Introduction
Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), üst ve alt motor nöron ve buna bağlı olarak, kas felci, hem kaybı ile bağlantılı bir zayıflatıcı motor nöron hastalığıdır. Tanı üzerine, hasta sağ kalım ortalama sadece 2-5 yıl 1 üzerindedir. Frenik motor nöron (PhMN) zarar ALS patogenezinde kritik bir bileşenidir. Hastalar sonuçta nedeniyle diyaframın PhMN innervasyonu, ilham 2,3 birincil kas kaybı ölmektedir. Travmatik omurilik yaralanması (SKY) da ilişkili solunum güçlüğü ile ciddi bir sorundur. SCI yaklaşık 12.000 yeni vaka nedeniyle omuriliğe travmatik hasar her yıl 4 oluşur. Konumu, türü ve şiddetine göre hastalık heterojenite rağmen, SCI vakaların çoğunluğu genellikle zayıflatıcı ve kalıcı solunum uzlaşma ile sonuçlanan servikal spinal kord, travma içerir. ALS ve SCI ek olarak, diğer merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları w ilişkilendirilebiliri'inci diyafragma solunum fonksiyon bozukluğu 5,6.
frenik sinir ipsilateral hemi-diyaframı innervates bir efferent motor sinir olduğunu ve aynı taraftaki servikal spinal kord C3-C5 düzeylerinde bulunan PhMN hücre gövdeleri kaynaklanır. PhMN çıkışı rostral ventral solunum grubunda (rVRG) 7 olarak bilinen bir bölgede beyin sapından bulbospinal girdi inen tarafından kontrol edilir. rVRG-PhMN-diyafram devre inspiratuar solunum yanı sıra diğer non-solunum diyafram davranışları kontrol merkezidir. Bu devrelere etkileyen çeşitli travmatik yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, solunum fonksiyon ve hastanın yaşam kalitesinde düşüşe derin yol açabilir. Diyafram nöromüsküler bileşke (NMJ) de rVRG, PhMN hayatta kalma, frenik sinir bütünlüğü ve uygun innervasyonunun gelen PhMNs girdi Azalan Normal diyafram fonksiyonu için gerekli tüm vardır. Bu teknikler istihdam nedenle önemli olduğunukantitatif ALS, omurilik yaralanması ve diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarının, kemirgen modellerinde in vivo olarak bu devre değerlendirebilir.
Bu protokol ile, hedef elektrofizyolojik ve morfolojik düzeyde hem de diyaframın PhMN innervasyonu değerlendirmek için deneysel araçları tanımlamaktır. Bileşik kas aksiyon potansiyelleri (Cmaps) verilen bir motor sinirin tüm efferent motor nöron aksonları uyarıcı ve daha sonra hedef myofibers bir ortaya çıkardı depolarizasyon tepkisini analiz ederek kaydedilir. Bu teknik, PhMNs 8 ile hemi-diyafram fonksiyonel innervasyon ölçmek için anestezi uygulanmış farelerde ve sıçanlarda in vivo olarak kullanılabilir. Nedeniyle Cmaps hemi-diyafram bütün, aynı zamanda hastalığa izlemek için diyafram NMJ bireysel motorlu akson ve myofibers fenotipleri incelemek yararlıdır tüm (ya da en azından birçok / en) myofibers eşzamanlı kayıt temsil gerçeği - ve bu tür parsiyel ve komple olarak tedavi açısından önemli morfolojik değişimlerte denervasyon, rejeneratif filizlenme ve reinnervation. Bu kas 9 genelinde bireysel NMJs detaylı morfolojik değerlendirmenin ardından, diyaframın tüm montaj immünohistokimya (İHK) üzerinden gerçekleştirilebilir. Cmaps birleştiren ve NMJ analiz nicel MSS ve PNS hastalığı kemirgen modellerinde diyafram innervasyon çalışmak için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel işlemler Thomas Jefferson Üniversitesi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış ve (86/609 / EEC ve 87-848 / EEC 2010/63 / AB), Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, NIH Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı ve Nörobilim Araştırma Hayvanların Kullanımına İlişkin Neuroscience adlı Politikalar Derneği.
1. Bileşik kas Aksiyon Potansiyelleri (Cmaps)
- Hayvan hazırlanması:
- Enjeksiyonu (ketamin, ksilazin, asepromazin) etkisi veya teslim% 1-2 bir inhalant (izofluran) kullanarak sıçan anestezisi. Ketamin 95.0 mg / kg, 10.0 mg / ksilazin kg, 0.075 mg / kg asepromazin aşağıdaki gibi enjekte edilebilir anestezi dozajdır.
NOT: Biz başarıyla hem inhalant kullanabilir ve bu CMAP kayıt protokolü yaparken enjektabl anestezi hiçbir tercihle, yaklaşımlar. - Hayvan uygun a muhafaza edilmelidirAmeliyat öncesi nesthetic derinlik ameliyatı sonucunda yoluyla başlatılır ve post-operatif buprenorfın kadar etkili almıştır. Bir geri çekme tepkisi ortaya olmadığını belirlemek için kısa ayak tutam tarafından uygun anesthetization onaylayın. Ayrıca, bir pamuklu çubukla kornea refleksi sınayın. Cerrahi işlem boyunca, kalp hızı ve solunum sayısı anestezi derinliği çok hafif hale geldiğini ileri süren artış olmamıştır belirlemek.
- Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri bir veteriner merhem sürün.
- Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin fırçalayın) ile / ellerini ona yıkamak gerekir. Cerrah, steril eldiven, yüz maskesi ve cüppe veya temiz laboratuvar önlüğü giymeli. Tüm enstrümanlar yıkanır ve ameliyat öncesi otoklava edilmelidir. Bu sterilizasyon işlemi tamamlandıktan doğrulamak için araçların seviyesinde otoklav önce alet kiti içinde bir sterilizasyon göstergesi şeridi ekleyin. Cerrah gerekirStrip tüm çizgi ameliyat başlamadan önce siyah olduğunu doğrulayın. Yanı sıra otoklav bandı gösteren kutunun dışını bantlayın. Cerrahi aynı gün birkaç hayvanlar üzerinde yapılacak olursa, ameliyatlar arasında aletleri temizlemek ve cam boncuk sterilizatör sterilize edin. Gerekirse, steril hemostatla aleti kaldırarak, uygun süre sterilizatör enstrümanın kolu yerleştirerek steril bir alanda soğutulması ve daha sonra fonksiyonel ucunu yerleştirerek cam boncuk sterilizatör enstrümanın iki ucunu sterilize zaman uygun bir süre için cam boncuk sterilizatör içine alet.
- Hayvan anestezi edildikten sonra, aşağı dorsal yüzeyi ile cerrahi gemide ve böylece bant yukarı bakacak karın yerde cerrahi kuruluna hayvanın ön ayakları korumak için kullanılabilir.
- Kafatasının dibinde başlayan ventral yüzey kaudal Tıraş ve orta hat her iki tarafında karın çevresi sh olduğundan emin olunaved hemi-diyafram kaydedilirken bağlı olarak hangi. Cilt traş yüzeyine povidon-iyot uygulayın.
- Enjeksiyonu (ketamin, ksilazin, asepromazin) etkisi veya teslim% 1-2 bir inhalant (izofluran) kullanarak sıçan anestezisi. Ketamin 95.0 mg / kg, 10.0 mg / ksilazin kg, 0.075 mg / kg asepromazin aşağıdaki gibi enjekte edilebilir anestezi dozajdır.
- CMAP kayıtları için hazırlık:
- Kuyruk içine hayvan hazırlama, yer zemin elektrot deri altına takiben (Şekil 1).
- Kontralateral alt karın bölgesi içine referans elektrot deri altına yerleştirin.
- Kendinden yapışkanlı yüzey şerit veya disk kayıt elektrot (yüzey şerit elektrot boyutları: 0,5 x 3 cm) üzerine iletken jel yerleştirin ve sonra tek taraflı kot kenarı boyunca enine yüzey elektrodu yerleştirin.
- Transkutanoz 0.5 cm arayla trakea lateral ve klavikula üstün uyarıcı elektrotlar yerleştirin. Deri yoluyla yaklaşık 1.0 cm derinliğinde elektrotlar yerleştirin. Onların yeri daha sonraki uyarılara ile hareket etmez, böylece elle elektrotlar sabitleyin.
Not: yapışma yeri yerinde cilde 90 ° görece açı uyarıcı elektrotlarn.
- Bileşik kas Aksiyon Potansiyeli (CMAP) kayıtları:
- Bilgisayar destekli veri analizi ve ardından bir uyarıcısı / amplifikatör kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar edinin.
- Tek çekme stimülasyon uyaran parametreleri 0.5 msn, 1.0 Hz supramaksimal darbeleri olmalıdır. uyarıcı genlik V 6.0 ile 8.0 arasında (Şekil 2A) olmalıdır.
NOT: Bir deney içinde, hayvanlar üzerinde aynı genlikli bir uyarıcı yoğunluğu kullanın. Amaç stimülasyon az genliği kullanarak yanıt genlik maksimize etmektir. Bu stimülasyon sırasında meydana ilk tepkisi bir uyarım eser olduğuna dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, bakımı daha sonra hızlı bir şekilde CMAP tepki izlemektedir stimülasyon artifakt sonra kararlı / yassı taban öncesinde bir CMAP tepki elde etmek için dikkat edilmelidir. Bu tür bir yanıt elde etmek için, bu uyarım yeniden konumlandırmak için gerekli olabilir ve / veyaKayıt elektrotları. - Uyarımlar arasında 30 saniye bekleyin ve ortalama yanıt (Şekil 2B - C) elde etmek için arka arkaya 10 uyarılmalara tekrarlayın. Pik (Şekil 2A), başlangıçtan genlik ölçün. Frenik sinir / diyafram aktif değilken hayvanın solunum döngüsünün aşamasında frenik sinir stimülasyonu yürütün. işlem karşı yarı-diyafram için aynı hayvan üzerinde tekrar edilebilir.
- NMJ boyama yapılacaktır eğer son BKAP kayıt seansından sonra, hayvan serpmek. Yaklaşık bir kez aynı hayvan üzerinde defalarca her hafta CMAP kayıtları Davranış (ya da tercih aralığında).
- Sağkalım CMAP kayıtları sonrasında, hayvan uyanık ve sternally yatarak kadar kurtarma sırasında dolaşan sıcak su ısıtma yastığı kurtarmak ve sürekli izlemek için izin verir. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </ Li>
- Bir kez sternally yaslanmış, hayvana ilk 48 saat (günde bir kez bundan sonra) her 12 saat izliyoruz. (Siteleri döndürülmüş olan enjeksiyon başına 1-2 ml,,, deri altından laktatlı zilleri çözümü 2 günde kez) hayvan susuz (sarkık cilt, halsizlik) olarak görünüyorsa, sıvılar yönetmek ameliyat sonrası kilo ve sıvı kaybı stabilize kadar. Onlar tel çubuk kapak besleyici ulaşamadığı takdirde yeme teşvik etmek gerekirse, akut post-operatif dönemde küçük yemekler yumuşatılmış gıda ile hayvanların sağlamak.
- Ameliyat sonundan önce 0.05 mg / kg bir dozda buprenorfin yönetme ve daha sonra 12 saat aralıklarla, ilk 24 saat boyunca (ve bundan sonra da ağrı / stres belirtileri bağlı) deri altı enjeksiyon yoluyla (Alanı döndürülmüş). Ağrı veya sıkıntı belirtileri sonra fark ise, buprenorfin hayvanları davranın. Gösterge ağrı / sıkıntı belirtileri aktivite eksikliği, vocalizations, yeme eksikliği veya içme (dehidratasyon), aşırı kilo kaybı, nöbet, exc dahilkemiren veya kesi yerinde tırmalama essive. Ağrı ve sıkıntı belirlenmesinde kullanılan ek ölçütler yabancı uyaranlara yanıtsızlık, geçici ya da sebepsiz seslendirme, yorucu veya anormal nefes, kalıcı kırmızımsı-kahverengi nazo-oküler akıntı, işaretli piloerection içerir. Ayrıca hasta hayvanlar öneririm kötü hijyen kanıt izlemek. Hayvan hala tedavi 72 saat sonra sıkıntı olduğu gözlenirse hayvan euthanize (yukarıda ana hatlarıyla ağrı / stres kriterlerine göre ve aldıktan sonra analjezik protokol yukarıda açıklanan).
2. Diyafram Nöromüsküler Junction (NMJ) Analizler
- Hayvan diseksiyonu:
- Hayvana enjekte edilebilir anestezi aşırı dozda yönetme (:; intraperitoneal olarak uygulanmıştır 0.225 mg / kg ve 30.0 mg / kg, asepromazin de 285,0 mg / kg ksilazin ile ketamin 3 kez yukarıda kullanılan doz). Doz aşımı sonrasında, tüm hayvanlar t ötenazi (torakotomi) ikinci bir yöntem olmalıdıro ölüm sağlamak. Ölüm kalp ve solunum arrest gözlemleyerek ve hayvanın sabit ve dilate öğrenciler belirterek tarafından teyit edilmelidir.
- Neşter veya diseksiyon makas kaudal orta hat boyunca zyphoid süreçten eksizyonu uzanan bir laparotomi yapınız. Dikkatle neşter ve forseps kullanılarak altta yatan kas deri ve bağ dokusu ayırın.
- Zyphoid süreci yukarı çekerken, diyafram kemiği çevreleyen bağlı kalır sağlanması, bütün diyaframı kaldırmak için diseksiyon makas kullanın. O bütün diyaframın başarılı diseksiyon sağlayacak, diyafram kası zarar görmesini önlemek ve daha sonraki boyama için kas temizliğinde yardımcı olacak gibi bu çok önemlidir.
Not: Gerekirse, bu noktada, hayvan perfüze edilebilir.
- Temizlik ve diyaframın boyama:
- Bütün disseke diyaframı aşağı pin, üstün yüzey cam 100 mm petri içinde silikon kauçuk, yukarı bakacak şekildeBir stereomikroskop kullanılarak 20 dakika boyunca -% 4 paraformaldehit (PBS,% 1 fosfat yapılan tamponlu tuz). O gergin hale getirmek için diyaframı gerin ve böcek pimleri kullanarak, diyafram kasını kendisi (Şekil 3) iğneleme önlemek için çevredeki dokuyu aşağı pin.
- Dikkatle 5. forseps ve küçük makas ile kas sadece üstün yüzeyinden bağ dokusu temizleyin.
NOT: Aksi belirtilmediği sürece, bu boyama protokolü yavaş yavaş ışık kaplı oda sıcaklığında sallanan sonraki tüm adımları uygulayın. Diyafram kası her zaman tamamen kurumasını önlemek için sıvı batık emin olun. - (0.2 1 x PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) / PBS BSA / PBS,% 4 paraformaldehit 1x PBS (PFA), ve% 0.2 TBP% 2 yapılır 0.1 M glisin: boyamadan önce, gerekli tüm reaktifleri hazırlanması 2% BSA / PBS) içinde% Triton X100. -20 ° C'de metanol-serin öncesi emin olun.
- 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
- 2'de yapılan 0.1 M glisin (inkübe% BSA, 30 dakika boyunca / PBS).
- 15 dakika boyunca RBTX (rodamin-konjuge α-bungarotoxin) çözelti içinde inkübe edilir. Şöyle RBTX için çözüm: Rhodamine-konjuge a bungarotoxin 1: 1 x PBS içinde 400 dilüsyon.
NOT: Bu protokol, rodamin kullanılır, ancak tercih edilen bir flüorofor boyanması için de kullanılabilir. - 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
- -20 ° C dondurucu içinde, 5 dakika boyunca MeOH ile inkübe edin.
NOT: dondurucuda kas yerleştirmeden önce MeOH ekleyin ve hemen kuluçka dönemi izleyen çözümü çıkarmayın. - 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
- 1 saat süre ile% 0.2 TBP Blok (% 0.2 Triton% 2 BSA / PBS içinde yapılan).
- Sallanan ise gece boyunca 4 ° C 'de primer antikor çözeltisi (% 0.2 TBP) ile inkübe edin. Antikorların çözeltiler aşağıdaki gibi: SV2 olduğunda (1:10) ve SMI-312 (1: 1.000).
- % 0.2, TBP ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- FGM1 (FITC-konjuge keçi anti-fare IgG-100 seyreltme: 1 kullanılarak ikincil antikor ile inkübe1 'dir; 1 saat için sallanan ise% 0.2 TBP) yapılmış.
NOT: boyama için protokol kalanı için ışıktan koruyun. - 1 x PBS ile 10 dakika boyunca yıkama 3x.
- Yeniden temiz öncesinde montaj ve coverslipping kasın üstün (yukarıya bakınız) yüzeyinde bağ dokusunu çevreleyen.
NOT: temizlemek ve sonra lekelenme hemen sonra örnek monte edilmesi tavsiye edilir. Ancak gerektiğinde, örnek 1 x PBS içinde kapsanabilir halinde, buharlaşmayı önlemek için parafilm ile sarılmış ve günlük PBS değişen, 1 haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilmiştir. - Cam slayt, sigara hardset Vectashield ile lamel üzerine monte üzerine. Kurumasını önlemek için net bir oje ile lamel kenarları mühür. Uzun vadede -20 ° C karton slayt klasörlerinde düz yalan Mağaza slaytlar.
- Analiz ve Konfokal Görüntüleme:
- Kantitatif lekeli morfolojisi analiz ve dik bir Epifloresans kullanarak 20X ve 40X büyütme altında hemi-diyaframı montemikroskop.
NOT: Diyafram lekeli ve tüm montaj şekilde analiz olduğundan, kas oldukça kalındır. Statik görüntü olmayan konfokal floresan mikroskopi kullanılarak alındığında Sonuç olarak, floresan boyama çoğu tamamen odak dışında. Bu nedenle, bu sürekli düzgün bireysel NMJs her morfolojisi tanımlamak için "yukarı" ve "aşağı" kas içinden odaklanmasını sağlar olarak mikroskop üzerinde gerçek zamanlı olarak NMJ analiz yapmak en iyisidir. Onlar post-sinaptik reseptör kümelerine mekansal ilişki içinde doku yoluyla hareket olarak bu yaklaşımı kullanarak, kolayca bireysel motorlu akson yörüngesini takip edebilirsiniz. - Kas ventral-to-dorsal uzunluk ölçerek, belirli omurilik düzeyleri (Şekil 4H) topografik innervasyon şekillerine göre analiz için 3 ayrı bölüme kas bölün.
- Kas ve mov ventral bölgede başlayandorsal ing, yüzey kas lifleri üzerinde bulunan yüz NMJs en tüm analiz. RBTX nedeniyle etiketlemek için kullanılan büyük antikorlar ile karşılaştırıldığında toksin küçük boyutu kas içine çok daha derin nüfuz (nedeniyle yoksul antikor penetrasyonu yorumlanması zor olabilir gibi daha derin yüzeyinden ilk 3-4 liflerden daha kaslar lifleri analiz etmeyin nöronlar).
- Nöronun öncesi terminali akson çapı kalın ve sinir terminali bütün bölgeler tamamen altta yatan kas asetilkolin reseptörleri (AChRs) ile çakışıyorsa sağlam olarak her NMJ tanımlayın.
- Altta yatan kas AChRs herhangi bölge sinir terminali karşılık gelen boş olup olmadığını kısmen Denerve her NMJ tanımlayın.
- Olarak tamamen Denerve her NMJ tanımlayın eğer kas AChRs henüz gelen sinir terminali (bir sinir terminalinin olmaması nedeniyle sadece olmadığından emin olabilirsiniz böylece, odak aynı alanda etiketli nöronlar diğer NMJs olması da önemlidir poor kas bu bölgede antikor penetrasyon).
- Birden fazla ön uç akson innerve bireysel NMJ (bu kavşakta denervasyon ve reinnervation olası girişimleri belli bir düzeyde yaşandığını gösterir) varsa her NMJ olarak çarpma innerve tanımlayın.
- Olarak ince NMJ sinir terminali ve altta yatan AChRs arasında tam bir örtüşme vardır ama ince bir ön-uç akson varsa innerve her NMJ (bu da reinnervation de denervasyon ve girişimleri bazı düzeyinin göstergesidir) tanımlayın.
- Her bir hayvan için, yukarıda NMJ tüm kategoriler için 3 belirlenen bölgelerin her biri için analiz yapıldı. Aynı deneysel grup için diğer hayvanlardan elde edilen sonuçlar, her bir hayvandan alınan verileri ortalama. Fare, hemi-diyafram sıçan yarı diyafram kası ve 150-200 Yaklaşık 200-300 birleşme deney grubu başına en az 3 (tercihen 5-6 veya daha fazla), hayvanlarda miktarı gerekmektedir.
- Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler elde, kullanımıkonfokal mikroskop ile yayına d.
- 20-40 mikron derinliklerde 0.3 mikron adım boyutunda Z-yığınlarının edinin ve tüm sinaptik profil dahil olmasını sağlamak için yukarıda ve her kavşağın altında ilave optik bölümleri toplamak.
- Maksimum yoğunluğu projeksiyonları içine z serisi görüntüleri yeniden satın alma yazılımını kullanın.
- Kantitatif lekeli morfolojisi analiz ve dik bir Epifloresans kullanarak 20X ve 40X büyütme altında hemi-diyaframı montemikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin Sprague-Dawley sıçanları C4 omurilik düzeyinde 10-12 ya laminektomi sadece (yaralanmamış kontrol) veya tek taraflı hemi-kontüzyon SCI aldı. 5 hafta sonrası Ameliyatta, zirve CMAP genlik kaydedilen hemi-diyafram ölçüde laminektomi sadece kontrol (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında SCI sıçanlarda (Şekil 2C) azalmıştır laminektomi / yaralanma siteye ipsilateral. Hemi-diyafram tüm NMJs kontrol dışı hastalıklı yabani tip sıçanlarda (Şekil 4A, C) tamamen sağlam idi. Aksine, SOD1 G93A fareleri (ALS bir kemirgen modeli) tam denervasyon (Şekil 4G, ok başı), kısmi denervasyon dahil olmak üzere yarı diyafram NMJs (Şekil 4B), en önemli bir patoloji gösterdi (Şekil 4E, ok ucu Şekil 4G, ilgili NMJ sağ), çoklu innervasyon (Şekil 4D) ve ince ön-uç aksonlar (Şekil 4F, ok).
Şekil 1: CMAP elektrot yerleştirme. Toprak elektrodu kuyruk içine deri altından yerleştirilir. Referans elektrot karın içine yerleştirilir. Yüzey kayıt elektrot enine tek taraflı kot kenarı boyunca yerleştirilir. Uyarıcı elektrotlar hem kırmızı ve siyah olarak tasvir edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. CMAP kayıtlar ve analizler (A) CMAP tepkinin geninin tepe başlangıca ölçülebilir. Tipik bir BKAP tepki uyaran artifakı hem göstermelidirve yanıt eğrisi. (B - C) Örnek ortalama CMAP tepkiler. Uyarım tepkisinin tekrar ortalama elde etmek için, en az on kez arka arkaya yapılmalıdır. Bir laminektomi sadece yaralanmamış sıçan (B) ve tek taraflı bir C4 hemi-ezilme (C) Alınan yaralı sıçan için CMAP tepkilerin bir karşılaştırma burada gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: tüm montaj boyaması için diyaframın hazırlanması. Böcek pimleri Sylgard için hemi-diyafram sabitlemek için çevre dokuya konulmalıdır. Kas kendisi içine işaretçilerine yerleştirmekten kaçının. Bu görüntüde, hem hemi-diyafram kasları gösterilir ve devamlı ayrı aşağı sabitlenirlirlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: NMJ fenotipleri. Konfokal görüntüleme (yeşil, sırasıyla SMI-32 ve SV2 antikorlar ile işaretlenmiştir) ve aksonal elyaflar ve pre-sinaptik terminallerinden (rodamin-konjüge α bungarotoxin ile etiketlenmiş kırmızı) post-sinaptik asetilkolin reseptörlerini görselleştirmek için yürütülmüştür. Hemi diyafram tüm NMJs kontrolü olmayan hastalıklı doğal tipte fareler (A, C) tamamen sağlamdı. Aksine, SOD1 G93A fareleri (bir kemirgen ALS modeli) tam denervasyon (G, ok başı), kısmi denervasyon (E, ok ucu dahil olmak üzere yarı diyafram NMJs (B), en önemli bir patoloji gösteren G (D) ve ince ön-uç aksonlar (F, ok başı). Diyafram kası alt bölünmüş olan NMJ morfolojisi analizi (H) 13 için üç ayrı bölüme. Ölçek çubuğu:. 25 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Solunum fonksiyon solunum ve özellikle diyafram innervasyon hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, travmatik SKY ve ALS hem tehlikeye klinik olarak 5,6 alakalı. Kapsamlı solunum fonksiyonu çalışma için, bir birleşik yaklaşım yöntemi kullanılmalıdır. Cmaps dış frenik sinir stimülasyonu yoluyla diyaframın fonksiyonel inervasyonun derecesini ölçmek değil, endojen bulbospinal solunum sürücü 8. Buna ek olarak, bu kayıtlar, özellikle tek bir motor akson ve post-sinaptik asetilkolin reseptörleri seviyesinde, NMJ morfolojik değişiklikler incelenmesi için izin yoktur. Açıklanan boyama protokolünü kullanarak bir kantitatif böyle bir diyafram kası 9 bireysel NMJs tam denervasyon, kısmi denervasyon ve hatta rejeneratif filizlenmeye ve reinnervation gibi ilgili morfolojik fenotipleri değerlendirebilir.
Bununla birlikte, bu iki protocols hala tam solunum patoloji tüm yönlerini ele yoktur. Yaralanma PhMN havuz veya frenik sinire zarar vermeden inen bulbospinal akson oluşur Örneğin, CMAP genlikleri hala frenik sinir dışarıdan 14 uyarılmış çünkü bu devrede önemli bozulma olsa bile, normal görünebilir. Önemli bir şekilde, Cmaps endojen Supraspinal solunum merkezinin ölçümü için izin yoktur. Ayrıca, Cmaps genel havalandırma bir ölçü vermemektedir. Bu yapmak için yararlı olabilir, örneğin, tüm vücut pletismografı endojen PhMN aktivasyonunu test etmek için genel olarak solunum hareketleri ve spontan intra-müsküler EMG kayıtları ve frenik sinir kayıtları incelemek. Buna ek olarak, bu tür ölçüm kan gazı seviyeleri gibi diğer yaklaşımlar, solunum fonksiyon 15 hakkında önemli bilgiler verebilir. Aynı zamanda motor ünite sayısı tahmini için açıklanan diyafram CMAP kayıt tekniği kullanmak mümkün olabilir16 olsa biz bu teşebbüs etmedim. Bu iki protokol tek solunum kas, diyaframın için tarif edildi dikkat etmek de önemlidir. Ancak, bu tür okudu olabilir ve bu tür SCI ve ALS gibi hastalıkların etkilenen interkostal gibi diğer inspiratuar ve ekspiratuar solunum kaslarının vardır.
Bu protokol, biz sıçan modelinde özellikle diyafram CMAP ve NMJ analizi açıklar. Sıçan ve fareler arasındaki benzerlikler basit farelere bu tekniklerin hem transferi yapmak. Biz daha önce servikal kontüzyon aşağıdaki PhMNs kısmi kaybı SCI morfolojik NMJ denervasyon ile ilişkili diyafram CMAP genliği ölçülebilir düşüşlere neden olmadığını gösterdi. Ayrıca, hem fare ve sıçan 17 10-12 SCI modellerinde bu açıkları ortaya koymuştur. Buna ek olarak, her iki fare 18 ölçülebilir diyafram CMAP azalma göstermiştir ve (ALS 13,19 modelini sıçan
Histolojik ve NMJ nefes ve innervasyon incelemek için bu protokolü detaylı fonksiyonel teknikleri, birleştirerek daha iyi fikir böylece hastaların sonuçta daha hayvan modellerinde tedavileri hedef nasıl farkındalık ve sağlayan diyafram disfonksiyonu ile ilişkili sinir sistemi hastalıkları içine elde edilebilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
