Introduction
La sclérose latérale amyotrophique (ALS) est une maladie débilitante des neurones moteurs associés à la perte des deux neurones moteurs supérieurs et inférieurs et en conséquence une paralysie musculaire. Lors du diagnostic, la survie des patients est en moyenne de seulement 2-5 ans 1. Phrénique motoneurone (PhMN) la perte est une composante essentielle de la pathogenèse de la SLA. Les patients finissent par mourir à cause de la perte de PhMN innervation du diaphragme, le muscle principal de l'inspiration 2,3. Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est également un sérieux problème avec des difficultés respiratoires associés. Environ 12 000 nouveaux cas de SCI se produisent chaque année 4 en raison de dommages traumatiques de la moelle épinière. Malgré l'hétérogénéité de la maladie par rapport à l'emplacement, le type et la gravité, la majorité des cas SCI implique un traumatisme à la moelle épinière cervicale, ce qui se traduit souvent par une insuffisance respiratoire invalidante et persistante. En plus de la SLA et SCI, autre système nerveux central (SNC) peut être associée wdysfonctionnement respiratoire diaphragmatique vec 5,6.
Le nerf phrénique est un nerf moteur efférent qui innerve l'hémi-diaphragme ipsilatéral et qui provient de corps cellulaires PhMN situés dans les niveaux C3-C5 de la moelle épinière cervicale homolatérale. PhMN sortie est contrôlé par décroissant entrée bulbospinal du tronc cérébral dans une zone connue sous le nom du groupe rostrale ventrale respiratoire (rVRG) 7. Le circuit rVRG-PhMN diaphragme est au cœur du contrôle de la respiration inspiratoire, ainsi que d'autres comportements à membrane non-ventilatoires. Diverses blessures traumatiques et des troubles neurodégénératifs qui affectent ces circuits peuvent conduire à une baisse profonde de la fonction respiratoire et la qualité de vie des patients. Décroissant entrée PhMNs de la survie rVRG, PhMN, l'intégrité du nerf phrénique et l'innervation correcte à la jonction neuromusculaire diaphragme (NMJ) sont tous nécessaires pour le fonctionnement de la membrane normale. Il est donc important d'utiliser des techniques quipeut évaluer quantitativement ce circuit in vivo dans des modèles de rongeurs de la SLA, SCI et d'autres maladies du SNC.
Avec ce protocole, l'objectif est de décrire les outils expérimentaux pour évaluer PhMN innervation du diaphragme à la fois au niveau électrophysiologiques et morphologiques. Composé potentiels d'action musculaire (CMAP) sont enregistrées en stimulant tous les axones moteur efférent de neurones d'un nerf moteur donnée, puis analyser la réponse de dépolarisation élicite des myofibres cibles. Cette technique peut être utilisée in vivo chez des rats et des souris anesthésiées à quantifier innervation fonctionnelle de l'hémi-diaphragme par PhMNs 8. En raison du fait que CMAP représentent enregistrement simultané de tous (ou au moins beaucoup de / la plupart) myofibres de l'ensemble de l'hémi-diaphragme, il est utile d'examiner également les phénotypes des axones et myofibres automobiles individuels au NMJ de diaphragme afin de suivre la maladie - et des changements morphologiques thérapie pertinentes telles que partielle et complete dénervation, germination régénérative et réinnervation. Ceci peut être accompli via l'ensemble du support immunohistochimie (IHC) de la membrane, suivie d'une évaluation morphologique de NMJs individuels à travers le muscle 9. Combinant CMAP et l'analyse NMJ offre une approche puissante pour étudier quantitativement innervation diaphragmatique dans des modèles rongeurs de la maladie SNC et du SNP.
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Protocol
Les procédures expérimentales ont été approuvés par le comité de l'Université Thomas Jefferson de protection des animaux et de l'utilisation et menées en conformité avec la directive Communautés européennes Conseil (2010/63 / UE, 86/609 / CEE et 87-848 / CEE), le NIH Guide pour la les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, et la Société pour les politiques de Neuroscience sur l'utilisation d'animaux dans la recherche en neurosciences.
1. Les potentiels d'action composé de Muscle (CMAP)
- Préparation de l'animal:
- Anesthésier le rat en utilisant un inhalant (isoflurane) à 1-2% livrés à effet ou par injection (kétamine, xylazine, acépromazine). Dosage de l'anesthésie injectable est la suivante: 95,0 mg / kg de kétamine, 10,0 mg / kg de xylazine, 0,075 mg / kg de l'acépromazine.
NOTE: Nous utilisons avec succès à la fois inhalées et anesthésique injectable approches lors de la conduite de ce protocole d'enregistrement CMAP, sans préférence. - L'animal doit être maintenue à l'une appropriéenesthetic profondeur avant la chirurgie est commencé, grâce à la conclusion de la chirurgie, et jusqu'à ce que la buprénorphine post-opératoire a pris effet. Confirmez anesthésie appropriée par un bref pincement de l'orteil pour déterminer qu'une réponse de retrait n'a pas suscité. En outre, de tester le réflexe cornéen avec un coton-tige. Tout au long de la procédure chirurgicale, déterminer que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire ont pas augmenté, ce qui suggère que profondeur de l'anesthésie est devenue trop léger.
- Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Le chirurgien doit la laver / ses mains avec un désinfectant (chlorhexidine gommage) avant de commencer la chirurgie. Le chirurgien doit porter des gants stériles, masque et blouse ou un sarrau propre. Tous les instruments doivent être lavés et stérilisés à l'autoclave avant la chirurgie. Ajouter une bande d'indicateur de stérilisation à l'intérieur du kit de bord avant passage à l'autoclave, au niveau des instruments pour vérifier que la stérilisation est terminée. Le chirurgien doitvérifiez que l'ensemble de la ligne sur la bande est noir avant de commencer la chirurgie. Collez l'extérieur de la boîte avec du ruban autoclave indiquant ainsi. Si la chirurgie doit être réalisée sur plusieurs animaux le jour même, le nettoyage des instruments entre les chirurgies et stériliser dans un stérilisateur à billes de verre. Si nécessaire, stériliser les deux extrémités de l'instrument dans le stérilisateur à billes de verre en plaçant la poignée de l'instrument dans le stérilisateur pendant le temps approprié, la suppression de l'instrument avec une pince hémostatique stérile, en le refroidissant dans un champ stérile, puis en plaçant l'extrémité fonctionnelle de l'instrument dans le stérilisateur à billes de verre pour la période de temps appropriée.
- Une fois que l'animal est anesthésié, lieu à bord chirurgicale avec la surface dorsale vers le bas et vers le haut de l'abdomen de sorte que la bande peut être utilisé pour sécuriser les pattes avant de l'animal à bord chirurgicale.
- Rasez ventrale caudale de la surface à partir de la base du crâne, et veiller à ce que la zone autour de l'abdomen de chaque côté de la ligne médiane est shAved selon hémi-diaphragme qui est en cours d'enregistrement. Appliquer la povidone-iode à la surface rasée de la peau.
- Anesthésier le rat en utilisant un inhalant (isoflurane) à 1-2% livrés à effet ou par injection (kétamine, xylazine, acépromazine). Dosage de l'anesthésie injectable est la suivante: 95,0 mg / kg de kétamine, 10,0 mg / kg de xylazine, 0,075 mg / kg de l'acépromazine.
- Préparation pour les enregistrements CMAP:
- Après la préparation des animaux, placer l'électrode de terre sous-cutanée dans la queue (Figure 1).
- Placez la voie sous-cutanée de l'électrode de référence dans la région inférieure de l'abdomen controlatéral.
- Placez gel conducteur sur la bande de surface auto-adhésive ou électrode d'enregistrement de disque (dimensions de surface électrode en bande: 0,5 x 3 cm), puis placer l'électrode de surface transversalement le long du rebord costal unilatérale.
- Placez électrodes de stimulation transcutanée 0,5 cm en dehors de la trachée et latérales supérieures à la clavicule. Insérer les électrodes d'environ 1,0 cm de profondeur à travers la peau. Fixez les électrodes à la main de sorte que leur emplacement ne se déplace pas avec stimulations ultérieures.
NOTE: Angle électrodes 90 ° par rapport à la peau au niveau du site de stimulation insertion.
- Composé Muscle potentiel d'action (CMAP) Enregistrements:
- Obtenir des enregistrements électrophysiologiques en utilisant un stimulateur / amplificateur suivi d'analyse assistée par ordinateur des données.
- Les paramètres de stimulation de stimulation de traction unique devraient être de 0,5 ms, 1,0 Hz impulsions supramaximales. L'amplitude du stimulus doit être compris entre 6,0 et 8,0 V (figure 2A).
REMARQUE: Dans une expérience, en utilisant une intensité de stimulation avec la même amplitude sur les animaux. L'objectif est de maximiser l'amplitude de la réponse à l'aide de l'amplitude minimale de stimulation. Il est important de noter que la réaction initiale qui se produit au moment de la stimulation est un artefact de stimulation. En outre, il faut prendre soin d'obtenir une réponse CMAP qui est précédé par une ligne de base stable / plat après l'artefact de stimulation, qui est ensuite suivie par la réponse rapide CMAP. Afin d'obtenir une telle réponse, il peut être nécessaire de repositionner la stimulation et / oudes électrodes d'enregistrement. - Attendre 30 secondes entre les stimulations, et répétez 10 stimulations dans une rangée pour obtenir la réponse moyenne (Figure 2B - C). Mesurer l'amplitude du départ à la crête (figure 2A). Mener la stimulation du nerf phrénique pendant la phase de cycle respiratoire de l'animal lorsque le nerf phrénique / diaphragme est pas activé. La procédure peut être répétée sur le même animal pour l'hémi-diaphragme controlatéral.
- Après la dernière session d'enregistrement de CMAP, perfuser l'animal si NMJ coloration sera réalisée. Effectuer enregistrements CMAP à plusieurs reprises sur le même animal environ une fois par semaine (ou à intervalle de choix).
- Après survie enregistrements CMAP, permet animal à récupérer sur un coussin chauffant de l'eau chaude circulant et surveillent continuellement lors de la récupération jusqu'à couché éveillé et sternally. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. </ Li>
- Une fois sternally couché, surveiller l'animal toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures (une fois par jour par la suite). Si l'animal semble être déshydraté (peau flasque, apathie), administrer des fluides (solution de sonneurs lactate; sous-cutanée; 1-2 ml par injection, avec les sites rotation; 2 fois par jour) jusqu'à poids post-chirurgicale et de la perte de liquide stabilise. Fournir des animaux avec de la nourriture ramollie dans de petits plats durant la période post-opératoire aiguë si nécessaire pour encourager manger si elles ne peuvent pas atteindre le chargeur fil barre de couvercle.
- Administrer la buprénorphine à une dose de 0,05 mg / kg avant la fin de la chirurgie, puis à intervalles de 12 h pour les 24 premières heures (et dépend des signes de douleur / le stress par la suite) par injection sous-cutanée (site de rotation). Si des signes de douleur ou de détresse sont remarqués par la suite, traiter les animaux avec la buprénorphine. Signes distinctifs de la douleur / détresse comprennent le manque d'activité, vocalisations, absence de manger ou de boire (déshydratation), perte de poids excessive, gardiennage, excessif rongeant ou en grattant site d'incision. Des critères supplémentaires utilisées dans la détermination de la douleur et de la détresse comprennent l'absence de réponse à des stimuli externes, la vocalisation transitoire ou non provoquée, respiration laborieuse ou anormale, décharge naso-oculaire brun rougeâtre persistante, horripilation marquée. Surveiller également des preuves d'une mauvaise hygiène qui suggérerait animaux malades. Si l'animal est toujours observée en détresse après 72 heures de traitement (selon les critères douleur / de stress décrire ci-dessus, et après avoir reçu le protocole analgésique décrit ci-dessus) euthanasier l'animal.
2. Diaphragme jonction neuromusculaire (JNM) Analyse
- Dissection des animaux:
- Administrer l'animal une surdose de l'anesthésie injectable (3 fois la dose utilisés ci-dessus: la kétamine à 285,0 mg / kg, xylazine à 30,0 mg / kg, l'acépromazine à 0,225 mg / kg; administré par voie intrapéritonéale). Après un surdosage, tous les animaux devraient avoir une deuxième méthode d'euthanasie (thoracotomie) to garantir la mort. Mort devrait être confirmée par l'observation de l'arrêt cardiaque et respiratoire et en notant les pupilles fixes et dilatées de l'animal.
- Mener une laparotomie avec scalpel ou des ciseaux de dissection étendant l'excision du processus zyphoid caudale le long de la ligne médiane. Soigneusement séparer la peau et du tissu conjonctif du muscle sous-jacent en utilisant scalpel et pince.
- En tirant sur le processus zyphoid, utiliser des ciseaux de dissection pour enlever toute la membrane, veiller à ce que la membrane reste attaché à l'os environnant. Ceci est important car elle permet d'éviter d'endommager le muscle du diaphragme, permettra pour la dissection succès de l'ensemble du diaphragme et aidera dans le muscle de nettoyage pour coloration subséquente.
NOTE: A ce stade, l'animal peut être perfusé si nécessaire.
- Nettoyage et coloration de la membrane:
- Cerner l'ensemble disséqué diaphragme, la surface supérieure vers le haut, au caoutchouc de silicone dans un verre plat de 100 mm Petri dansParaformaldéhyde 4% (en fait 1% de phosphate saline tamponnée - PBS) pendant 20 min en utilisant un stéréomicroscope. Étirez le diaphragme pour le rendre tendu, et en utilisant des épingles insectes, épingler le tissu environnant pour éviter épinglant le diaphragme muscle lui-même (Figure 3).
- Nettoyer délicatement le tissu conjonctif à partir de seulement la surface supérieure du muscle avec # 5 forceps et de petits ciseaux.
REMARQUE: Effectuer toutes les étapes ultérieures de ce protocole de coloration bascule lentement à température ambiante couvert de la lumière, sauf indication contraire. Assurez-vous que le muscle du diaphragme est toujours complètement immergé dans un liquide pour éviter le dessèchement. - Avant la coloration, préparer tous les réactifs nécessaires: 1x PBS, 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) / PBS, 0,1 M de glycine réalisés dans 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 x PBS et 0,2% de phosphate de tributyle (0,2 % de Triton X100 à 2% de BSA / PBS). Soyez sûr d'effectuer une pré-cool méthanol à -20 ° C.
- Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x.
- Incuber dans 0,1 M de glycine (fait en 2% De BSA / PBS) pendant 30 min.
- Incuber dans RBTX (rhodamine conjugué α-bungarotoxine) solution pendant 15 min. Solution pour RBTX est le suivant: alpha-bungarotoxine Rhodamine conjugué 1: 400 dilution en PBS 1x.
REMARQUE: Dans ce protocole, la rhodamine est utilisé, mais n'importe quel fluorophore de choix peut être utilisée pour la coloration. - Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x.
- Dans congélateur à -20 ° C, incuber avec du MeOH pendant 5 min.
NOTE: Ne pas ajouter MeOH avant de placer musculaire dans le congélateur, et retirer immédiatement solution suivante de la période d'incubation. - Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x.
- Bloquer dans 0,2% TBP pendant 1 heure (0,2% de Triton faite dans 2% de BSA / PBS).
- Incuber avec une solution d'anticorps primaire (dans 0,2% de TBP) à 4 ° C pendant une nuit tout en balançant. Dilutions d'anticorps comme suit: SV2 (1:10) et SMI-312 (1: 1000).
- Laver 3x pendant 10 minutes avec 0,2% de TBP.
- Incuber avec l'anticorps secondaire à l'aide dilution 1: 100 de FGM1 (chèvre conjugué à FITC anti-souris IgG1; faite dans 0,2% TBP) en basculant pendant 1 heure.
REMARQUE: Protéger de la lumière pour le reste du protocole pour la coloration. - Laver 3x pendant 10 minutes avec PBS 1x.
- Re-propre tissu conjonctif environnant sur le supérieur (voir ci-dessus) la surface du muscle avant le montage et lamelles.
NOTE: Il est recommandé de nettoyer puis monter l'échantillon immédiatement après la coloration. Cependant, si nécessaire, l'échantillon peut être couverte en PBS 1x, enveloppé dans du parafilm pour éviter l'évaporation et stockée à 4 ° C pendant 1 semaine, avec changement de PBS par jour. - Lors du montage sur lame de verre, lamelle avec les non-hardset Vectashield. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent pour éviter le dessèchement. Stocker les lames couchées dans des dossiers de diapositives en carton à -20 ° C pour le long terme.
- Analyse et imagerie confocale:
- Analyser quantitativement la morphologie de la teinté et monté hémidiaphragme sous 20X et 40X en utilisant une épifluorescence deboutmicroscope.
NOTE: Parce que la membrane est colorée et analysé en tout-monter un mode, le muscle est assez épais. Par conséquent, plus de la coloration de fluorescence est complètement hors de mise au point lorsqu'une image statique est prise en utilisant la microscopie de fluorescence non-confocale. Pour cette raison, il est préférable de procéder à l'analyse NMJ en temps réel sur le microscope, car cela permet de vous concentrer constamment «haut» et «bas» à travers le muscle de bien identifier la morphologie de chacun des NMJs individuels. En utilisant cette approche, on peut facilement suivre la trajectoire des axones moteurs individuels comme ils se déplacent à travers le tissu en relation spatiale avec les amas de récepteurs post-synaptiques. - En mesurant la longueur ventrale-à-dorsale du muscle, il faut diviser le muscle en 3 sections distinctes pour les analyses fondées sur des motifs d'innervation topographiques de niveaux spécifiques de la moelle épinière (Figure 4H).
- Commençant à la région ventrale du muscle et moving dorsale, analyser toutes en NMJs visage situés sur les fibres musculaires de surface. Ne pas analyser fibres musculaires plus profondes que les 3-4 premières fibres de la surface comme l'interprétation peut être difficile en raison de moins bonne pénétration des anticorps (RBTX pénètre plus profondément dans le muscle en raison de la petite taille de la toxine par rapport aux grandes anticorps utilisés pour marquer les neurones).
- Identifier chaque NMJ comme intacte si l'axone pré-terminale du neurone est épaisse de diamètre et de toutes les régions de la terminaison nerveuse chevauchent complètement avec les récepteurs de l'acétylcholine des muscles sous-jacents (CCRS).
- Identifier chaque NMJ comme partiellement dénervé si aucune région des AChR musculaires sous-jacents est inoccupé avec terminaison nerveuse correspondant.
- Identifier chaque NMJ aussi complètement dénervé si les AChR musculaires avoir aucune terminaison nerveuse correspondant (il est également important d'avoir d'autres NMJs avec neurones marqués dans le même domaine de concentration, de sorte que l'on peut être sûr que le manque de terminaison nerveuse est pas simplement due à cacar de pénétration des anticorps dans cette région du muscle).
- Identifier chaque NMJ que se multiplient innervé si il ya plus d'un pré-terminale axone innervant un NMJ individu (ce qui indique qu'il ya eu un certain niveau de dénervation et les tentatives probables de réinnervation à cette jonction).
- Identifier chaque NMJ aussi finement innervés si le NMJ a chevauchement complet entre la borne de nerf et AChR sous-jacents, mais a un axone pré-terminale mince (ce qui est aussi révélatrice d'un certain niveau de dénervation et tentatives de réinnervation).
- Effectuer une analyse pour chacune des trois régions identifiées pour toutes les catégories NMJ ci-dessus pour chaque animal. La moyenne des données de chaque animal avec les résultats des autres animaux du même groupe expérimental. Environ 200-300 jonctions chez le rat hémi-muscle du diaphragme et 150-200 chez la souris hémidiaphragme devraient être quantifiés dans au moins 3 (de préférence 5-6 ou plus) animaux par groupe expérimental.
- Obtenir des images haute résolution confocale, l'utilisationd pour publication, avec un microscope confocal.
- Obtenir Z piles à 0,3 um de taille de pas de 20 à 40 um profondeurs, et recueillir sections optiques supplémentaires au-dessus et en dessous de chaque jonction de sorte que l'ensemble du profil synaptique est inclus.
- Utilisez le logiciel d'acquisition pour reconstruire des images de la série Z dans les projections d'intensité maximale.
- Analyser quantitativement la morphologie de la teinté et monté hémidiaphragme sous 20X et 40X en utilisant une épifluorescence deboutmicroscope.
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Representative Results
Adulte rats Sprague-Dawley ont reçu soit une laminectomie seulement (contrôle indemne) ou unilatérale hémi-SCI contusion au niveau de la moelle épinière C4 10-12. A 5 semaines après la chirurgie, le pic CMAP amplitude enregistrée à partir de l'hémi-diaphragme ipsilatérale au site laminectomie / blessures a été significativement réduite chez les rats SCI (figure 2C) par rapport à laminectomie seule commande (figure 2B). Tous NMJs dans l'hémi-diaphragme étaient complètement intactes chez les non-malades rats de type sauvage contrôle (figure 4A, C). Au contraire, les rats SOD1 G93A (un modèle de rongeur de la SLA) ont montré pathologie importante au NMJs hémi-diaphragme (figure 4B), y compris la dénervation complète (figure 4G, pointe de flèche), dénervation partielle (Figure 4E, flèche; Figure 4G, NMJ sur droite), innervation multiple (Figure 4D) et les axones pré-terminaux minces (figure 4F, flèche).
Figure 1: le placement des électrodes CMAP. L'électrode de masse est placé sous-cutanée dans la queue. L'électrode de référence est placé dans l'abdomen. L'électrode d'enregistrement par surface est placé transversalement le long du rebord costal unilatérale. Électrodes de stimulation sont représentés à la fois rouge et noir. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Enregistrements CMAP et d'analyse (A) L'amplitude de la réponse CMAP peuvent être mesurées à partir de la ligne de base à crête. Une réponse typique CMAP devrait montrer à la fois l'artefact de stimulationet la courbe de réponse. (B - C) des réponses CMAP moyenne représentative. La stimulation doit être effectué au moins dix fois de suite pour obtenir une moyenne répété de la réponse. Montré ici sont une laminectomie seule rat intact (B) et une comparaison des réponses CMAP pour un rat blessé qui a reçu une C4 unilatérale hémi-contusion (C). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Préparation de la membrane pour toute montage coloration. Broches insectes doivent être placés dans le tissu environnant pour garantir l'hémi-diaphragme pour Sylgard. Évitez de placer des épingles dans le muscle lui-même. Dans cette image, les deux muscles hémi-diaphragme sont affichées et cloués SEPArément. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: phénotypes NMJ. Imagerie confocale a été réalisée pour visualiser les récepteurs de l'acétylcholine post-synaptiques (en rouge marqué à la rhodamine-bungarotoxine conjugué α) et de fibres axonales et des bornes de pré-synaptiques (en vert marqué avec SMI-32 et des anticorps SV2, respectivement). Tous NMJs en hémi-diaphragme étaient complètement intactes chez les non-malades rats de type sauvage commande (A, C). Au contraire, les rats SOD1 G93A (un modèle rongeur de la SLA) ont montré pathologie importante au NMJs hémi-diaphragme (B), y compris la dénervation complète (G, pointe de flèche), dénervation partielle (E, flèche; G (D) et les axones pré-terminaux minces (F, tête de flèche). Le muscle du diaphragme est subdivisé en trois sections séparées pour NMJ analyse de morphologie (H) 13. Barre d'échelle:. 25 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Comme la fonction respiratoire est compromise à la fois SCI traumatique et la SLA, le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement la respiration et l'innervation diaphragme sont cliniquement significatives 5,6. Afin d'étudier globalement la fonction respiratoire, une méthode d'approche combinée devrait être utilisé. CMAP mesurent le degré d'innervation fonctionnelle de la membrane par le biais de la stimulation du nerf phrénique externe, mais la commande respiratoire bulbospinal pas endogènes 8. En outre, ces enregistrements ne permettent pas d'examen des changements morphologiques à la jonction neuromusculaire, notamment au niveau des axones moteurs individuels et les récepteurs de l'acétylcholine post-synaptiques. En utilisant le protocole de coloration décrit, on peut évaluer quantitativement phénotypes morphologiques pertinents tels que la dénervation complète, dénervation partielle et même germination régénérative et réinnervation au NMJs individuelles du muscle du diaphragme 9.
Néanmoins, ces deux protocols ne reflètent toujours pas pleinement tous les aspects de la pathologie respiratoire. Par exemple, en cas de blessure aux axones bulbospinal descendant sans aucun dommage pour la piscine ou PhMN nerf phrénique, CMAP amplitudes peuvent encore apparaître normale, même si il ya une altération significative de ce circuit parce que le nerf phrénique est stimulé à l'extérieur 14. Surtout, CMAP ne permettent pas pour la mesure de la commande respiratoire supraspinal endogène. En outre, CMAP ne fournissent pas une mesure de la ventilation globale. Il peut être avantageux d'effectuer, par exemple, toute la pléthysmographie d'examiner le comportement de la respiration et de l'ensemble des enregistrements EMG intra-musculaires spontanées et des enregistrements du nerf phrénique pour tester l'activation de PhMN endogène. En outre, d'autres approches telles que la mesure des niveaux de gaz de sang peuvent fournir des renseignements importants sur la fonction respiratoire 15. Il peut également être possible d'utiliser la technique d'enregistrement CMAP à membrane décrit pour le bloc moteur nombre estimation16, bien que nous ont jamais essayé cela. Il est également important de noter que ces deux protocoles ont été décrits pour un seul muscle respiratoire, le diaphragme. Cependant, il ya d'autres muscles respiratoires inspiration et d'expiration tels que les intercostaux qui peuvent être étudiés et qui sont touchés par des maladies telles que SCI et la SLA.
Dans ce protocole, nous décrivons diaphragme CMAP et l'analyse NMJ spécifiquement dans le modèle de rat. Similitudes entre les rats et les souris font le transfert de ces deux techniques à des souris simples. Nous avons montré précédemment que la perte partielle de PhMNs suivante contusion cervicale SCI ne se traduise par une diminution quantifiables à membrane CMAP amplitude qui sont en corrélation avec morphologique dénervation NMJ. En outre, nous avons démontré ces déficits dans les deux modèles de souris et de rat 17 10-12 SCI. En outre, nous avons montré quantifiable la réduction de la CMAP à membrane à la fois la souris et le rat 13,19 18 modèles de la SLA (
En combinant les techniques histologiques et fonctionnelles détaillées dans ce protocole d'examiner la respiration et l'innervation au NMJ, meilleur aperçu peut être acquise dans les maladies du système nerveux associés à un dysfonctionnement de la membrane, fournissant ainsi une plus grande prise de conscience de la façon de cibler les thérapies dans des modèles animaux et, finalement, chez les patients .
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Disclosures
Nous avons rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
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