Abstract
傷害に応答して肝臓の炎症は、単球、好中球、T細胞サブセット、B細胞、ナチュラルキラー（NK）およびNKT細胞を含む白血球の異なるサブタイプの浸潤を伴う非常に動的なプロセスである。免疫細胞の遊走を監視するための肝臓の生体内顕微鏡起因試料調製及び固定、光学分割および長期動物の生存に関して高い要件に特に困難である。しかし、炎症過程の動力学ならびに細胞の相互作用の研究は、より良好な炎症性肝疾患の開始、進行および退行を理解するために重要な情報を提供することができる。したがって、高感度で信頼性の高い方法は、集中治療と組み合わせて生体二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）で長時間（約6時間）マウスの肝臓に移行し、異なる免疫細胞の細胞間相互作用を研究するために設立された監視。
ENT ">提供される方法は、穏やかな調製および器官の最小の摂動と肝臓の安定した固定を含み、長期生体内イメージング最大6時間の期間にわたって事実上退色や光毒性効果を多色多光子顕微鏡を用いて、トラッキングを可能にする特定の白血球サブセットの、及び安定した撮影条件によるマウスの重要なパラメータと循環、温度およびガス交換の安定化の大規模な監視する。肝臓の炎症の際のリンパ球の遊走を調べるためには、ノックインマウスCXCR6.gfpベースライン条件下および四塩化炭素（CCl 4）の腹腔内注射（複数可）によって誘発される急性および慢性肝障害の後に生体内肝臓イメージングに供した。
、ナチュラルキラー（NK） - - このようなCD4 T細胞などのTリンパ球のサブセットでなく、粘膜associ CXCR6、主にナチュラルキラーT（NKT）上で、リンパ球上に発現されるケモカイン受容体であるatedの不変（MAIT）T細胞1。 CXCR6.gfp +免疫細胞の回遊パターンと位置決め後の肝臓損傷の際、変更された行動を詳細に洞察力、したがって、疾患の進行におけるそれらの潜在的な関与を許可。
Introduction
細胞や器官全体での細胞機能、さらには生物全体の可視化は、本体2の事実上すべての部分を含め、50年以上のために大きな関心となっている。そのため、いくつかの初期の研究では、すでに肝臓3,4の生体内イメージングを採用。しかし、いくつかの制限が肝組織の長期安定した高解像度画像に関する最新に存在する。
によるダイアフラムおよび胃腸管5との密着肝臓の解剖学的位置に、微細な生体イメージングのための最も一般的な問題は、呼吸による動きと、より少ない程度に、腸管の蠕動6である。他の固形臓器と比較して、肝臓手術は特に困難である。による緻密な微小血管構造のために、外科的処置は、大規模な出血性病変を引き起こす障害微小7、また居住者のiの活性化できそのようなクッパー細胞8としてmmune細胞。したがって、組織の機械的固定は6,9は生体顕微鏡イメージングに干渉する可能性がある他の場所で公開されている。
健康な肝臓では、全血液量の10〜15％は、肝血管系内に存在し、臓器循環の変化（ 例えば 、血圧変動の影響を非常に受けやすい臓器をレンダリングする、全体的な心拍出量10の約25％を受け取る）。したがって、過度の組織処理または集中循環により、例えば 、せん断応力、変位、損傷に対する肝臓の血流の途絶は、同様に肝臓の免疫応答に影響を与え、白血球遊走行動における人為的な変更、障害、肝酸素したがってさらに肝臓の損傷につながる臓器保存および動物の全体的な生活時間など。
初期の微視的研究は、生体内エピ蛍光MIに基づいていたcroscopy、そのような光退色および低い浸透深さのようないくつかの技術的な制約は、長期の肝臓イメージング4,11,12のためのこの技術の使用を制限する。この新しい方法は、現実の状況13-15の下に、ほぼすべての臓器においてイメージング研究を実行することが技術的に可能であったように、1990年代の多光子顕微鏡の発展に伴い、フォト漂白または侵入深さの制限は主に、解決された。しかし、肝臓イメージングに対する主残された課題であった：いくつかの時間の16のより長い期間の呼吸運動、肝臓組織の自己蛍光、肝類洞に不変の血流を確保し、特に安定したイメージング。
いくつかの研究は、肝臓17における様々な白血球の機能および移動に対処し、 例えば 、NKT細胞18-20、T細胞21,22、肝臓マクロファージ23,24または好中球25、長期多メートルもののicroscopyイメージングはまだ成功し、さらに難しい既存の損傷に起因する急性または慢性の肝疾患を有する動物におけるタスク及び更なる損傷26に、したがってより高い感受性を確立されていなかった。しかし、リアルタイムで回遊行動と肝臓の白血球の細胞機能を監視することは、肝臓の恒常性と疾患27において、その特定の役割で小説洞察を可能にする。
ケモカイン受容体CXCR6は、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、およびいくつかのT細胞集団18,28を含むいくつかのリンパ球サブセット上で発現される。マウスでの以前の研究は、CXCR6とその同族リガンドCXCL16が恒常性の間に肝正弦波にNKT細胞のパトロールを制御することができることが示されている。したがって、（CXCR6座に緑色蛍光タンパク質[gfpを]のノックインを運ぶ）CXCR6.gfpマウスの使用は、脳29のような種々の器官でのリンパ球の遊走を調べるために記載されているまた、肝臓18,20は 、炎症時にCXCR6.gfp細胞の浸潤を増加を示す。
この研究で提供される方法では、安定化条件下で長期間にわたりこれらのプロセスに従うことが可能であった。生体多光子ベースの手順は、動物や器官の最小限の摂動と高度に再現性があったイメージングを可能にした。呼吸と循環の開閉制御に続く大規模な監視により、長期的な動物の生存のために最適化。と非常に柔軟で、腎臓や脾臓などの他の実質臓器にも採用しやすい。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：実験は、動物の保護に関する（NIH出版、第8版、2011年）「実験動物の管理と使用に関する指針」及び指令63分の2010 / EU以下の動物実験を支配するドイツの法律に従って行った科学的な目的（欧州連合官報、2010）に使用される。公式許可は政府の動物の管理と使用オフィス（LANUVノルトラインヴェストファーレン、レックリングハウゼン、ドイツ）から付与されました。
注：短期画像化のために省略することができる手順の準備時間を削減し、外科的プロトコルを簡略化するアスタリスク（*）が付いています（ 例もショット、3-Dスタックまたは短期間のタイムラプス顕微鏡をスナップ）。必要に応じて、しかし、生存期間が顕著に減少する場合の撮像には、広範囲の監視および制御を循環することなく行うことができる。
1.顕微鏡のセットアップと手術前の準備（5-10マイルN）
- （顕微鏡、パワーラボ、レーザー、加熱パッド、気象室、Webカム、シリンジポンプ装置、人工呼吸器）上のスイッチシステム。
- イソフルラン蒸気と設定イソフルランレベルへのO 2供給が1.5体積％に接続します（V / V）、小動物人工呼吸器に接続します。
- 短期間のイメージングのために、唯一の初期腹腔内麻酔誘導後、イソフルランを用いて麻酔を維持し（ステップ2.2参照）。次いで、安定な肝臓微小循環を保証するために2巻の％（v / v）のイソフルランを使用して、2時間未満に撮像時間を維持する。
- 150〜200μLの容量で120〜140呼吸サイクル/分に呼吸を設定します。
- マウスのアガロース段階を設定します。 40°の角度でディッシュ（約10cm×15センチベース）に注ぐこと、3％（w / v）アガロース100mlのを準備する。
- 必要な機器を収集外科作業領域を設定します。微生物感染を防ぐために、w / vのSekuseptフォルテSの1％溶液（9.9％を使用して器具を消毒する5分です。v、ホルムアルデヒド/ w）の、グルタラール9.8％実験（ 図1A）の前に。
- 残りの成分を得る：皮膚消毒剤（ 例えば 、10％ポビドンヨード溶液）、肝臓ステージ（スタック·ブリッジ）、アガロース溶液（3％（w / v）のPBS中の）5％、シリンジポンプ（w / v）のグルコース溶液を麻酔液I（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を、綿棒、n-ブチル-2- Cyanoacrylat、及び1×PBSで（G-5）、シリンジポンプ。予熱のインキュベーション室にアガロース段階ディッシュを入れてください。
2.気管切開（10〜15分）
- 25〜28グラムの重さ、家の繁殖でからC57BL / 6マウスを使用してください。 12時間明/ 12時間暗サイクルで、温度と湿度が管理された環境でのハウスFELASAガイドラインに従って特定病原体フリーの条件下ではマウス、。動物に標準マウス食餌（スニフ標準的なげっ歯類食）と水を自由に無料でアクセスを許可します。
- initによってマウスを麻酔IAL腹腔内麻酔液II（ケタミン0.1 mg / mlの、キシラジン1 mg / mlの、ブプレノルフィン10μg/ ml）を250μlの内（ip）注射。
- *生体内撮像中維持費のために、継続的に連続的な腹腔内注射により麻酔液Iを投与し（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を0.2ミリリットル/時間の流量でシリンジポンプ装置を使用して吸入イソフルラン0.5巻の％との組合せ（v / v）である。
- 5分後の反射神経をチェックします（ 例えば鉗子でフットパッドピンチ）、気管切開のために皮膚を消毒、マウスは外科トレラント麻酔状態にある場合の準備を開始。
- （ 図1B）を乾燥から角膜を防ぐために、目の保護クリーム（ 例えば 、デクスパンテノールは50mg / g）を適用します。
- 四肢のために粘着テープを使用して腹側を露出する準備テーブルの上にマウスを固定。穏やかに、この位置に固定する、例えば 、首を引き伸ばし、ゴムバンドを使用して、tはフック切歯O。
- 綿棒で消毒剤を適用することにより、ポビドンヨード溶液を用いて、皮膚や毛を消毒する。
- 直接顎の下に、最初の皮膚カット（0.5〜長さ1cm）を実行する（ 図1C）
- 慎重に唾液腺（ 図1D）との間に結合組織を解剖。
- 慎重に開いている筋肉の管周囲の気管（ 図1E、F）を引き裂く。
- 後で換気チューブの固定（ 図1G）のための気管の下に外科スレッドを置きます。
- T字型の切開を行う軟骨リング間のマイクロハサミでオープン気管（ 図1H）
- 切開（〜0.5センチメートル）を介して気管内に換気チューブを置きます。 、前方のチューブをプッシュ小さな解剖鉗子で尾方端をつかみ、ゆっくりと気管にチューブを前進させるために（ 図1I）
- 外科糸でチューブを固定（ 例： 図1J、K）を避けるために、皮膚の管の第2頭蓋固定を行う。
- シールは、組織接着剤（ 例えば 、n-ブチル-2- Cyanoacrylat）（ 図1L）で切断した。
- 粘着テープを使用して先頭にチューブを固定する。
3.開腹（15〜20分）
- 低体温症を防ぐために加熱パッド上にマウスを置きます。腹部を剃る、慎重に皮膚から毛を取り除く。ポビドンヨード溶液を用いて剃毛した皮膚や毛を消毒。
- 外科用ハサミ（ 図2A）を使用して、胸骨の下にある小さな皮膚カットを行います。出血を防ぐために、すべての可視血管を焼灼、両側に横方向に肋骨の下にカットを拡張します。
- 慎重に腹膜（ 図2B）を開く、胸骨下の白線の小さなカットを行う。 cauterizを使用して両側にカットを拡張ationが（ 図2C、D）を出血を防ぐために。
- アガロース段階皿（ 図2E）にマウスを置きます。マウス（通常は12〜14カバースリップ）（ 図2F）の両側に適切な高さのスタックを置きます。
- 呼吸に顕微鏡を同期させるために背中の上部の下に呼吸トリガーセンサを配置します。トリガーユニット（ 図2G）をアクティブにします。
- リブ（ 図2I）を後退させる胸骨を通して外科糸（5-0）を配置します。
- 慎重に湾曲した外科用ハサミを使用して、肝臓および横隔膜（鎌状靱帯）、ならびに肝臓および胃腸管を連結する靭帯を切断する。大動脈（ 図2J）まで鎌状靭帯をカット。
4.サンプルのセットアップ（10〜15分）
- 大型肝葉へ簡単にアクセスするための45°の角度で右側にマウスを置きます。
- 腹部をカバーし、肋骨下のステージングブリッジを追加します。空洞。鋭いエッジ（ 図2K）を覆うように粘着テープ被覆を有する標準カバースリップを使用してブリッジを製造する。
- ステージ上で大規模な肝葉を置きます。慎重にダブルボールスタイラスプローブまたは肝臓下のパッド入りのへらをスリップし、湿った綿棒やウェットティッシュを使用して臓器の上部を保持する。スライド上に葉を持ち上げて、穏やかなドラッグを適用します。ローブは曲げたり折り畳むことができる。肝臓（ 図2L）の唯一の穏やかな操作に余分なケアを提供する。
- 例えば 、小さなカバースリップ（20ミリメートル×20ミリメートル）、その横に肝葉のほぼ同じ高さの山がカバースリップをサポートするために、横方向のサポートステークスを、置きます。
- 肝葉に大きなカバースリップ（24ミリメートル×50ミリメートル）を配置します。そのカバースリップは、（ 図2M）できるだけ水平に配向されていることを確認してください。
注：カバースリップは、それを圧迫することなく、組織と接触しているべきである。血流障害（白組織）の目に見える兆候を確認してください。 microcirc場合、ulationが破壊され、さらに支援する株式を追加します。 - *長期の麻酔およびG-5アプリケーションのために二つの独立した腹腔内カテーテル（ 図2N）を配置します。次の後肢に下腹部に横方向にカテーテルをインストールします。
注：腹腔カテーテルは柔 軟なシリコーンチューブ（ 図3）27 G針を接続して自作することができる。 - *皮膚に5-0外科用糸のループを有する固定する針が偶発的変位を回避する。
- * I 1カテーテルする麻酔溶液とシリンジポンプを取り付け、0.2ミリリットル/時間に設定された流量、カテーテル2にG-5とシリンジポンプを取り付け、0.1ミリリットル/時に流量設定。
5.マウスの監視
- *場所のECGフロントに電極および後肢四肢（ 図4A）。
- * 2レベルセンサをCOに有効期限のチューブを取り付けます。
- （ 図4Cの熱パッドに接続された外部温度センサを追加する）。
6.埋め込み、組織固定（5〜10分）
- 1X PBSにアガロース（w / v）の3％の100ミリリットルを準備します。温度を5 mlシリンジと18 G針（ 図5A）を用いて41°Cである場合に肝臓を埋め込 む。
- （ 図5B、C）カバースリップ上で、マウスの周りに残っているアガロースを注ぐ。アガロースが完全に糊化するまでお待ちください。
- 準備肝葉（ 図5D、E）をスキャンするために十分なviewfield大型の準備、ハイデマンのへらを使用して余分なアガロースを削除します。
7.イメージング
- 顕微鏡気候室にマウスを転送します。
- 1×PBS（37℃に予熱した）の50〜100ミリリットルを追加します。
- 蒸発（ 図5F）を防止するために試料皿をカバーしています。
- * 0.5体積％（V / V）に吸入イソフルランを減らします。
- *、ソフトウェアを監視するECG、心拍数及び呼気CO 2の記録を開始。
- イメージングを起動します。オープンラのSerシャッター、Z-スタックの上限と下限を定義し、関心のビューのフィールドを識別し、時間経過の記録を開始。必要に応じて、Z-ドリフト（ 例えば 、血液の圧力または温度変動の変化に、 図（5G）を補正するために、Zスタックを再調整する。
注：撮像期間終了後、または動物の循環や麻酔が不安定になった場合、（麻酔からの覚醒せず）頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
私たちの生体内TPLSMアプローチを検証するために、我々は生体内TPLSMイメージングにCXCR6のGFP / +マウスを受ける。マウスは、いずれかのベースライン対照として未処理のまま、または急性肝障害20を誘導するために四塩化炭素（CCl 4）の単回腹腔内注射を行った。
ビデオシーケンスは、2-5時間の期間にわたり採取し、細胞は、それらの緑色蛍光を経時的に追跡した。一般的な細胞運動性を表示するには、手順の間に検出されたすべてのトラックは、重畳画像（ 図6A）としてプロットした。ベースライン条件下で細胞が中心静脈に向かって肝臓類洞に沿って長距離の移動を示したが、18時間のCCl 4処置後CXCR6 + / gfpの細胞は、既に部分的に損なわれた運動パターンを示した。いくつかの高速移動の細胞はまだ、肝臓類洞に存在したが、いくつかの焦点領域が、その細胞で見ることができた傷害の領域に細胞を募集し走化性応答を示す、ローカルスキャンにランダム移行から変わっていた。効果はほとんどないアクティブな移行にCXCR6 +細胞のほぼ完全な逮捕を示す、36時間後にもより顕著であった。ベースライン条件の下で、ほとんど移動する細胞がランダム方向転換を持つ変数の移行速度を有していたが、 四塩化炭素処理された動物は、ゆっくりとしかクローリングだけでなく、いくつかの自由に運動性の細胞は18時間後ではなく、36時間後の正弦波をパトロールした細胞を示した。色分けされたマイグレーション·トラックを使用して、細胞速度のCCl 4処理の効果を評価するために、直接可視化することができた。減損移行は36時間後には運動性の細胞は、任意の検出されなかったしながら、18 CCl 4を後に時間の長距離トラックの量だけでなく、平均トラック長が著しく、減少したことを示し、正規化されたトラック図 （ 図6B）にも見えたもっと。ラインWにこれらの知見i番目、自由に血管系をパトロールする細胞の能力を記述するセルラー変位は、36時間、肝細胞の損傷（ 図6C）のサイトでの四塩化炭素処理した後の細胞の捕捉を示す、時間の経過とともに減少した。
より詳細に肝臓でCXCR6 + / gfpの細胞の遊走挙動に追従するように、代表的な個々の細胞の移動速度は、時間の経過とともに運動性のレベルを視覚化するためにプロットした。我々と他の人は、以前CXCR6 + / GFP細胞のいくつかの別個の動作パターンを説明します。Activeランダムは、細胞の運動性と時間的な静止状態の位相を示す、こだわりのローリングパターンでクロール。アクティブクロールする能力がまだ関心領域が、をスキャンする細胞と細胞の動員を指示。免疫細胞活性化18,20を伴って、全細胞逮捕。処理なしのマウスは、主だった細胞を示した一方で、自由にモティルと速度は15μm/秒まで、CCl 4で処置したマウスにおいてCXCR6 + / gfpの細胞は顕著に36時間（ 図7A）の後に、細胞移動速度および部分逮捕すでに後の18時間、完全遊走阻止を低減て表示。単一細胞解析と一致して、配列内のすべてのセルの統計データは、平均トラック速度により似たのCCl 4処理（ 図7B）、（図7C）の後、全体的な移動速度を低下さ明らかに、最大の移行速度を追跡する（ 図図7D）、アプローチは、肝疾患を発症における細胞移動及び位置決めの違いを説明するのに適していたことを示す。
図1：製造のために使用されるマウスの気管切開（A）手術用機器。 1X標準パタパタnの鉗子、1X Semken鉗子、1Xデュモン第7鉗子、グレーフェ鉗子（湾曲したストレート/ 1X鋸歯、2回）、2倍ブレアトラクター（4本柱（平滑））、ダブルボールスタイラスプローブ（ 例えば 、アマルガムバーニッシャー3PL）、ハイデマンへらHD2、針ホルダ（マチューまたはハルシー）、1X小さな外科用ハサミ（シャープ/鈍い、1xcurved、1Xストレート）、マイクロはさみ（ 例えば 、Vannas春はさみ）、1X小動物cauter、綿棒、目の保護軟膏、外科スレッド、n-ブチル-2- Cyanoacrylatglue。 （B）の目は、目の保護軟膏を使用して保護されています。 （C）気管の準備のための初期スキンカット。 （D）顎下唾液腺の間の結合組織の解剖。気管の（E）博覧会。 気管の周囲の筋肉組織の（F）解剖。チューブを固定するための気管の下に外科用糸の（G）の配置。 （H）Trache上側の軟骨環の間microscissorsを使用してら切開。 （I）気管内換気チューブの挿入。皮膚にチューブを固定するための頭蓋外科スレッドの（J）の配置。 （K）、チューブのダブル固定。 （I）のnブチル-2- Cyanoacrylatを使用して外科的切開をシーリング。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：開腹および肝臓調製物（A）初期皮膚切開、血管は、過度の出血を防止するために、焼灼した。胸骨の下に腹膜の（B）オープニング。 （C）焼灼器を使用して腹膜カットの延長。 （D）上腹部血管のシール。 （
図3「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg" />
図3：柔軟なシリコンチューブで接続腹腔カテーテル 27 G針。
図4：マウスのモニタリング。 ECG電極（A）の配置（赤、緑、青のケーブル）。示すように、ECG検出用の針が皮下に配置されます。 （B）ECGのモニタリング（赤）、呼気CO 2（青）および長期進行（左）と実測値（右）を示す心拍数（赤）。熱パッド制御のために（C）温度制御された電源装置。温度は36℃に設定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：肝臓の埋め込 みとイメージング。 肝葉の（A）の埋め込 み。 PBS中の3％アガロースを18G針で2 mlシリンジを用いてカバースリップの下に41℃で注入される。 （B）肝葉が完全に運動アーチファクトを最小化するためにアガロース中に埋め込 まれている。脱水を防ぐためにアガロース残りと腹膜の（C）シール。完全糊化後のビューのアガロース被覆顕微鏡視野の（D）の除去。 viewfieldの（E）の調製。 Zレベルおよび光学顕微鏡を用いた試料の血流の評価のF調整。 （D）は、過度の蒸発を防ぐために皿をカバー。カバーは、セットアップを表示するために絵に解除されている。 拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。
図6： 四塩化炭素注入後の慢性肝障害におけるCXCR6のGFP / +細胞の追跡マウスは、ヒマワリ油18時間またはイメージングの前に36時間に溶解0.6ミリリットル/ kgのCCl 4で腹腔内注射した。説明したように実験の日に、マウスを生体内TPLSMに供した。 （A）細胞追跡の静止画。全ての時点からのトラックは、細胞運動性および変位を示すために重ね合わせた。画像は840 nmでのシングルビームタイタンサファイアレーザーとTPLSM顕微鏡を用いて撮影した。領域は、走査サイクル当たり約30秒のサンプリングレートで70μmでの侵入深さで3-5のZスタックを取ってスキャンした。 （;紫動きの遅いまたは無茎細胞：運動性細胞水色）トラックは、移動速度を表示するために色分けされた。スケールバー：100μ; M。 （B）のトラック方向及びトラック長（μm）を示し、その起源のために正規化されたパスのXY-図。その起源からの細胞の（C）の合計変位。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：ベースラインでの肝組織とのCCl 4処置マウスにおける生体内TPLSM続いCXCR6ののgfp / +細胞の移動の統計細胞は、肝臓をパトロール、その移動速度を分析した。 （A）単一細胞の代表的な速度は、経時的に追跡。速度は、各時点で測定され、個別にフレームごとにプロットした。行は、個々のセルを表す。 Y軸は、最大移動速度に応じてスケーリングされる。 （B）サンすべてのセルからのA.フレーム特定の速度のatistical分析は、グループ化され、ベースラインで分析し、 四塩化炭素は、マウスを処理した。 （C）平均トラックスピードはすべてのトラックからトラックやデータごとに算出した、分析のためにグループ分けした。各トラックの（D）最大速度をプロットし、分析した。全ての実験は、3匹の動物のグループで行い、結果は2つの独立した実験で確認された。 *** P <0.001（両側不対スチューデントt検定）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々の研究の目的は、肝臓の生体TPLSMイメージングのための高度に標準化された安定した再現性のある方法を開発することであった。一般的に、生体内イメージングは、開発、恒常性および疾患における異なる白血球集団のホーミングとの相互作用を、以下の実際の生活条件の下で細胞挙動に貴重な洞察を与えている。しかし、呼吸器および腸の蠕動運動を直接他の固形臓器と比較して、肝臓、ならびにそれらの高い脆弱性に送信される起因れる肝臓のやや困難な解剖学的位置は、安定した長期生体内イメージングのためのいくつかの課題を課した。ここ数年、マウスでの多くの実験研究が常駐から主要な貢献や浸潤単球/マクロファージ30-32、好中球33または様々なリンパ球サブセット34,35と、負傷した肝臓28中の免疫細胞浸潤の非常に動的な性質を明らかにした。しかし、Mこれらのデータのレオナは、エンドポイント分析（ 例えば 、多色、動物を犠牲にした後にフローサイトメトリー）から誘導した。今まで唯一の少数の研究は、多色生体内イメージングを用いて肝臓の炎症の際に携帯トラフィックのダイナミクスを記述する存在する。倒立顕微鏡を使用すると、原因の底ガラス24に対する組織の強固な接着に肝臓の固定と保湿の必要性を回避する。多くの多光子顕微鏡は、直立の撮像システムとして構築されているので、より精巧な準備および固定方法は、撮影時のために組織を安定化するために必要とされる。一般に、カスタムメイドの病期分類システムは、組織固定6、36,37に関して記載されている組織上にあっても最小限の圧力が罹患肝臓38上に、さらに深刻な影響を有する正弦波の血流に影響を与えるため、ただしこれらには、肝臓微小循環を検証することが重要である。
そのため、以下の点が広告だったin vivoでの TPLSMイメージングによって得られた結果を最適化するために、この方法のセットアップに身を包んだ：原因の問題を扱うに最小化サンプル摂動と微小循環の破壊によって準備の質の向上をし、動物の生存を増加した。集中治療のモニタリング及び例えば麻酔、呼吸と循環をさらに高める動物の生存の安定化、最小化、生理的人工物、その後の適応は、血液pHの不均衡によって引き起こされる。トリガされた画像との組み合わせで制御された呼吸は、呼吸サイクルの顕微鏡の同期のために運動アーチファクトを除去することが不可欠であった。生理的塩濃度を含有するアガロース器官の埋め込みは優しく、さらに機械的操作なしで調製した後、臓器を固定するのに有益であり、また、試料の脱水を防止する。肝臓顕微鏡観察のために使用されるほとんどのプロトコルは、STAのための唯一の不十分な方法を提供 BLE、長期の麻酔。しかし、動物の生存を有意にここで提供される麻酔プロトコルで、モニタリングと組み合わせて強化することができる8時間までの生存を保証するのに十分であった。代替的な方法は、一般に、好中球浸潤39として最大3時間の期間内のプロセスを可視化するのに適しているが、そのような単球またはリンパ球浸潤22、あるいは細胞増殖6などの画像長持ちプロセスの可能性を欠いている。急性および慢性の肝臓炎症の間に補充、浸潤および細胞相互作用の動態を理解することは、肝疾患の発症および進行に、より詳細な洞察を提供することができる。免疫病理のこの強化された理解を使用することにより、目的の標的細胞に対処するのではなく、 例えば 、非選択的な免疫抑制のアプローチを使用する点ではるかに洗練された治療法を設計することが可能となる。
白血球の位置決め、遊出および相互作用に対処するには> "ove_content、高品質の画像は、肝血管系および肝臓組織18,20,40内の細胞の正確な4Dの追跡のために必要とされる。ここで提供する方法は、サンプルの最小限の摂動との効率的な取り扱いが容易で、コストの両方の製造、一般的な実験試薬および装置を用いて適用することができる。できるだけ長くのためにマウスの生理学的条件を維持するためには、酸素化及び血液のCO 2レベルを制御するために呼吸量と周波数を微調整する必要がある。原因腹膜への液体の持続注入にいますが、少なくともだけ循環の安定化に関する部分的な制御を可能にする循環、ECGおよび心拍数の測定値を安定させるために暫定的な供給がある。直接的な血圧コントロールと中心静脈液アプリケーションを実装することにより、可能性があるという重要なPARAMETERSは、安定性と生存率のさらなる向上につながる、より一層安定させることができる。
さえ非常に制御された条件下で、一般的に、アセトアミノフェン誘発性肝損傷としてマウスで使用される肝障害モデルに供された動物の画像化は、 四塩化炭素誘発肝損傷または食事誘発性脂肪肝疾患は、依然として困難である。原因したがって重く長いTPLSMビデオ·シーケンスを得るための可能性を制限する代謝状態制御における肝循環におけるその中心位置の本質的な機能、肝機能、または微小循環の変化が直接影響を与える動物の長期生存に重度の出血または破壊微小血管系で例えば損傷した臓器、。また、広範な壊死を搭載したモデルのように深刻な変更された肝microanatomyで、それは、細胞間の相互作用-および炎症細胞集合体のローカル区画化を研究するために困難なまま無スタン理由（このような従来の顕微鏡または免疫蛍光におけるDAPI染色におけるヘマトキシリン染色など）解剖学的構造のためdardized「対比染色」は、さらに、撮像処理によって得られたデータの生体TPLSM.The品質のために利用可能な細胞の標識強度に依存し微視的セットアップ。
いくつかのアプローチが、肝臓におけるGFP +細胞を可視化するために存在する。非常に低いバックグラウンド蛍光との最高の蛍光を900および920nmの励起波長との間で得られる。肝臓バックグラウンド蛍光のほぼ完全な損失は、デキストランまたはレクチンなどの追加の血管のトラッカーを使用しない場合、肝臓内の細胞の位置を調査することはできません。したがって、我々は、GFPシグナルおよび詳細ではなく、明るすぎる肝臓バックグラウンド蛍光との間の最良の比を与え、840nmの波長での像に移行する白血球を決定した。
まとめると、INTR本研究で導入AVITAL TPLSM撮像システムは、肝臓特異的生体顕微鏡問題の幅広い多様に適用することができる。このアプローチでは、腎臓、肝臓、膀胱、腸または膵臓のような他の固形臓器内TPLSMイメージングしたがって、 細胞の長期遊走プロセスを調査するために非常に柔軟なアプローチを提供し、外科的処置および組織病 期のわずかな変更を加えて実施可能である生体内 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
