Introduction
근 위축성 측삭 경화증 (ALS)은 상하 운동 뉴런 및 그에 근육 마비 양자의 손실과 관련된 쇠약 운동 신경 질환이다. 진단시 환자의 생존 기간은 평균 만 2~5년 1에 있습니다. 횡격막 운동 신경 (PhMN) 손실은 루게릭 병의 발병 기전의 중요한 구성 요소입니다. 환자는 궁극적으로 인해 다이어프램의 PhMN의 신경 분포, 영감 2,3의 주요 근육의 손실을 죽는다. 외상성 척수 손상 (SCI)는 또한 관련된 호흡 곤란으로 심각한 문제이다. SCI 약 12,000 새로운 사례 인한 외상성 척수 손상으로 매년 4를 발생한다. 위치, 유형 및 정도에 대한 질병 이질성에도 불구하고, SCI의 대부분의 경우는 종종 쇠약과 지속적인 호흡 타협 결과 자궁 경부 척수에 외상을 포함한다. ALS 및 SCI 이외에, 다른 중추 신경계 (CNS) 질환 w 연관 될 수있다i 번째 횡격막 호흡 부전 (5, 6).
횡격막 신경은 동측 헤미 다이어프램을 innervates 원심성 운동 신경과 그 동측 경부 척수의 C3-C5 수준에있는 PhMN의 세포 기관에서 유래. PhMN 출력 입쪽 복부 호흡 기 (rVRG) 7로 알려진 지역에서 뇌간 bulbospinal 입력 내림차순에 의해 제어된다. rVRG-PhMN 다이어프램 회로 흡기 호흡뿐만 아니라, 다른 비 - 환기 다이어프램 동작의 제어 핵심이다. 이 회로에 영향을 미치는 다양한 외상과 퇴행성 신경 질환은 호흡 기능과 환자의 삶의 질에 심각한 감소로 이어질 수 있습니다. 다이어프램 신경 근육 접합 (NMJ)에서 rVRG, PhMN 생존, 횡격막 신경 무결성 및 적절한 신경 분포에서 PhMNs에 입력을 내림차순 정상 다이어프램 기능에 대한 모든 필요하다. 이 기술을 사용하는 것이 중요하다정량적으로 루게릭 병, SCI 및 기타 중추 신경계 질환의 설치류 모델에서 생체 내에서이 회로를 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에 의해, 목표 및 전기 생리 학적 수준 모두에서 다이어프램 PhMN의 신경 분포를 평가하는 실험 도구를 설명하기위한 것이다. 복합 근 활동 전위 (CMAPs) 지정된 운동 신경의 모든 원심성 운동 신경 축삭을 자극하고 표적 근섬유의 탈분극 유발 된 응답을 분석하여 기록된다. 이 기술은 8 PhMNs 의해 헤미 다이어프램의 기능적 신경 분포를 정량화하는 마취 된 쥐 생체 내에서 사용될 수있다. 인해 CMAPs는이 헤미 진동판 전체, 또한 질병을 추적하기 위해 다이어프램 NMJ에서 개별 모터 축삭 근섬유의 표현형을 확인하는 유용한 모든 (또는 적어도 대부분 / 대부분) 근섬유의 동시 기록을 나타낸다는 사실 - 이러한 부분 및 공단 등 치료 관련 형태 학적 변화테 탈 신경, 재생 돋 reinnervation. 이것은 근육 (9)에 걸쳐 개별적인 NMJs 형태의 상세한 평가를 한 후, 진동판의 전체 실장 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 달성 될 수있다. CMAPs를 결합하고 NMJ 분석은 정량적으로 중추 신경계와 말초 신경계 질환의 쥐 모델에서 횡격막 신경 분포를 연구하기위한 강력한 방법을 제공합니다.
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Protocol
실험 절차는 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 (609분의 86 / EEC 및 87-848 / EEC 63분의 2,010 / EU) 유럽 공동체위원회 지침, 대한 NIH 가이드를 준수하여 실시 하였다 신경과 실험 동물의 사용 및 신경 과학 연구에서 동물의 사용에 대한 신경 과학의 정책에 대한 사회.
1. 복합 근육 활동 전위 (CMAPs)
- 동물 준비 :
- 주사 (케타민, 자일 라진, 아세 프로 마진) 효과 나에 의해 전달 1 ~ 2 %에 흡입 (이소 플루 란)를 사용하여 쥐를 마취. 케타민의 95.0 ㎎ / ㎏, 10.0 밀리그램 / 자일 라진의 kg, 0.075 밀리그램 / 아세 프로 마진 kg을 다음과 같이 주사 마취의 복용량이다.
참고 : 우리는 성공적으로 모두 흡입을 사용하고이 CMAP 기록 프로토콜을 수행 할 때 주 사용 마취제가없는 환경으로 접근한다. - 동물은 적절한 유지해야수술 전 nesthetic 깊이는 수술의 결론을 통해 시작되고, 수술 후 부 프레 노르 핀까지 영향을 촬영하고있다. 금단 반응이 유도되지 않는다는 것을 확인하는 간단한 발가락 핀치에 의한 적절한 마취를 확인합니다. 또한, 면봉으로 각막 반사를 테스트합니다. 수술 전반에 걸쳐, 심장 박동과 호흡 속도는 마취 깊이가 너무 빛이 될 것을 제안하는 증가하지 않았 음을 확인합니다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
- 의사는 수술을 시작하기 전에 소독제 (클로르헥시딘 스크럽)와 함께 / 그의 손을 그녀를 세척해야합니다. 의사는 멸균 장갑, 안면 마스크, 가운 또는 깨끗한 실험실 코트를 착용해야합니다. 모든 장비는 세척 및 수술 전에 멸균해야합니다. 그 멸균가 완료되었는지 확인 악기의 수준에서 고온 가압 멸균 전에 악기 키트 내부 살균 표시기 스트립을 추가합니다. 외과 의사해야스트립에 전체 라인이 수술을 시작하기 전에 검은 색인지 확인합니다. 뿐만 아니라 테이프를 오토 클레이브로 나타내는 박스의 외측을 테이프입니다. 수술 당일에 여러 동물들에 대해 수행되어야하는 경우, 수술기구를 사이에 정리하고, 유리 비드 살균기에서 살균. 필요한 경우, 멸균 지혈제와 기기를 제거하는 적절한 시간 멸균기에서 악기의 핸들을 배치 무균 영역에서 냉각 한 다음의 기능적 단부를 배치하여 유리 비드 살균기에서 악기의 양단 살균 적절한 시간의 기간 동안 유리 비드 살균기로 악기.
- 동물 마취되면, 다운 등의 표면에 수술 보드 등 그 테이프를 직면 복부 장소는 수술 보드에 동물의 앞다리를 보호하는 데 사용할 수 있습니다.
- 두개골의 기부에서 시작 복부 표면 미부 면도 및 중심선의 양쪽에 복부 주변이 SH가 있음을 확인aved 헤미 다이어프램가 기록되고있는 따라. 피부의 면도 표면에 포비돈 - 요오드 적용합니다.
- 주사 (케타민, 자일 라진, 아세 프로 마진) 효과 나에 의해 전달 1 ~ 2 %에 흡입 (이소 플루 란)를 사용하여 쥐를 마취. 케타민의 95.0 ㎎ / ㎏, 10.0 밀리그램 / 자일 라진의 kg, 0.075 밀리그램 / 아세 프로 마진 kg을 다음과 같이 주사 마취의 복용량이다.
- CMAP 녹음 준비 :
- 꼬리에 동물 준비, 장소 접지 전극의 피하에 따라 (그림 1).
- 반대측 하복부에 기준 전극 피하 놓습니다.
- 자체 접착 표면 스트립이나 디스크 기록 전극 (표면 스트립 전극의 크기 : 0.5 × 3cm)에 전도성 젤을 놓은 다음 일방적 늑골 가장자리를 따라 가로 표면 전극을 배치합니다.
- transcutaneously 0.5 cm 간격 기관에 측면과 쇄골 우수 자극 전극을 배치합니다. 피부를 통해 약 1.0 cm 깊이 전극을 삽입합니다. 자신의 위치 후속 자극으로 이동하지 않도록 손으로 전극을 고정합니다.
참고 : insertio의 사이트에있는 피부에 90 ° 상대 각도 자극 전극N.
- 복합 근육 활동 전위 (CMAP) 녹음 :
- 컴퓨터를 이용한 데이터 분석 다음에 자극 / 앰프를 사용하여 전기 생리 녹음을 얻습니다.
- 하나의 풀 자극의 자극 매개 변수를 0.5 밀리 초, 1.0 Hz에서 supramaximal 펄스를해야한다. 자극의 진폭은 V 6.0 내지 8.0 (그림 2A)이어야한다.
참고 : 실험 내에서 동물에서 동일한 진폭 자극 강도를 사용합니다. 목적은 자극의 최소 진폭을 사용하여 응답의 진폭을 최대화하는 것이다. 이는 자극시 발생 초기 응답은 자극 인공물임을 주목하는 것이 중요하다. 또한, 치료는 빠른 응답 CMAP 뒤에 자극 인공물, 이후 안정 / 평평한 기준선 앞에는 CMAP 응답을 획득하기 위해 취해 져야한다. 이러한 응답을 얻기 위해서는, 자극의 위치를 변경하는 것이 필요할 수있다 및 / 또는기록 전극. - 자극 사이에 30 초를 기다린 평균 응답 (그림 2B - C)를 얻기 위해 행에 10 자극을 반복합니다. 피크 (그림 2A)에베이스 라인에서 진폭을 측정합니다. 횡격막 신경 / 다이어프램이 활성화되지 않은 경우에 동물의 호흡주기의 단계에서 횡격막 신경 자극을 실시한다. 절차는 반대측 헤미 다이어프램 동일한 동물에 반복 될 수있다.
- NMJ 염색을 실시 할 경우 최종 CMAP 기록 세션 후, 동물을 관류. 약 한 번 같은 동물에 반복 매주 CMAP 녹음을 실시 (또는 선택의 간격).
- 생존 CMAP 녹음 후, 동물이 깨어 sternally 기댄까지 복구하는 동안 순환 온수 가열 패드에 복구하고, 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. </ 리>
- 일단 sternally 휴식하고, 동물 최초의 48 시간 (회 이후)마다 12 시간을 모니터링 할 수 있습니다. (사이트가 회전하여, 주입 당 1-2 ml의; 피하 락 테이트 벨소리 솔루션이 하루 시간) 동물이 탈수 (이완 된 피부, 마음이 내키지 않음)로 표시되면, 유체를 관리 수술 후 체중 및 유체 손실이 안정 될 때까지합니다. 그들은 와이어 바 뚜껑 공급 장치에 도달 할 수없는 경우 식사를 장려하기 위해 필요한 경우 급성 수술 후 기간 동안 작은 접시에 연화 음식과 동물을 제공합니다.
- 수술 종료 전에 0.05 ㎎ / ㎏의 용량으로 부 프레 노르 핀을 투여 한 후 12 시간 간격으로 첫 번째 24 시간 동안 (후 통증 / 스트레스 증상에 의존) 피하 주사를 통해 (위치는 회전). 통증이나 고통의 흔적은 그 후 발견하는 경우, 부 프레 노르 핀과 동물을 취급합니다. 나타내는 통증 / 고통의 징후는 활동의 부족, 발성, 식사의 부족 또는 마시는 (탈수), 과도한 체중 감소, 지키고, EXC 포함대던 또는 절개의 사이트에 긁힘 (메모리). 통증과 고통을 결정하는 데 사용되는 추가 기준은 외부 자극에 응답하지 않는, 일시적 또는 정당한 이유 발성, 고심한 흔적 또는 비정상 호흡, 지속적인 적갈색 NaSO4로 - 고 안압 방전 표시 경직을 포함한다. 또한 아픈 동물을 제안 가난한 위생의 증거를 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 여전히 치료 72 시간 후 조난 것으로 관찰되는 경우, 동물을 안락사 (상기 윤곽 통증 / 응력 기준에 따라, 수신 한 후 진통제 프로토콜은 전술).
2. 다이어프램 신경 근육 접합 (NMJ) 분석
- 동물 해부 :
- 동물에게 주사 마취의 과다 복용을 관리 (:; 복강 투여 0.225 ㎎ / ㎏에서 30.0 ㎎ / ㎏, 아세 프로 마진에서 285.0 ㎎ / ㎏, 자일 라진에서 케타민 3 회 이상 사용 복용량). 과량 후, 모든 동물은 안락사 t (개흉술)의 두 번째 방법이 있어야O 죽음을 보장합니다. 죽음은 심장과 호흡 정지를 관찰하고 동물의 고정 동공 확장을 지적으로 확인해야합니다.
- 메스 또는 해부 가위 꼬리 쪽 중간 선을 따라 zyphoid 과정에서 절제를 연장 개복술을 실시한다. 조심스럽게 메스와 집게를 사용하여 기본 근육에서 피부와 결합 조직을 분리.
- zyphoid 과정 위로 당기면서, 다이어프램이 뼈 주변에 부착 될 수 있도록 보장, 전체 다이어프램을 제거하는 해부 가위를 사용합니다. 그것은 전체 진동판의 성공적인 해부 허용되며, 격막의 근육의 손상을 방지하며 후속 염색법 근육을 세정하는데 도움이되므로 중요하다.
참고 : 필요한 경우이 시점에서, 동물 관류 할 수 있습니다.
- 청소 및 다이어프램의 염색 :
- 전체 해부 다이어프램을 핀, 우수한 표면은 유리 100mm 페트리 접시에 실리콘 고무로,이 위를 향하도록실체 현미경을 이용하여 20 분 - 4 % 파라 포름 알데히드 (PBS, 1 % 인산으로 이루어지는 완충 염수). 이 팽팽하게 다이어프램 신축성 및 곤충 핀을 이용하여, 다이어프램 근육 자체 (도 3)를 피닝 피하기 위해 주위 조직 아래에 핀.
- 조심스럽게 # 5 포셉 작은 가위로 근육의 우수한 표면에서 결합 조직을 청소합니다.
참고 : 달리 명시하지 않는 한이 염색 프로토콜이 서서히 빛 덮여 실온에서 락의 모든 후속 단계를 수행합니다. 다이어프램 근육은 항상 완전히 건조를 방지하기 위해 액체에 빠져들되어 있는지 확인합니다. - (0.2 1X PBS, 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS, BSA / PBS, 4 % 파라 포름 알데히드 1X PBS에서 (PFA), 및 0.2 % TBP 2 % 이루어진 0.1 M 글리신 : 이전 염색에 필요한 모든 시약을 준비 2 % BSA / PBS)에서 % 트리톤 X100. -20 ° C에서 메탄올 - 멋진을 미리해야합니다.
- 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배.
- 2에서 만든 0.1 M 글리신 (에 품어%의 BSA 30 분 / PBS).
- 15 분 동안 RBTX (로다 민 - 복합 α-bungarotoxin) 솔루션에 품어. 다음과 같이 RBTX에 대한 해결 방법은 다음과 같습니다 로다 민 - 복합 알파 bungarotoxin 1 : 1X PBS 400 희석.
주 :이 프로토콜에서, 로다가 사용되지만, 임의의 선택은 형광 염색에 사용될 수있다. - 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배.
- -20 ° C의 냉동고에, 5 분 동안 메탄올과 함께 배양한다.
참고 : 냉동실에 근육을 배치하기 전에 메탄올을 추가하고 즉시 잠복기 다음과 같은 솔루션을 제거하지 마십시오. - 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배.
- 1 시간 동안 0.2 % TBP의 블록 (0.2 % 트리톤은 2 % BSA / PBS에 만든).
- 락 동안 4 ° C에서 하룻밤 일차 항체 용액 (0.2 %에서 TBP)와 함께 품어. 항체의 희석 다음과 같이 SV2 (1시 10분) 및 SMI-312 (1 : 1,000).
- 0.2 % TBP 10 분 동안 배를 씻으십시오.
- FGM1 (FITC 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG 100 희석 한 이차 항체를 이용하여 부화1; 1 시간 동안 락을하는 동안 0.2 % TBP)에서했다.
참고 : 염색을위한 프로토콜의 나머지 부분에 대한 빛으로부터 보호합니다. - 1X PBS로 10 분간 세척 배.
- 다시 깨끗한 이전 설치 및 coverslipping에 근육의 우수한 (위 참조) 표면에 결합 조직을 둘러싼.
주 : 청소 후 염색 후 즉시 샘플을 장착하는 것이 좋습니다. 그러나 필요한 샘플을 1X PBS에 적용 할 수있는 경우, 증발을 방지하기 위해 파라 필름에 싸여 매일 PBS의 변화와 함께, 1 주까지 4 ℃에서 저장. - 유리 슬라이드, 비 hardset Vectashield와 커버 슬립에 장착시. 건조를 방지하기 위해 투명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 장기적으로 -20 ° C에서 판지 슬라이드 폴더의 평면 거짓말을 저장 슬라이드.
- 분석 및 공 촛점 이미징 :
- 정량적 물들의 형태를 분석하여 직립 표면 형광을 사용 20X 및 40X 배율 하에서 헤미 다이어프램을 장착현미경.
주 : 다이어프램 염색 전체 마운트 방식으로 해석되기 때문에, 근육이 상당히 두껍다. 정지 화상이 비 - 공 초점 형광 현미경을 이용하여 촬영 한 경우 결과적으로, 형광 염색 대부분 완전히 초점이 맞지 않는다. 이 때문에, 이렇게하면 항상 제대로 개별 NMJs의 각각의 형태를 식별하기 위해 "업"및 "다운"근육 통해 집중할 수로서 현미경 실시간 NMJ 분석을 수행하는 것이 최상이다. 그들은 시냅스 후 수용체 클러스터 공간적 관계 조직을 통해 이동할 때이 방법을 사용하면, 하나는 쉽게 개별 모터 축삭 궤적을 따를 수있다. - 근육의 복부 대 지느러미 길이를 측정하여, 특정 척수 수준 (도 4H)로부터 지형 신경 분포 패턴에 따라 분석을위한 별도의 3 개의 섹션으로 분할 근육.
- 근육과 MOV의 복부 지역에서 시작등쪽으로 보내고, 표면 근육 섬유에있는 얼굴 NMJs 욕실을 모두 분석 할 수 있습니다. RBTX 인해 라벨을 사용 큰 항체에 비해 독소의 작은 크기로 근육 내로 훨씬 더 깊이 침투 (인해 열악한 항체 침투 해석이 어려울 수 있으므로 깊은 표면으로부터 제 3-4 섬유보다 근육 섬유를 분석하지 않는다 뉴런).
- 신경 세포의 사전 터미널 축삭 직경 두께와 신경 터미널의 모든 지역이 완전히 기본 근육의 아세틸 콜린 수용체 (AChRs)과 겹치는 경우 그대로 각 NMJ을 확인합니다.
- 기본 근육 AChRs의 영역은 신경 단자 대응 비어있는 경우 부분적으로 denervated 각 NMJ을 확인합니다.
- 완벽 denervated 각 NMJ를 확인하면 근육 AChRs이 해당하는 신경 말단 없습니다 (하나 신경 단말기의 부족으로 인해 간단하지 않습니다 확신 할 수 있도록이 초점이 같은 분야에 표시된 신경 세포와 다른 NMJs을하는 것도 중요하다 똥R 근육의 지역에서 항체 침투).
- 하나 이상의 사전 터미널 축삭에 분포하는 개인 NMJ (이이 교차로에서 탈 신경과 reinnervation의 가능성이 시도 어느 정도가되었음을 나타냅니다)가있는 경우 각각의 NMJ이 같은 곱셈의 지배를 확인합니다.
- 씬 NMJ 신경 단자와 기본 AChRs 사이의 완전한 중복을 가지고 있지만 얇은 사전 터미널 축삭이있는 경우 신경 지배를 각 NMJ (이 또한 reinnervation에서 탈 신경과 시도의 어떤 수준을 나타낸다) 확인합니다.
- 각 동물에 대한 위의 NMJ 모든 범주에 대한 3 확인 된 지역의 각각에 대해 분석을 실시한다. 같은 실험 그룹에서 다른 동물의 결과와 각 동물의 데이터를 평균. 마우스 헤미 다이어프램에 쥐 헤미 다이어프램 근육과 150 ~ 200에서 약 200 ~ 300 접합 실험 그룹 당 최소 3 (바람직하게는 5 ~ 6 이상) 동물에서 정량화되어야한다.
- 고해상도 공 촛점 이미지를 확보, 사용공 초점 현미경으로 게시 D,.
- 20 ~ 40 μm의 깊이 0.3 μm의 스텝 크기에서 Z - 스택을 확보, 전체 시냅스 프로파일이 포함되어 있는지 확인하기 위해 위의 각 접합 아래 추가 광학 섹션을 수집합니다.
- 최대 강도 예측에 Z 시리즈 이미지를 재구성하기 위해 수집 소프트웨어를 사용합니다.
- 정량적 물들의 형태를 분석하여 직립 표면 형광을 사용 20X 및 40X 배율 하에서 헤미 다이어프램을 장착현미경.
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Representative Results
성인 흰쥐는 C4 척수 수준에서 10 ~ 12 중 하나 후궁 절제술 만 (손상되지 않은 제어) 또는 일방적 인 헤미 타박상 SCI를 받았다. 오주 수술 후에서, 피크 CMAP 진폭은 기록 된 헤미 - 다이어프램 크게 후궁 절제술 전용 제어 (그림 2B)에 비해 SCI 쥐 (그림 2C)에서 감소 후궁 절제술 / 상해 사이트로 동측. 헤미 다이어프램 모든 NMJs 제어 비 환부 야생형 래트 (도 4a, C)에서 완전히 그대로였다. 반대로, SOD1 G93A 래트 (ALS의 설치류 모델) 완전한 탈 신경 (도 4G, 화살촉), 부분 탈 신경 포함 헤미 다이어프램 NMJs (도 4b)에서 현저한 병리학을 보였다 (도 4E, 화살촉도 4G에 NMJ 오른쪽), 여러 신경 분포 (그림 4D)와 얇은 사전 터미널 축삭 (그림 4 층, 화살촉).
그림 1 : CMAP 전극 배치. 접지 전극은 꼬리 피하 배치된다. 기준 전극은 복부에 배치된다. 표면 기록 전극은 횡 방향으로 일방적 늑골 가장자리를 따라 배치됩니다. 자극 전극은 모두 붉은 색과 검은 색으로 그려져있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CMAP 기록 및 분석 (A) CMAP 응답의 진폭 피크 기준선으로부터 측정 될 수있다. 전형적인 CMAP 응답은 자극 이슈를 모두 표시해야합니다응답 곡선. (B - C) 대표 평균 CMAP 응답. 자극 반응의 반복 평균을 얻기 위해 적어도 10 회 연속 수행하여야한다. 후궁 절제술 만 손상되지 않은 쥐 (B) 및 일방적 인 C4 헤미 - 타박상 (C)를받은 부상 쥐에 대한 CMAP 응답의 비교 여기에 표시된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 전체 마운트 염색 다이어프램의 준비. 곤충 핀 실 가드에 헤미 다이어프램 확보 주변 조직에 배치되어야한다. 근육 자체에 핀을 두지 마십시오. 이 이미지에서 두 헤미 다이어프램 근육이 표시 및 SEPA를 고정된다rately. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : NMJ 표현형. 공 초점 이미징 (녹색으로 각각 SMI-32와 SV2 항체로 표시)과 축삭 섬유 및 사전 시냅스 터미널 (로다 민 - 복합 α의 bungarotoxin으로 표시 빨간색) 후 시냅스 아세틸 콜린 수용체를 시각화 하였다. 헤미 다이어프램 모든 NMJs 제어 비 환부 야생형 래트 (A, C)에서 완전히 그대로였다. 반대로, SOD1 G93A 쥐 (쥐 ALS 모델) 완전한 탈 신경 (G, 화살촉), 부분 탈 신경 (E, 화살촉 포함 헤미 NMJs 진동판 (B)에서 현저한 병리학 하였다; G (D)과 얇은 사전 터미널 축삭 (F, 화살표). 횡격막 근육의 분할이다 NMJ 형태 분석 (H) (13)에 대한 별도의 세 가지 섹션으로. 스케일 바 :. 25 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호흡 기능은 호흡 특히 다이어프램 신경 분포를 대상으로 치료법을 개발, 외상 SCI 및 루게릭 병에 모두 손상으로 임상 5,6 적합하다. 종합적 호흡 기능을 연구하기 위하여, 조합 된 접근 방법이 사용되어야한다. CMAPs 외부 횡격막 신경 자극의 방법에 의해 진동판의 기능적 신경 분포의 정도를 측정 할 수 있지만, 내인성 bulbospinal 호흡기 드라이브 8. 또한,이 녹음은, 특히 각각의 모터 축삭과 시냅스 후 아세틸 콜린 수용체의 수준에서, NMJ 형태 학적 변화에서의 검사를 허용하지 않는다. 기재된 염색 프로토콜을 사용하여, 하나는 정량적 이러한 다이어프램 (9)의 개별적인 근육 NMJs에서 완전한 탈 신경 부분 탈 신경 심지어 회생 돋 reinnervation 관련성 학적 표현형을 평가할 수있다.
그럼에도 불구하고, 이러한 두 가지 프로토COLS는 여전히 완벽하게 호흡 병리의 모든 측면을 캡처하지 않습니다. 부상 PhMN 풀이나 횡격막 신경에 손상없이 내림차순 bulbospinal 축색 돌기에 발생하는 경우 예를 들어, CMAP의 진폭은 여전히 횡격막 신경이 외부 (14)을 자극하기 때문에이 회로에 상당한 손상이있는 경우에도 정상 나타날 수 있습니다. 중요한 것은, CMAPs는 내생 척 주상 호흡 드라이브의 측정을 허용하지 않습니다. 또한, CMAPs 전체 환기의 척도를 제공하지 않습니다. 그것은 수행 할 도움이 될 수 있습니다, 예를 들어, 몸 전체 혈량 측정법은 내생 PhMN 활성화를 테스트하기 위해 전체 호흡의 행동과 자발적 내 근육 근전도 기록과 횡격막 신경 녹음을 검사합니다. 또한, 이러한 혈액 가스 측정 농도와 같은 다른 접근은 호흡 기능 (15)에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 모터 유닛 번호 추정 기재된 다이어프램 CMAP 기록 방식을 채용하는 것이 가능할 수있다(16)는,하지만 우리는 이것을 시도 적이 없다. 이들 두 프로토콜은 단지 하나의 호흡기 근육, 다이어프램에 대해 기재되었다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 이러한 연구 될 수 있으며, 그와 같은 SCI ALS 같은 질환에 의해 영향을받는 늑간 다른 흡기 및 호기 호흡 근육이있다.
이 프로토콜에서 우리는 쥐 모델에서 특히 다이어프램 CMAP와 NMJ 분석을 설명합니다. 쥐 사이의 유사점은 간단 쥐에 이러한 기술을 모두 전송합니다. 우리는 이전에 자궁 타박상 다음 PhMNs의 부분적인 손실이 SCI는 형태 NMJ의 탈 신경과 상관 다이어프램 CMAP 진폭 정량 감소 될 않는 것으로 나타났다. 또한, 우리는 모두 마우스 (17)와 쥐의 10 ~ 12 SCI 모델이 적자를 증명하고있다. 또한, 우리는 모두 마우스 18 정량화 다이어프램 CMAP 감소를 보여 주었다과 (ALS의 13, 19, 21, 23 모델을 쥐
조직 학적 및 NMJ에서 호흡과 신경 분포를 조사하기 위해이 프로토콜에 설명 된 기능 기술을 결합하여 더 나은 통찰력 따라서 환자에서 궁극적으로 더 큰 동물 모델에서 치료를 대상으로하는 방법에 대한 인식 및 제공, 다이아 프램 기능 장애와 관련된 신경계 질환으로 얻을 수있다 .
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
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- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
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- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
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