Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية

Published: May 25, 2015 doi: 10.3791/52605
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, Farber Institute for Neurosciences, Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University, 2Department of Biology, Arcadia University

Introduction

التصلب الضموري العضلي الجانبي (ALS) هو مرض العصبون الحركي الموهنة المرتبطة مع فقدان كل من الخلايا العصبية الحركية العليا والسفلى وشلل العضلات يترتب على ذلك. على التشخيص، وبقاء المريض على متوسط ​​سنوات فقط 1 5/2. الحجابي الخلايا العصبية الحركية (PhMN) الخسارة هي عنصر حاسم في التسبب في المرض. المرضى يموتون في النهاية بسبب فقدان PhMN تعصيب من الحجاب الحاجز، وعضلات الأولية للإلهام 2،3. إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هي أيضا مشكلة خطيرة مع صعوبات في التنفس المرتبطة بها. ما يقرب من 12،000 حالة جديدة من حالات اصابات النخاع الشوكي تحدث كل 4 سنوات وذلك بسبب الأضرار الصدمة إلى الحبل الشوكي. على الرغم من عدم التجانس مرض فيما يتعلق الموقع، نوع وشدة، والغالبية العظمى من الحالات SCI تنطوي على الصدمة إلى الحبل الشوكي العنقي، الذي غالبا ما يؤدي إلى حل وسط التنفسي المنهكة ومستمرة. بالإضافة إلى ALS واصابات النخاع الشوكي، وغيرها من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض يمكن أن تكون مرتبطة ثإيث ضعف الجهاز التنفسي البطني 5،6.

العصب الحجابي هو العصب المحرك ناقل أن يعصب المماثل نصفي الحجاب الحاجز والتي تنبع من أجسام الخلايا PhMN تقع في مستويات C3-C5 من الحبل الشوكي العنقي المماثل. يتم التحكم الانتاج PhMN التي كتبها تنازلي إدخال البصلي النخاعي من الدماغ في منطقة تعرف باسم مجموعة منقاري بطني الجهاز التنفسي (rVRG) 7. الدائرة rVRG-PhMN-غشاء أساسية لمراقبة التنفس الشهيق، فضلا عن غيرها من السلوكيات الحجاب الحاجز غير التهوية. مختلف الإصابات والاضطرابات العصبية التي تؤثر على هذه الدوائر يمكن أن يؤدي إلى انخفاض شديد في وظيفة الجهاز التنفسي ونوعية حياة المريض. تنازلي مساهمة في PhMNs من البقاء على قيد الحياة rVRG، PhMN وسلامة العصب الحجابي وتعصيب السليم عند تقاطع الحجاب الحاجز العصبي العضلي (NMJ) هي كل ما يلزم من أجل وظيفة الحجاب الحاجز العادية. ولذلك فمن المهم أن توظف التقنيات التييمكن تقييم كمي هذه الدائرة في الجسم الحي في نماذج القوارض من ALS، SCI وأمراض الجهاز العصبي المركزي أخرى.

مع هذا البروتوكول، والهدف هو وصف الأدوات التجريبية لتقييم PhMN تعصيب من الحجاب الحاجز في كل من الكهربية ومستويات شكلية. وتسجل إمكانات عمل العضلات مجمع (CMAPs) من خلال تحفيز جميع محاور الخلايا العصبية الحركية صادر من العصب المحرك معينة ثم تحليل استجابة الاستقطاب انتزع من myofibers الهدف. هذه التقنية يمكن استخدامها في الجسم الحي في الفئران تخدير والفئران لتحديد تعصيب وظيفي من نصفي الحجاب الحاجز بواسطة PhMNs 8. يرجع ذلك إلى حقيقة أن CMAPs تمثل التسجيل المتزامن لجميع (أو على الأقل الكثير / معظم) myofibers للمجلس بكامل هيئته نصفي الحجاب الحاجز، فمن المفيد أيضا بدراسة الظواهر من المحاور الحركية الفردية وmyofibers في NMJ الحجاب الحاجز من أجل تتبع المرض - والعلاج المناسب تغيرات شكلية مثل جزئية ومجمعاتالشركة المصرية للاتصالات إزالة التعصيب، تنتشر على التجدد وعودة التعصيب. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق كله جبل المناعية (IHC) من الحجاب الحاجز، يليها تقييم الصرفي مفصل للل NMJs الفردية في جميع أنحاء العضلات 9. الجمع بين CMAPs ويقدم تحليلا NMJ طريقة فعالة لدراسة كميا تعصيب البطني في نماذج القوارض من أمراض الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة جامعة توماس جيفرسون رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام وأجرى وفقا لتوجيهات مجلس الاتحادات الأوروبية (2010/63 / الاتحاد الأوروبي، 86/609 / EEC و87-848 / EEC)، ودليل المعاهد الوطنية للصحة ل رعاية واستخدام حيوانات المختبر، وجمعية للسياسات العلوم العصبية على استخدام الحيوانات في البحوث العصبية.

1. إمكانات عمل العضلات مجمع (CMAPs)

  1. إعداد الحيوان:
    1. تخدير الفئران باستخدام المستنشق (الأيزوفلورين) في 1-2٪ تسليمها إلى تأثير أو عن طريق الحقن (الكيتامين، زيلازين، آسيبرومازين). جرعة التخدير عن طريق الحقن كما يلي: 95.0 ملغم / كغم من الكيتامين، 10.0 ملغم / كغم من زيلازين، 0.075 ملغم / كغم من آسيبرومازين.
      ملاحظة: نحن بنجاح استخدام كل المستنشق والنهج حقن مخدر عند إجراء هذا البروتوكول تسجيل CMAP، دون تفضيل.
    2. يجب الحفاظ على الحيوان في لالمناسببدء عمق nesthetic قبل الجراحة، من خلال إبرام الجراحة، وحتى البوبرينورفين بعد العملية اتخذت تأثير. تأكيد التخدير المناسبة من قبل وجيزة قرصة أخمص قدميه لتحديد أن الرد الانسحاب ليس أثار. بالإضافة إلى ذلك، اختبار رد الفعل القرنية مع مسحة القطن. في جميع أنحاء الإجراء الجراحي تقرر أن معدل ضربات القلب ومعدل التنفس لم تزد، مما يوحي بأن عمق مخدر أصبحت خفيفة جدا.
    3. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على عيون الحيوان لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    4. الجراح يجب أن يغسل لها / يديه بمطهر (فرك الكلورهكسيدين) قبل البدء بالجراحة. الجراح يجب ارتداء القفازات المعقمة، قناع الوجه، وثوب أو معطف المختبر نظيفة. يجب غسل جميع الصكوك وتعقيمها قبل الجراحة. إضافة شريط مؤشر التعقيم داخل عدة الوثيقة قبل التعقيم على مستوى الصكوك للتحقق من أن تعقيم كامل. الجراح ينبغيتحقق من أن خط كامل على الشريط الأسود قبل البدء بالجراحة. الشريط من خارج منطقة الجزاء، مما يدل الشريط الأوتوكلاف كذلك. إذا كانت الجراحة هي التي يتعين القيام بها على العديد من الحيوانات في نفس اليوم، وتنظيف الأدوات بين العمليات الجراحية وتعقيم في تعقيم الزجاج حبة. إذا لزم الأمر، وتعقيم طرفي أداة في جهاز التعقيم حبة الزجاج عن طريق وضع مقبض أداة في جهاز التعقيم للمرة المناسب، وإزالة الصك مع مرقئ معقم، والتبريد في حقل معقم ثم وضع نهاية الوظيفية لل الصك في جهاز التعقيم حبة الزجاج لفترة زمنية مناسبة.
    5. مرة واحدة يتم تخدير الحيوان والمكان على متن الجراحية مع السطح الظهري أسفل البطن ومواجهة بحيث الشريط يمكن استخدامها لتأمين الأمامية الحيوان لوحة العمليات الجراحية.
    6. يحلق caudally السطح البطني ابتداء من قاعدة الجمجمة، والتأكد من أن المنطقة المحيطة البطن على جانبي خط الوسط هي SHaved استنادا إلى أي يتم تسجيلها نصفي الحجاب الحاجز. تطبيق بوفيدون اليود إلى السطح حلق من الجلد.
  2. استعدادا للتسجيلات CMAP:
    1. بعد إعداد الحيوان، مكان القطب الأرض تحت الجلد في ذيل (الشكل 1).
    2. وضع تحت الجلد القطب المرجع في منطقة البطن السفلى المقابل.
    3. وضع هلام موصل على ذاتية اللصق قطاع السطح أو تسجيل القرص الكهربائي (أبعاد سطح الشريط الكهربائي: 0.5 × 3 سم)، ثم قم بوضع القطب السطح بشكل مستعرض على طول الحافة الضلعية من جانب واحد.
    4. وضع تحفيز كهربائي transcutaneously 0.5 سم الجانبية بعيدا إلى القصبة الهوائية ومتفوقة على الترقوة. إدراج الأقطاب حوالي 1.0 سم عميقة من خلال الجلد. تأمين الأقطاب باليد بحيث موقعها لا تتحرك مع التحفيز لاحقة.
      ملاحظة: زاوية تحفيز كهربائي 90 ° النسبية على الجلد في موقع مغرزن.
  3. عمل العضلات مركب المحتملة (CMAP) تسجيلات:
    1. الحصول على التسجيلات الكهربية باستخدام منشط / مكبر للصوت يليه بمساعدة الحاسوب تحليل البيانات.
    2. يجب أن يكون المعلمات التحفيز التحفيز سحب واحد 0.5 ميللي ثانية، 1.0 هرتز البقول فوق الأعظمي. يجب أن تكون السعة من التحفيز بين 6.0 و 8.0 V (الشكل 2A).
      ملاحظة: ضمن تجربة، واستخدام كثافة التحفيز بنفس السعة عبر الحيوانات. والهدف هو تحقيق أقصى قدر من السعة رد باستخدام السعة الحد الأدنى من التحفيز. من المهم أن نلاحظ أن الاستجابة الأولية التي تحدث في وقت التحفيز هو قطعة أثرية التحفيز. بالإضافة إلى ذلك، يجب الحرص على الحصول على استجابة CMAP الذي يسبقه / خط مستو مستقر بعد قطعة أثرية التحفيز، الذي هو ثم تليها الاستجابة السريعة CMAP. من أجل الحصول على مثل هذه الاستجابة، فإنه قد يكون من الضروري إعادة تنشيط و / أوأقطاب تسجيل.
    3. انتظر 30 ثانية بين التحفيز، وكرر 10 التحفيز على التوالي للحصول على استجابة المتوسط ​​(الشكل 2B - C). قياس السعة من خط الأساس إلى الذروة (الشكل 2A). إجراء تحفيز العصب الحجابي خلال مرحلة دورة التنفس الحيوان عندما لا يتم تنشيط العصب الحجابي / الحجاب الحاجز. ويمكن تكرار هذا الإجراء على نفس الحيوان لالمقابل نصفي الحجاب الحاجز.
    4. بعد نهائي دورة تسجيل CMAP، يروي الحيوان إذا كان سيتم إجراء NMJ تلطيخ. إجراء التسجيلات CMAP مرارا وتكرارا على نفس الحيوان تقريبا مرة كل أسبوع (أو في فترة الاختيار).
    5. بعد بقاء CMAP التسجيلات، تسمح الحيوانات لاسترداد على تعميم سادة التدفئة بالماء الساخن، ورصد مستمر خلال فترة الانتعاش حتى راقد مستيقظا وsternally. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. </ لى>
    6. مرة واحدة راقد sternally، ومراقبة الحيوانات كل 12 ساعة لساعة 48 الأولى (مرة واحدة يوميا بعد ذلك). إذا كان الحيوان يبدو المجففة (الجلد الرخو، وفتور الهمة)، إدارة السوائل (الحل قارعو الأجراس أفرز اللبن؛ تحت الجلد؛ 1-2 مل لكل الحقن، مع مواقع استدارة، 2 مرات في اليوم الواحد) حتى الوزن بعد العمليات الجراحية وفقدان السوائل يستقر. توفير الحيوانات مع الطعام اللين في أطباق صغيرة خلال الفترة اللاحقة للعمليات الجراحية الحادة إذا لزم الأمر لتشجيع تناول الطعام إذا لم يتمكنوا من الوصول إلى وحدة التغذية أسياخ الغطاء.
    7. إدارة البوبرينورفين بجرعة 0.05 مغ / كغ قبل نهاية عملية جراحية وبعد ذلك في 12 ساعة فترات للساعة 24 الأولى (وتعتمد على علامات الألم / الإجهاد بعد ذلك) عن طريق الحقن تحت الجلد (موقع استدارة). إذا لاحظت علامات الألم أو الضيق بعد ذلك، وعلاج الحيوانات مع البوبرينورفين. علامات تدل على الألم / الشدة تشمل قلة النشاط، الالفاظ، وعدم الأكل أو الشرب (الجفاف)، وفقدان الوزن الزائد، وحراسة، غير شاملessive القضم أو الخدش في موقع شق. وتشمل معايير إضافية تستخدم في تحديد الألم والضيق تجاوب للمؤثرات دخيلة، النطق عابر أو غير مبرر، جاهد أو غير طبيعي في التنفس، والثابتة البني المحمر التفريغ الأنفية occular، انتصاب الشعر ملحوظ. رصد أيضا دليل على سوء النظافة التي من شأنها أن توحي الحيوانات السيئة. إذا كان لا يزال لاحظت الحيوانات أن تكون في محنة بعد 72 ساعة من العلاج (وفقا لمعايير الألم / الإجهاد الخطوط العريضة أعلاه، وبعد تلقي وصف بروتوكول مسكن أعلاه) الموت ببطء الحيوان.

2. الحجاب الحاجز الموصل العصبي العضلي (NMJ) تحليل

  1. تشريح الحيوان:
    1. إدارة الحيوان جرعة زائدة من التخدير عن طريق الحقن (3 مرات الجرعات المستخدمة أعلاه: الكيتامين في 285.0 ملغم / كغم، زيلازين في 30.0 ملغ / كغ، آسيبرومازين في 0.225 ملغ / كغ، تدار داخل الصفاق). بعد جرعة زائدة، يجب أن يكون جميع الحيوانات طريقة ثانية للقتل الرحيم (بضع الصدر) رس ضمان الموت. وينبغي تأكيد الوفاة من خلال مراقبة السكتة القلبية والتنفسية وبملاحظة التلاميذ الثابتة والمتوسعة الحيوان.
    2. إجراء عملية فتح البطن مع مشرط أو مقص تشريح تمديد الختان من عملية zyphoid caudally على طول خط الوسط. فصل بعناية الجلد والنسيج الضام من العضلات الكامنة باستخدام مشرط وملقط.
    3. في حين سحب ما يصل على عملية zyphoid، استخدم مقص تشريح لإزالة الحجاب الحاجز كله، وضمان أن الحجاب الحاجز لا تزال متمسكة المحيطة العظام. وهذا أمر مهم لأنها سوف تمنع تلف في عضلة الحجاب الحاجز، وسيسمح للتشريح ناجحة من الحجاب الحاجز بأكمله وسوف تساعد في تنظيف العضلات لتلطيخ لاحقة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، الحيوان يمكن perfused لإذا لزم الأمر.
  2. التنظيف وتلطيخ الحجاب الحاجز:
    1. ماهيتها كله تشريح الحجاب الحاجز، والسطح العلوي مواجها لها، لمطاط السيليكون في كوب طبق بيتري 100 ملم في4٪ لامتصاص العرق (صنع في 1٪ الفوسفات مخزنة المالحة - PBS) لمدة 20 دقيقة باستخدام stereomicroscope. تمدد الحجاب الحاجز لجعله مشدود، وباستخدام دبابيس الحشرات، وماهيتها والأنسجة المحيطة بها لتجنب توجيه اللوم عضلة الحجاب الحاجز نفسه (الشكل 3).
    2. تنظيف بعناية من النسيج الضام فقط من السطح العلوي للعضلة مع # 5 ملقط ومقص صغير.
      ملاحظة: القيام بجميع الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول تلطيخ هزاز ببطء في درجة حرارة الغرفة مغطاة من الضوء ما لم ينص على خلاف ذلك. تأكد من أن عضلة الحجاب الحاجز هو دائما مغمورة تماما في السائل لتجنب جفاف.
    3. قبل تلطيخ، وإعداد جميع الكواشف اللازمة ما يلي: 1X PBS، 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) / PBS، 0.1 M الجلايسين المحرز في 2٪ BSA / PBS، و 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X، و 0.2٪ TBP (0.2 ٪ تريتون X100 في 2٪ BSA / PBS). كن متأكدا من قبل بارد الميثانول في -20 ° C.
    4. غسل 3X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X.
    5. احتضان في 0.1 M الجلايسين (صنع في 2٪ BSA / PBS) لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان في RBTX (رودامين مترافق α-بنغاروتوكسين) حل لمدة 15 دقيقة. حل لRBTX كما يلي: رودامين مترافق ألفا بنغاروتوكسين 1: 400 التخفيف في برنامج تلفزيوني 1X.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم استخدام الرودامين، ولكن أي fluorophore الاختيار يمكن أن تستخدم لتلوين.
    7. غسل 3X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X.
    8. في الثلاجة -20 درجة مئوية، واحتضان مع MeOH لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة MeOH قبل وضع العضلات في الثلاجة، وإزالة الحل فورا بعد فترة الحضانة.
    9. غسل 3X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X.
    10. كتلة في 0.2٪ TBP لمدة 1 ساعة (0.2٪ تريتون المحرز في 2٪ BSA / PBS).
    11. احتضان مع حل الأجسام المضادة الأولية (في 0.2٪ TBP) في 4 درجات مئوية خلال الليل في حين هزاز. التخفيفات الأجسام المضادة على النحو التالي: SV2 (01:10) وSMI-312 (1: 1000).
    12. غسل 3X لمدة 10 دقيقة مع 0.2٪ TBP.
    13. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية باستخدام 1: 100 التخفيف من FGM1 (ماعز FITC مترافق مكافحة الفأر مفتش1؛ المحرز في 0.2٪ TBP)، في حين هزاز لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يحفظ بعيدا عن الضوء لبقية بروتوكول لتلطيخ.
    14. غسل 3X لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X.
    15. إعادة نظيفة المحيطة النسيج الضام على متفوقة (انظر أعلاه) سطح العضلات قبل التركيب و coverslipping.
      ملاحظة: من المستحسن لتنظيف ومن ثم تحميل عينة مباشرة بعد تلطيخ. ومع ذلك، إذا يمكن تغطيتها اللازمة، عينة في برنامج تلفزيوني 1X، ملفوفة في parafilm لمنع التبخر وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع، مع تغيير في برنامج تلفزيوني يوميا.
    16. على المتزايدة على شريحة زجاجية، ساترة مع غير hardset-Vectashield. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة لمنع جفاف. متجر الشرائح الاستلقاء في مجلدات شريحة من الورق المقوى في -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل.
  3. التحليل والتصوير متحد البؤر:
    1. تحليل كمي لمورفولوجية الملون والتي شنت نصفي الحجاب الحاجز تحت 20X 40X والتكبير باستخدام epifluorescence تستقيمالمجهر.
      ملاحظة: نظرا لأن ملطخة الحجاب الحاجز وتحليلها بطريقة كله جبل، والعضلات سميكة جدا. ونتيجة لذلك، فإن معظم تلطيخ مضان تماما من التركيز عند أخذ صورة ثابتة باستخدام غير متحد البؤر المجهري مضان. لهذا السبب، فمن الأفضل لإجراء تحليل NMJ في الوقت الحقيقي على المجهر وهذا يتيح لك التركيز باستمرار "حتى" و "القاعدة" من خلال العضلات لتحديد بشكل صحيح مورفولوجية كل من لل NMJs الفردية. باستخدام هذا النهج، يمكن للمرء بسهولة تتبع مسار المحاور الحركية الفردية لأنها تتحرك من خلال الأنسجة في العلاقة المكانية لتجمعات مستقبلات بعد متشابك.
    2. عن طريق قياس طول بطني، لالظهري من العضلات، وتقسيم العضلات إلى 3 أقسام منفصلة للتحليل استنادا إلى أنماط تعصيب الطبوغرافية من مستويات الحبل الشوكي محددة (الشكل 4H).
    3. ابتداء من المنطقة البطنية من العضلات وسائل التحققجي ظهريا، وتحليل كل EN لل NMJs وجه تقع على ألياف العضلات السطحية. لا نحلل ألياف العضلات أعمق من ألياف 3-4 أول من السطح كما التفسير قد يكون صعبا بسبب اختراق الأجسام المضادة الأكثر فقرا (RBTX تخترق أعمق بكثير في العضلات نظرا لصغر حجم السم مقارنة مع الأجسام المضادة اكبر يستخدم لوصف الخلايا العصبية).
    4. تحديد كل NMJ كما سليمة إذا كان محور عصبي قبل النهائي للالخلايا العصبية سميكا في قطر وجميع مناطق الأعصاب الطرفية تتداخل تماما مع مستقبلات الأستيل كولين العضلات الأساسية (ACHRS).
    5. تحديد كل NMJ كما مزالة العصب جزئيا إذا أي منطقة من مناطق ACHRS العضلات الكامنة غير مأهولة مع ما يقابلها من الأعصاب الطرفية.
    6. تحديد كل NMJ كما مزالة العصب تماما إذا كان ACHRS العضلات ليس لديهم المقابلة الأعصاب الطرفية (من المهم أيضا أن يكون لل NMJs أخرى مع الخلايا العصبية المسماة في نفس مجال التركيز، بحيث يمكن للمرء أن يكون على يقين من عدم وجود الأعصاب الطرفية ليس مجرد نتيجة ل برازص اختراق الأجسام المضادة في تلك المنطقة من العضلات).
    7. تحديد كل NMJ كما معصب تتضاعف إذا كان هناك أكثر من قبل طرفي محور عصبي التعصيب وNMJ الفردية (وهذا يدل على أنه كان هناك مستوى معين من إزالة التعصيب والمحاولات المحتملة لعودة التعصيب في هذا التقاطع).
    8. تحديد كل NMJ كما معصب رقيقة إذا كان لدى NMJ التداخل الكامل بين الأعصاب الطرفية وACHRS الكامنة ولكن لديه محور عصبي قبل محطة رقيقة (وهذا يدل أيضا على مستوى معين من إزالة التعصيب ومحاولات عودة التعصيب).
    9. إجراء تحليل لكل من المناطق التي تم تحديدها 3 لجميع الفئات المذكورة أعلاه NMJ لكل حيوان. متوسط ​​البيانات من كل حيوان مع النتائج من الحيوانات الأخرى من نفس المجموعة التجريبية. يجب أن يكون كميا حوالي 200-300 تقاطعات في الفئران نصفي الحجاب الحاجز العضلات و150-200 في الماوس نصفي الحجاب الحاجز في 3 على الأقل (يفضل 6/5 أو أكثر) الحيوانات في المجموعة التجريبية.
    10. الحصول على صور عالية الدقة مبائر، واستخدامد للنشر، مع المجهر متحد البؤر.
    11. الحصول Z-مداخن عند 0.3 ميكرون خطوة حجم 20-40 ميكرومتر الأعماق، وجمع المقاطع البصرية إضافية فوق وتحت كل تقاطع للتأكد من أن ملف متشابك بأكمله يتم تضمين.
    12. استخدام برنامج الحصول على إعادة Z-سلسلة الصور في التوقعات كثافة القصوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تلقت الكبار الفئران سبراغ داولي إما الثقب فقط (مراقبة يصب بأذى) أو من جانب واحد نصفي كدمة SCI في C4 مستوى النخاع الشوكي 10-12. في 5 أسابيع بعد الجراحة، وذروة CMAP السعة سجلت من-هيمي الحجاب الحاجز المماثل إلى موقع الثقب / إصابة انخفض بشكل ملحوظ في الفئران اصابات النخاع الشوكي (الشكل 2C) مقارنة-الثقب الوحيد التحكم (الشكل 2B). وكانت جميع لل NMJs في نصفي الحجاب الحاجز سليمة تماما في السيطرة غير المريضة البرية من نوع الفئران (الشكل 4A، C). على العكس من ذلك، أظهرت الفئران SOD1 G93A (نموذجا القوارض من ALS) أمراض كبير في لل NMJs-هيمي الحجاب الحاجز (الشكل 4B)، بما في ذلك إزالة التعصيب الكامل (الشكل 4G، رأس السهم)، إزالة التعصيب جزئي (الشكل 4E، رأس السهم، الشكل 4G، NMJ على اليمين)، تعصيب المتعدد (الشكل 4D) والمحاور قبل محطة رقيقة (الشكل 4F، رأس السهم).

الشكل 1
الشكل 1: CMAP وضع قطب كهربائي. يوضع القطب الأرض تحت الجلد في الذيل. يوضع القطب المرجع في البطن. يتم وضع القطب تسجيل سطح بالعرض على طول الحافة الضلعية من جانب واحد. وصفت تحفيز كهربائي على حد سواء الأحمر والأسود. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: التسجيلات CMAP والتحليل (A) السعة الاستجابة CMAP يمكن أن تقاس من خط الأساس إلى الذروة. رد CMAP نموذجية ينبغي أن تظهر كل من القطع الأثرية التحفيزومنحنى الاستجابة. (B - C) التمثيلية متوسط ​​استجابات CMAP. ينبغي أن يتم التحفيز من عشر مرات على الأقل على التوالي للحصول على متوسط ​​المتكرر للاستجابة. المعروضة هنا هي لالثقب فقط الفئران لم يصب (B) ومقارنة ردود CMAP لالفئران المصابين التي تلقت C4 من جانب واحد نصفي كدمة (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: إعداد الحجاب الحاجز لكامل جبل تلطيخ. يجب وضع دبابيس الحشرات إلى الأنسجة المحيطة لتأمين نصفي الحجاب الحاجز إلى Sylgard. تجنب وضع دبابيس في العضلات نفسها. في هذه الصورة، وتظهر كل من العضلات-هيمي الحجاب الحاجز وتمركزها سيباrately. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4: الظواهر NMJ. أجري التصوير متحد البؤر لتصور مستقبلات الأستيل كولين بعد متشابك (باللون الأحمر المسمى مع رودامين مترافق α بنغاروتوكسين) والألياف محور عصبي ومحطات قبل متشابك (باللون الأخضر المسمى مع SMI-32 و SV2 الأجسام المضادة، على التوالي). وكانت جميع لل NMJs في نصفي الحجاب الحاجز سليمة تماما في السيطرة غير المريضة الفئران البرية من نوع (A، C). على العكس من ذلك، أظهرت الفئران SOD1 G93A (نموذج القوارض ALS) أمراض كبير في لل NMJs-هيمي الحجاب الحاجز (B)، بما في ذلك إزالة التعصيب كامل (G، رأس السهم)، إزالة التعصيب جزئي (E، رأس السهم، G (D) والمحاور قبل محطة رقيقة (F، رأس السهم). عضلة الحجاب الحاجز هي مقسمة إلى ثلاثة أقسام منفصلة لتحليل NMJ مورفولوجيا (H) 13. شريط النطاق: 25 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما تم تسوية وظيفة الجهاز التنفسي في كل من الصدمة SCI وALS وتطوير العلاجات التي تستهدف التنفس وتحديدا تعصيب الحجاب الحاجز هي ذات الصلة سريريا 5،6. من أجل دراسة شاملة وظيفة الجهاز التنفسي، يجب استخدام أسلوب نهج موحد. CMAPs قياس درجة تعصيب وظيفي من الحجاب الحاجز عن طريق تحفيز العصب الحجابي الخارجي، ولكن ليس الذاتية محرك التنفسي البصلي النخاعي 8. بالإضافة إلى ذلك، هذه التسجيلات لا تسمح لفحص تغيرات شكلية في NMJ، ولا سيما على مستوى المحاور الحركية الفردية ومستقبلات الأستيل كولين بعد متشابك. باستخدام بروتوكول تلطيخ وصفها، يمكن للمرء أن تقييم كمي الظواهر المورفولوجية ذات الصلة، مثل إزالة التعصيب كاملة، إزالة التعصيب جزئي وتنتشر حتى التجدد وعودة التعصيب عند لل NMJs الفردية للعضلة الحجاب الحاجز 9.

ومع ذلك، فإن هذه بروتو اثنينCOLS لا يزال لا تلتقط الكامل لجميع جوانب أمراض الجهاز التنفسي. على سبيل المثال، في حال حدوث إصابة في المحاور بصلي نخاعي تنازلي دون أي ضرر على بركة PhMN أو العصب الحجابي، سعة CMAP قد لا تزال تظهر العادي الرغم من وجود ضعف كبير في هذه الدوائر بسبب العصب الحجابي يتم تحفيز خارجيا 14. الأهم من ذلك، CMAPs لا تسمح لقياس الذاتية محرك التنفسي فوق الشوك. وعلاوة على ذلك، CMAPs لا توفر قدرا من التهوية الشاملة. قد يكون من المفيد إجراء، على سبيل المثال، تخطيط التحجم الجسم كله لدراسة السلوك التنفس الشامل وعفوية التسجيلات EMG داخل العضلات والتسجيلات العصب الحجابي لاختبار التنشيط PhMN الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للنهج أخرى مثل قياس مستويات غازات الدم توفر معلومات هامة عن وظيفة الجهاز التنفسي 15. قد يكون من الممكن أيضا أن تستخدم الحجاب الحاجز وصفها CMAP تقنية لتسجيل رقم وحدة المحرك تقدير16، على الرغم من أننا لم يحاول ذلك. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن هذين البروتوكولين وقد وصفت لالعضلات التنفسية واحد فقط، والحجاب الحاجز. ومع ذلك، هناك غيرها من الشهيق والزفير عضلات الجهاز التنفسي مثل intercostals التي يمكن دراستها والتي تتأثر أمراض مثل اصابات النخاع الشوكي وALS.

في هذا البروتوكول، وصفنا CMAP الحجاب الحاجز وتحليل NMJ تحديدا في نموذج الفئران. أوجه التشابه بين الفئران والجرذان تجعل نقل كل من هذه التقنيات على الفئران مباشرة. أظهرنا سابقا أن فقدان جزئي للPhMNs التالية كدمة عنق الرحم SCI لا يؤدي إلى انخفاض قابلة للقياس الكمي في الحجاب الحاجز CMAP السعة التي ترتبط مع الصرفي NMJ إزالة التعصيب. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا هذا العجز في كل من الفأر والجرذ 17 10-12 نماذج اصابات النخاع الشوكي. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا للقياس الحد CMAP الحجاب الحاجز في كل من الفأر والفئران 13،19 18 نماذج من ALS ( G93A) التي ترتبط مع أكثر دهاء الحجاب الحاجز إزالة التعصيب بواسطة PhMNs مقارنة مع اصابات النخاع الشوكي العنقي، ولقد أثبتنا أننا يمكن الكشف عن الآثار العلاجية أصغر نسبيا على CMAP السعة من التدخلات مثل زرع الخلايا الجذعية في هذه النماذج ALS 19 . بشكل جماعي، هذه النتائج تدل على جدوى استخدام هذه التحاليل لتقييم كمي كل من التقييم الوظيفي والصرفي من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل PhMNs في كلا النموذجين الجرذان والفئران اصابات النخاع الشوكي وALS.

من خلال الجمع بين النسيجية والتقنيات الفنية المفصلة في هذا البروتوكول لفحص التنفس والغدد العرقية في NMJ، فهم أفضل يمكن الحصول عليها في أمراض الجهاز العصبي يرتبط ضعف الحجاب الحاجز، وبالتالي توفير المزيد من الوعي كيفية استهداف العلاجات في النماذج الحيوانية، وفي نهاية المطاف في المرضى .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Fisher T353-500 Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4
1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0.1 M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Concentration 1:400
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 Concentration 1:1,000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1 Roche 3117731001 Concentration 1:100
Silicone rubber Sylgard, Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium Vector laboratories H-1000 This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51
Software for CMAP recordings Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes Natus neurology 019-409000
Subdermal needle electrodes Natus neurology 019-453100
Conductive gel Aquasonic 122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings BioAMP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
  2. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  3. Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
  4. Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
  5. Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
  6. Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
  7. Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
  8. Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
  9. Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
  11. Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
  12. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  13. Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
  14. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  15. Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
  16. Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
  17. Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
  18. Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
  19. Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).

Tags

علم الأعصاب، العدد 99، مجمع إمكانية عمل العضلات، الحجابي الخلايا العصبية الحركية، العصب الحجابي، والحجاب الحاجز، تعصيب، إزالة التعصيب، تبرعم، الموصل العصبي العضلي، NMJ، واصابات الحبل الشوكي، SCI، والتصلب الجانبي الضموري، ALS، وظيفة الجهاز التنفسي
التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Li, K., Wright, M. C.,… More

Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52605, doi:10.3791/52605 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter