomföras åtminstone tio gånger i rad för att få en upprepad genomsnitt av svaret. Här visas en laminektomi endast oskadade råtta (B) och en jämförelse av cmap svar för en skadad råtta som fick en ensidig C4 hemi-kontusion (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Framställning av membran för hel-mount-färgning. Insekts stift ska placeras i omgivande vävnad för att säkra hemi-membranet till Sylgard. Undvik att placera stift i muskeln själv. I den här bilden är både halv-diafragma muskler visas och satte ned SEPAför sig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: NMJ fenotyper. Konfokal avbildning genomfördes för att visualisera postsynaptiska acetylkolinreceptorer (i rött märkt med rodamin-konjugerad α bungarotoxin) och axonal fibrer och pre-synaptiska terminaler (i grönt märkt med SMI-32 och SV2 antikroppar, respektive). Alla NMJs i hemi-membran var helt intakt i kontroll icke-sjuka vildtyp råttor (A, C). Tvärtom SOD1 G93A råttor (en gnagare ALS modell) visade signifikant patologi vid hemi-diafragma NMJs (B), inklusive fullständig denervering (G, pilspets), partiell denervering (E, pilspets, G (D) och tunna för-terminala axoner (F, pilspets). Diafragmamuskeln är uppdelad i tre separata sektioner för NMJ bildanalys (H) 13. Skala bar:. 25 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som lungfunktion äventyras både traumatisk SCI och ALS, utveckla behandlingar som riktar andning och specifikt membran innervation är kliniskt relevant 5,6. För att på ett heltäckande studera lungfunktion, bör ett kombinerat tillvägagångssätt metod användas. CMaps mäta graden av funktionell innervation av membranet med hjälp av extern phrenic nervstimulering, men inte endogen bulbospinal andningsdrift 8. Dessutom har dessa inspelningar inte tillåta granskning av morfologiska förändringar vid NMJ, särskilt på nivån för enskilda motor axoner och postsynaptiska acetylkolinreceptorer. Genom att använda den beskrivna färgningsprotokollet kan man kvantitativt bedöma relevanta morfologiska fenotyper såsom fullständig denervering, partiell denervering och även regenerativ groning och reinnervation på enskilda NMJs av diafragmamuskeln 9.
Trots dessa två protokolumner fortfarande inte till fullo fånga alla aspekter av andnings patologi. Till exempel, om skador uppstår på de fallande bulbospinal axoner utan skador på PhMN poolen eller phrenic nerv, cmap amplituder kan fortfarande verkar normala, även om det finns en betydande försämring i denna krets eftersom phrenic nerven externt stimuleras 14. Viktigt, gör CMaps tillåter inte för mätning av endogen supraspinala andningsdrift. Dessutom behöver CMaps inte ge ett mått på total ventilation. Det kan vara fördelaktigt att göra, till exempel, hela kroppen pletysmografi att undersöka totala andningsbeteende och spontana intramuskulär EMG inspelningar och phrenic nerv inspelningar att testa endogen PhMN aktivering. Dessutom kan andra metoder såsom att mäta blod gasnivåer ge viktig information om lungfunktion 15. Det kan också vara möjligt att använda den beskrivna membranet CMAP inspelningsteknik för motorenhetsnummer uppskattning16, men vi har aldrig försökt detta. Det är också viktigt att notera att dessa två protokoll har beskrivits för endast en andningsmuskulatur, membranet. Det finns emellertid andra inandnings- och utandningsluftvägsmuskler såsom interkostaler som kan studeras och som påverkas av sjukdomar som SCI och ALS.
I detta protokoll, beskriver vi membran CMAP och NMJ analys specifikt i råttmodellen. Likheter mellan råttor och möss gör överföring av både dessa tekniker till möss enkla. Vi visade tidigare att partiell förlust av PhMNs efter livmoderhalscancer kontusion SCI leder till mätbara minskningar i membranet CMAP amplitud som korrelerar med morfologiska NMJ denervering. Dessutom har vi visat dessa underskott i både mus 17 och råtta 10-12 SCI modeller. Dessutom har vi visat kvantifierbar membran CMAP reduktion i både mus 18 och råtta 13,19 modeller av ALS (
Genom att kombinera den histologiska och funktionella metoder som beskrivs i detta protokoll för att undersöka andning och innervationen på NMJ, bättre insikt kan vinnas i nervsystemet sjukdomar associerade med membran dysfunktion, vilket ger ökad medvetenhet om hur man kan rikta behandlingar i djurmodeller och i slutändan hos patienter .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
