Abstract
Leverbetennelse som en respons på skade er en svært dynamisk prosess som involverer infiltrering av distinkte subtyper av leukocytter, inkludert monocytter, neutrofiler, T-celle-undergrupper, B-celler, naturlige killer (NK) og NKT-celler. Intramikroskopi av leveren for overvåking av immuncellemigrasjon er spesielt utfordrende på grunn av de høye krav til prøveopparbeidelse og fiksering, optisk oppløsning og langsiktig dyr overlevelse. Likevel, kan dynamikken i inflammatoriske prosesser samt cellulære interaksjonsstudier gi viktig informasjon for bedre å forstå initiering, progresjon og regresjon av inflammatorisk leversykdom. Derfor, ble en svært følsom og pålitelig metode etablert for å studere migrasjon og celle-celle-interaksjoner av forskjellige immunceller i muselever over lange perioder (ca. 6 timer) ved intravital to-foton laser scanning mikroskop (TPLSM) i kombinasjon med intensiv pleie overvåking.
ent "> Fremgangsmåten omfatter gitt en svak preparat og stabil fiksering av leveren med minimal forstyrrelse av organet; langtidsintravital avbildning ved hjelp av flerfarget multiphoton mikroskopi med praktisk talt ingen fotobleking eller fototoksiske effekter over en tidsperiode på opp til 6 timer, slik at sporings av spesifikke leukocytt-undersett, og stabile avbildningsforhold på grunn av omfattende overvåking av mus viktige parametere og stabilisering av sirkulasjonen, temperatur og gassutveksling.For å undersøke lymfocyttmigrering ved leverinflammasjon CXCR6.gfp knock-in-mus ble utsatt for intravital leveravbildning i henhold til grunnlinjebetingelser og etter akutt og kronisk leverskade indusert ved intraperitoneal injeksjon (e) av karbontetraklorid (CCI4).
CXCR6 er en kjemokinreseptor uttrykt på lymfocytter, hovedsakelig på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - og undergrupper av T-lymfocytter som CD4 T-celler, men også slimhinne associrerte invariant (MAIT) T-celler 1. Etter den vandrende mønster og posisjonering av CXCR6.gfp + immunceller tillatt en detaljert innsikt i deres endrede adferd på leverskade og derfor sitt potensial engasjement i sykdomsprogresjon.
Introduction
Visualisering av celler og cellefunksjoner i hele organer eller hele organismer har vært av stor interesse for mer enn 50 år, inkludert nesten alle deler av kroppen 2. Derfor noen tidlige studier allerede anvendt intravital avbildning av leveren 3,4. Men flere begrensninger eksisterer oppdatert om langsiktig stabil høyoppløselig avbildning av leveren vev.
På grunn av den anatomiske stilling av leveren i nær kontakt med membranen og mage-tarmkanalen 5, er den mest vanlig problem for mikroskopisk intrabilde bevegelse på grunn av respirasjon, og, i mindre grad, peristaltiske av tarmkanalen 6. I forhold til andre faste organer, er leverkirurgi spesielt utfordrende. På grunn av den tette microvascular struktur, kan kirurgisk manipulering føre til massive hemoragisk lesjoner, nedsatt mikrosirkulasjon 7 og også aktivering av bosatt i-immun celler som Kupffer celler 8. Derfor, mekanisk fiksering av vevet som i andre sammenhenger 6,9 er sannsynlig å forstyrre den intramikros bildebehandling.
I en frisk lever, befinner seg 10 til 15% av det totale blodvolum i leveren vaskulaturen, og organ mottar rundt 25% av den totale blodsirkulasjon 10, slik at organet meget følsom for endringer i sirkulasjon (f.eks, blod trykkfluktuasjoner ). Derfor vil forstyrrelser i leverblodstrømmer på grunn av f.eks skjærspenning, fortrengning, skade av overdreven vev håndtering eller sentralisert sirkulasjon føre til kunstige endringer i leukocytter trekkadferden, nedsatt leveroksygenering og derfor ytterligere skade leveren, påvirker leveren immunresponser samt som organbevaring og total levetid av dyret.
Tidlige mikroskopiske studier var basert på intra epifluorescence microscopy, men flere tekniske begrensninger som foto bleking og lav penetrasjon dybde begrense bruken av denne teknikken for langsiktig leveren bildebehandling 4,11,12. Med utviklingen av multiphoton mikros på 1990-tallet, ble begrensningene i fotobleking eller inntrengningsdybde i hovedsak løst, som denne nye metoden var teknisk i stand til å utføre imaging studier i nesten alle organer i henhold til virkelige situasjoner 13-15. Men de viktigste gjenværende utfordringer når det gjelder diagnostikk av lever var: pusten bevegelser, autofluorescence av levervev, sikring uforandret blodgjennomstrømningen i lever sinusoids, og spesielt stabil bildebehandling for lengre perioder av flere hr 16.
Selv om flere studier adressert funksjons og migrering av forskjellige leukocytter i leveren 17, f.eks NKT-celler, T-celler 18 til 20 21,22, 23,24 levermakrofager eller neutrofiler 25, langtids multiphoton microscopy bildebehandling hadde ennå ikke er opprettet, en oppgave enda mer utfordrende i dyr med akutt eller kronisk leversykdom på grunn av den eksisterende skader og derfor høyere mottakelighet for ytterligere skade 26. Men overvåking trekkadferden og cellulær funksjon av leukocytter i leveren i sanntid gjør at ny innsikt i deres spesielle rolle i lever homeostase og sykdom 27.
Kjemokinreseptoren CXCR6 uttrykkes på flere lymfocytt-delmengdene, inkludert naturlige killer (NK) celler, NKT-celler og noen T-celle-populasjoner 18,28. Tidligere studier på mus har indikert at CXCR6 og dens beslektede ligand CXCL16 kan kontrollere patruljering av NKT celler på lever sinusoids under homeostase. Følgelig har bruken av CXCR6.gfp mus (som bærer et knock-in for grønt fluorescerende protein [GFP] i CXCR6 locus) er beskrevet for å undersøke overføringen av lymfocytter i forskjellige organer som hjernen 29og også lever 18,20, som viser økt infiltrasjon av CXCR6.gfp celler på betennelse.
Med fremgangsmåten er gitt i denne studien var det mulig å følge disse prosesser over et langt tidsrom under stabiliserte betingelser. Den intravital multiphoton basert fremgangsmåte tillater avbildning som var meget reproduserbar med minimal forstyrrelse av dyret og det organ; optimalisert for langsiktig dyr overlevelse ved omfattende overvåkning fulgt av tett kontroll av respirasjon og sirkulasjon; og svært fleksibel og enkel å ta i bruk også til andre parenkymatøs organer som nyre eller milt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Forsøkene ble utført i henhold til den tyske lovgivningen om dyrestudier etter den 'Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr' (NIH publikasjon, 8. utgave, 2011) og direktivet 2010/63 / EU om vern av dyr brukt til vitenskapelige formål (Den europeiske unions tidende, 2010). Offisiell tillatelse ble gitt fra statlige dyr omsorg og kontorbruk (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland).
MERK: Trinnene som kan utelates for kortsiktig bildebehandling (f.eks knipse bilder, 3-D stabler eller også kort varighet time-lapse mikroskopi) er merket med stjerne (*) for å redusere forberedelse tid og forenkle kirurgiske protokollen. Imaging kan også utføres uten omfattende overvåking og sirkulasjonskontroll om nødvendig, imidlertid overlevelsestiden vil bli betydelig redusert.
1. Mikroskop Oppsett og Pre-kirurgi Forberedelser (5-10 min)
- Brytersystem på (mikroskop, makt Lab, laser, varmepute, klimakammer, web cam, sprøytepumpe enhet, respirator).
- Koble O 2 forsyning til Isofluran Vapor og satt Isofluran nivå til 1,5 vol% (v / v), koble til et lite dyr respirator.
- For kort sikt imaging, opprettholde anestesi ved bruk av isofluran kun etter den første ip anestesi induksjon (se trinn 2.2). Deretter kan du bruke to Vol% (v / v) Isofluran, og beholde bilde tid under 2 timer for å garantere stabil lever mikrosirkulasjonen.
- Satt åndedrett til 120-140 respirasjonssyklusene / min med et volum på 150-200 mikroliter.
- Sett opp muse agarose scenen. Forbered 100 ml 3% (w / v) agarose, å helle den over i en form (ca. 10 cm x 15 cm base) i en vinkel på 40 °.
- Sett opp kirurgisk arbeidsområdet samle den nødvendige instrumentering. For å hindre mikrobiell infeksjon, desinfisere instrumenter ved hjelp av en 1% oppløsning av Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% vekt / volum, formaldehyd i 5 minutter før eksperimentet (figur 1A).
- Skaffe gjenværende komponenter: hud desinfeksjonsmiddel (f.eks, 10% povidon-jod-løsning), levertrinn (stabler og bro), agarose-oppløsning (3% (w / v) i PBS), sprøytepumpe med 5% (w / v) glukoseoppløsning (G-5), sprøytepumpe med bedøvelse oppløsning I (Ketamin 0,1 mg / ml, 0,5 mg xylazin / ml Fentanyl 5 ug / ml), bomullspinner, n-butyl-2-Cyanoacrylat, og 1 x PBS. Sett agarose scenen rett inn i inkubasjon kammer for forvarming.
2. Tracheotomy (10-15 min)
- Bruk C57BL / 6 mus fra i huset avl som veier 25-28 g. Huset musene i henhold til spesifikke patogenfrie forhold i samsvar med de retningslinjer FELASA, i et temperatur- og fuktighetskontrollert miljø med en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus. Tillate dyr fri tilgang til standard mus diett (Sniff Standard gnager Diet) og vann ad libitum.
- Bedøve musen ved initial intraperitoneal (ip) injeksjon av 250 ul av oppløsning II bedøvelse (ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 1 mg / ml, Buprenorfin 10 ug / ml).
- * For vedlikehold ved intravital avbildning, kontinuerlig administrere bedøvelse løsning I ved kontinuerlig ip injeksjon (Ketamin 0,1 mg / ml, 0,5 mg xylazin / ml Fentanyl 5 ug / ml) ved anvendelse av en sprøytepumpe-enhet med en strømningshastighet på 0,2 ml / time i kombinasjon med inhalativ isofluran 0,5 vol% (v / v).
- Sjekk reflekser etter 5 min (f.eks klype fot pad med tang), desinfisere huden for trakeotomi, starte forberedelse hvis musen er i kirurgisk tolerant anestesi tilstand.
- Påfør øye beskyttende krem (f.eks Dexpanthenol 50 mg / g) for å hindre at hornhinnen tørker ut (figur 1B).
- Fiksere mus på forberedelse bordet utsette ventral side ved hjelp av teip på ekstremiteter; forsiktig forstrekke hals, fiksere i denne posisjonen, f.eks., ved hjelp av en gummistrikk hektet to fortennene.
- Desinfisere hud og pels bruker povidonjodid løsning, ved å bruke desinfeksjonsmiddel med en bomullspinne.
- Utføre innledende hud cut (0,5-1 cm lengde) rett under haken (figur 1C)
- Dissekere nøye bindevev mellom spyttkjertler (Figur 1D).
- Riv forsiktig åpen muskuløs rør rundt luftrøret (figur 1E, F).
- Plassere kirurgisk tråd under luftrøret for senere ventilasjonsrør fiksering (figur 1G).
- Åpne luftrøret med mikro saks mellom brusk ringer utfører en T-formet snitt (figur 1 H)
- Plassere ventilasjonsrør i luftrøret gjennom snittet (~ 0,5 cm). Å presse røret fremover, grip hale enden med små anatomiske tang og forsiktig avansere røret inn i luftrøret (Figur 1I)
- Fiksere tube med kirurgisk tråd (f.eks (figur 1J, K).
- Seal kutt med vev lim (f.eks, n-Butyl-2-Cyanoacrylat) (Figur 1L).
- Fiksere rør på hodet med tape.
3. Laparatomy (15-20 min)
- Plasser musen på varmepute for å forebygge hypotermi. Barbere magen, fjerne nøye hår fra huden. Desinfiser barbert hud og pels ved hjelp povidonjodid løsning.
- Utføre en liten hud kutt under brystbenet ved hjelp av kirurgiske saks (Figur 2A). Forlenge kutt lateralt under ribbeina på begge sider, cauterizing alle synlige blodkar for å hindre blødning.
- Utføre nøye et lite kutt på linea alba under brystbenet, åpne peritoneum (figur 2B). Utvide kuttet til begge sider ved hjelp cauterizasjon for å hindre blødning (figur 2C, D).
- Plasser musen i agarose scenen fatet (2E). Plassere stabler av passende høyde på begge sider av mus (vanligvis 12-14 dekkglass) (figur 2F).
- Plasser luft trigger sensor under øvre del av ryggen for å synkronisere mikroskop med åndedrett. Aktiver trigger enhet (figur 2G).
- Plassere kirurgisk tråd (5-0) gjennom sternum å trekke tilbake ribbeina (Figur 2i).
- Kutte ligament koble leveren og membran (falciform ligament) samt lever og mage-tarm forsiktig med buede kirurgisk saks. Kutt falciform ligament ned til aorta (figur 2J).
4. Prøveoppsett (10-15 min)
- Plasser musen på høyre side med en vinkel på 45 ° for enkel tilgang til store leverlapp.
- Legg avholder bro under ribbeina, som dekker magehulrom. Produsere en bro ved hjelp av en standard dekkglass med teip belegg for å dekke skarpe kanter (Figur 2K).
- Plassere store leverlapp på scenen. Skli forsiktig dobbel ball pennen sonde eller en polstret slikkepott under leveren og hold øverst på orgelet med en våt bomullspinne eller vått vev. Løft lapp på lysbildet og bruke milde luftmotstand. Lapp kan bøyes eller brettes. Gi ekstra nøye med å bare milde manipulasjon av leveren (Figur 2L).
- Plassere lateral støtte stakes, f.eks til hauger av små dekkglass (20 mm x 20 mm), av omtrent samme høyde av leveren lapp ved siden av det støtte dekkglass.
- Plassere store dekkglass (24 mm x 50 mm) på leveren lobe. Sørg for at dekkglass er orientert så horisontalt som mulig (Figur 2M).
MERK: dekkglass bør være i kontakt med vevet uten å klemme den. Se etter synlige tegn på nedsatt blodstrøm (hvit vev). Hvis microcircbefolkningen blir forstyrret, legge til ytterligere støtte innsatsen. - * Plasser to uavhengige intraperitonale katetre (figur 2n) for langsiktig anestesi og G-5. Installere katetre lateralt i nedre del av magen ved siden av baklemmene.
MERK: intraperitonale katetre kan være selvgjort ved å koble 27 G nåler med fleksible silikonslanger (figur 3). - * Fiksér nål med en løkke av 5-0 kirurgisk tråd på huden for å unngå utilsiktet forskyvning.
- * Fest pumpesprøyte med bedøvelse løsningen jeg for kateter 1, setter strømningshastigheten til 0,2 ml / time; feste pumpesprøyte med G-5 til kateteret 2 angir strømningshastigheten til 0,1 ml / time.
5. Mouse Monitoring
- * Plasser EKG-elektroder inn foran og hind ekstremiteter (Figur 4A).
- * Fest utløpsslangen til CO 2 nivå sensor.
- Legg ekstern temperatursensor koblet til varmepute (Figur 4C).
6. Inkludering og Tissue Fiksering (5-10 min)
- Forbered 100 ml 3% (w / v) agarose i 1X PBS. Bygge inn leveren når temperaturen ligger ved 41 ° C under anvendelse av en 5 ml sprøyte og en 18 G nål (figur 5A).
- Hell resten av agarose på dekkglass og rundt mus (Figur 5B, C). Vent til agarose er fullt gelatineres.
- Fjern overflødig agarose bruker Heidemann spatel, forbereder en View stor nok til å skanne forberedt leverlapp (Figur 5D, E).
7. Imaging
- Overføre musen i mikroskop klimakammer.
- Legg 50 til 100 ml av 1 x PBS (forvarmet på 37 ° C).
- Dekk prøven rett til å hindre fordamping (figur 5F).
- * Reduser inhalative isofluran til 0,5 vol% (v / v).
- * Begynn overvåking programvare, innspilling EKG, puls og ekspiratorisk CO 2.
- Starte bilde: åpne laTjen skodder, identifisere vise felt av interesse, definere øvre og nedre grense for Z-stabler, og starttid intervallopptak. Juster på nytt Z-stabler eventuelt korrigere Z-drift (f.eks. På grunn av endringer i blodtrykk eller temperatursvingninger, fig (5G).
MERK: Etter fullførelse av avbildnings periode, eller hvis sirkulasjon eller anestesi av dyrene blir ustabil, ofre mus ved cervikal dislokasjon (uten oppvåkning fra anestesi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å validere vår intra TPLSM tilnærming, vi utsatt CXCR6 GFP / + mus til intra TPLSM bildebehandling. Musene var enten ubehandlet som grunnlinjekontroller eller utsatt for en enkelt intraperitoneal injeksjon av karbontetraklorid (CCI4) for å indusere akutt leverskade 20.
Videosekvenser ble utført over et tidsrom på 2-5 timer, og cellene ble spores over tid på grunn av den grønne fluorescens. Å vise generell mobilbevegelighet, ble alle sporene som ble oppdaget under prosedyren plottet som et innfelt bilde (figur 6A). Mens celler under baseline forhold viste lang avstand migrasjon langs lever sinusoids mot sentral vene, 18 timer etter CCI4 behandling de CXCR6 + / GFP celler viste allerede delvis nedsatt bevegelsesmønstre. Selv om noen rask bevegelse celler var fortsatt til stede i leveren sinusoids, flere fokusområder var synlige med celler somhadde forandret seg fra tilfeldig migrering til lokal skanning, noe som indikerer et kjemotaktisk respons rekruttering av celler til området for skade. Effekten ble enda mer uttalt etter 36 timer, viser en nesten komplett arrestasjonen av CXCR6 + celler med nesten ingen aktiv migrasjon. Mens under baseline forhold fleste utvandrende celler hadde variable migrasjons hastigheter med tilfeldige retningsendringer, viste CCl 4 behandlede dyr celler som ble bare langsomt kryp samt noen fritt bevegelige celler patruljerer sinusoids etter 18 timer, men ikke etter 36 hr. Ved hjelp av fargekodede migrerings spor, kunne cellehastigheten bli visualisert direkte for å vurdere effekten av CCI4 behandling. Den nedsatt migrasjon var også synlig i den normaliserte spordiagram (figur 6B), som viser at 18 timer etter CCI4 mengden av langspor så vel som den gjennomsnittlige sporlengden ble markert redusert, mens etter 36 timer ingen bevegelige celler var påvisbart noen mer. I tråd wed disse funnene, den cellulære fortrengning, som beskriver evnen av en celle til fritt overvåkning på vaskulaturen, redusert over tid, noe som indikerer en overlapping av cellene 36 timer etter CCI4 behandling på stedet av leverskade (figur 6C).
For å følge den vandringsadferd av CXCR6 + / GFP-celler i leveren i mer detalj, ble migreringshastigheten av representative individuelle celler er plottet for å visualisere graden av motilitet over tid. Vi og andre tidligere beskrevet flere distinkte bevegelsesmønstre av CXCR6 + / GFP celler: Aktiv tilfeldig crawling med en stikker rullende mønster, som viser faser av celle motilitet og timestillestående stater; rettet cellular rekruttering med celler skanner et område av interesse, men fortsatt i stand til aktiv kryp; total cellular arrest ledsaget av immuncelleaktivering 18,20. Mens musene uten behandling i hovedsak viste celler som var fritt Motile med hastigheter opp til 15 mikrometer / sek, vises CXCR6 + / GFP celler i mus behandlet med CCI4 markert reduserte celle migrasjon hastighet og delvis arrest allerede etter 18 timer og full vandrende arrest etter 36 timer (Figur 7A). I tråd med enkelt celle analyse, de statistiske data av alle celler i en sekvens avslørte avtagende samlet migrasjon fart etter CCI4 behandling (Figur 7B), som også ble lignet med gjennomsnittlig spor hastigheter (figur 7C) og spore maksimale migrasjons hastigheter (figur 7D), som viser at tilnærmingen var egnet til å beskrive forskjeller i cellemigrering og posisjonering i utviklingen av leversykdom.
Fig. 1: Tracheotomy av musen (A) kirurgisk utstyr som benyttes for fremstillingen. 1x standard pattern tang, 1x Semken tang, 1x Dumont No.7 tang, Græfe tang (taggete, 2x rett / 1x buede), 2x Blair Saker (4 kanter (sløv)), dobbelt kule stylus probe (f.eks Amalgam burnisher 3PL), Heidemann spatel HD2, nåleholder (Mathieu eller Halsey), 1x små kirurgiske saks (skarp / sløv, 1xcurved, 1x strake), mikro-saks (f.eks Vännäs Spring saks), 1x små dyr Cauter, bomullspinner, øye beskyttende Salve, kirurgisk tråden, n-butyl-2-Cyanoacrylatglue. (B) øyne er beskyttet med et øye beskyttende salve. (C) Initial hud kutt for luftrøret forberedelse. (D) Dissection av bindevev mellom kjertler under spyttkjertlene. (E) Exposition av luftrøret. (F) Disseksjon av muskelvevet som omgir luftrøret. (G) Plassering av kirurgisk tråd under luftrøret for fiksering av rør. (H) Tracheal snitt bruker microscissors mellom øvre bruskringer. (I) Innlegging av ventilasjonsrør i luftrøret. (J) Plassering av kranie kirurgisk tråd for å feste rør til huden. (K) Dobbeltfiksering av røret. (I) Tetting kirurgisk innsnitt ved hjelp av n-Butyl-2-Cyanoacrylat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Laparatomy og leveren forberedelse (A) Initial snitt i huden, ble blodkar cauterized å hindre overdreven blødning. (B) Åpning av peritoneum på undersiden av brystbenet. (C) Utvidelse av peritoneal kutt ved hjelp av kirurgienhet. (D) Tetting av epigastrica fartøy. (
Figur 3 "src =" / files / ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg "/>
Figur 3:. Intraperitoneal kateter 27 G nåler forbundet med fleksible silikonslanger.
Figur 4: Overvåking av musen. (A) Plassering av EKG-elektroder (grønne, røde, blå kabler). Nåler for EKG-deteksjon er plassert subkutant som vist. (B) Overvåking av EKG (rød), ekspiratorisk CO 2 (blå) og hjertefrekvens (rød) viser langsiktig progresjon (til venstre) og faktiske måling (høyre). (C) Temperaturstyrt kraftenhet for varmepute kontroll. Temperaturen er satt til 36 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Lever embedding og bildebehandling. (A) Inkludering av leverlapp. 3% agarose i PBS blir injisert ved 41 ° C under dekkglass ved anvendelse av en 2 ml sprøyte med en 18G nål. (B) Liver lapp er fullt integrert i agarose å minimere bevegelse gjenstander. (C) Tetting av bukhinne med gjenværende agarose for å unngå dehydrering. (D) Fjerning av agarose dekker mikroskop synsfelt etter full gelatinisering. (E) Fremstilling av View. F Justering av Z-nivå og evaluering av prøven blodstrøm ved hjelp av lysmikroskopi. (D) Cover rett til å hindre overdreven fordampning. Cover løftes på bildet for å vise oppsettet. Klikk her for å se et størreversjon av denne figur.
Figur 6:. Sporing av CXCR6 GFP / + celler i kronisk leverskade etter CCI4 injeksjon Mus ble injisert ip med 0,6 ml / kg CCI4 oppløst i solsikkeolje 18 timer eller 36 timer før bildebehandling. På dagen for eksperimentet ble musene utsatt for intravital TPLSM som beskrevet. (A) Stillbilder av celle sporing. Spor fra alle tidspunkter ble lagt for å vise mobilbevegelighet og fortrengning. Bildene ble tatt ved hjelp av en enkelt bjelke Titan Saphire Laser på 840 nm og en TPLSM mikroskop. Områder ble skannet tar 3-5 Z-stabler med en penetrasjonsdybde 70μm med en samplingsfrekvens på ca 30 sekunder per scan syklus. Sporene var fargekodet for å vise migrasjon hastighet (lys blå: langsom bevegelse eller fastsittende celler, lilla: bevegelige celler). Skala barer: 100 μ; M. (B) XY-diagrammer av stier normalisert for sin opprinnelse som viser spor retnings og sporlengde (mikrometer). (C) Total forskyvning av celler fra deres opprinnelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Migrerings Statistikken på CXCR6 GFP / + celler, etterfulgt av intravital TPLSM i levervev i referanse og CCI4 behandlede mus Celler ble analysert for deres migreringshastighet patruljer leveren.. (A) Representative hastighet av enkeltceller fulgt over tid. Hastigheten ble målt ved hvert tidspunkt og plottet for hver enkelt ramme. Linjene representerer individuelle celler. Y-akser dimensjoneres i forhold til maksimal migrasjon hastighet. (B) Statistical analyse av A. Frame bestemte hastigheter fra alle cellene ble gruppert og analysert i baseline og CCI4 behandlet mus. (C) Gjennomsnittlig spor hastighet ble beregnet per spor og data fra alle sporene ble gruppert for analyse. (D) Maksimal hastighet for hvert spor ble plottet og analysert. Alle forsøkene ble utført i grupper på 3 dyr, og resultatene ble bekreftet i to uavhengige forsøk. *** P <0,001 (tosidige uparet Student t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet for studien var å utvikle et sterkt standardisert, stabil og reproduserbar metode for intravital TPLSM avbildning av leveren. Intra bildebehandling generelt har gitt verdifull innsikt i mobilnettet oppførsel under reelle levekår følgende homing og samspillet mellom ulike leukocyttpopulasjoner i utvikling, homeostase og sykdom. Imidlertid, noe utfordrende anatomisk posisjon i leveren, grunnet som åndedretts- og peristaltiske tarmbevegelse direkte overføres til leveren, så vel som deres høye skjørhet i forhold til andre faste organer pålegges flere utfordringer for stabil langtidsintravital avbildning. Over de siste årene har mange eksperimentelle studier på mus avslørte svært dynamisk natur immuncelleinfiltrasjon i skadet leveren 28, med store bidrag fra bosatt eller infiltrere monocytter / makrofager 30-32, nøytrofile 33 eller ulike lymfocytt undergrupper 34,35. Imidlertid most av disse dataene ble avledet fra endepunkts analyser (f.eks, flerfarget flowcytometri etter ofre dyrene). Opp til nå kun få studier eksisterer beskriver dynamikken i mobiltrafikk i løpet av leverbetennelse ved hjelp flerfarget intra bildebehandling. Ved hjelp av invertert mikroskop omgår behovet for fiksering og fuktighets av leveren på grunn av den faste adhesjon av vev til glassbunn 24. Men siden mange multiphoton mikroskoper er bygget som oppreist bildesystemer, blir mer forseggjort forberedelse og fiksering er nødvendig for å stabilisere vev for tiden av bildebehandling. Vanligvis har skreddersydde iscenesettelse systemer blitt beskrevet for vev fiksering 6, 36,37, men med disse er det avgjørende å validere leveren mikrosirkulasjonen, siden selv minimal press på vevet påvirker sinusformet blodstrøm med enda mer alvorlige effekter på syke leveren 38 .
Derfor følgende punkter var annonsekledd i oppsettet av denne metoden for å optimalisere resultatene som oppnås ved in vivo TPLSM bildebehandling: Forbedre kvaliteten på forberedelse av minimert prøve forstyrrelse og forstyrrelser i mikrosirkulasjonen grunn håndtering problemer og økt dyr overleve; intensiven overvåking og nødvendig tilpasning av anestesi, respirasjon og stabilisering av opplaget ytterligere forbedret dyr overlevelse og minimert fysiologiske gjenstander, for eksempel forårsaket av ubalanser i blodet pH. Kontrollert respirasjon i kombinasjon med utløst bildebehandling var avgjørende for å eliminere bevegelse gjenstander på grunn av synkronisering av mikroskop med respirasjonssyklusene. Innkapsling av organet i agarose inneholdende fysiologiske saltkonsentrasjoner var gunstig å forsiktig fiksere organet etter fremstilling uten ytterligere mekanisk manipulering og hindret også dehydrering av prøven. De fleste protokollene som brukes for leveren mikros gir bare utilstrekkelige metoder for sta bare, langsiktig anestesi. Imidlertid kunne overlevelse av dyrene bli betydelig forbedret med anestesi protokollen gitt her og i kombinasjon med overvåkingen ble tilstrekkelig til å sikre overlevelse opptil 8 timer. Alternative metoder er generelt egnet for å visualisere prosesser i en tidsperiode på opp til 3 timer, for eksempel nøytrofil invasjon 39, men mangler muligheten til bildet som varer lenger prosesser slik som monocytt eller lymphocyte invasjon 22 eller celleproliferasjon 6. Forstå dynamikken i rekruttering, infiltrasjon og cellulær interaksjon under akutt og kronisk leverbetennelse kan gi mer detaljert innsikt i utvikling og progresjon av leversykdom. Ved hjelp av denne forbedrede forståelsen av immunpatologi vil det være mulig å utforme behandlings mye mer raffinert i form av adressering målcellene av interesse istedenfor å bruke for eksempel ikke-selektive immunosuppressive tilnærminger.
ove_content "> For å adressere posisjonering, sjelevandring og samhandling av leukocytter, er bilder av høy kvalitet som trengs for nøyaktig 4D sporing av cellene i leveren blodkar og levervev 18,20,40.Metoden gir vi her kan påføres ved hjelp av vanlige laboratorie reagenser og utstyr, noe som gjør det både er lett å håndtere og kostnadseffektivt med minimal forstyrrelse av prøven. For å opprettholde de fysiologiske tilstander i mus for så lenge som mulig, er det nødvendig å finjustere den respiratoriske volum og frekvens for å kontrollere blodoksygenering og CO2-nivåene. Selv om det på grunn av den kontinuerlige infusjon av væsker inn i peritoneum det er minst en tentativ tilførsel for å stabilisere sirkulasjons, EKG og hjertefrekvensmålinger tillater bare en delvis kontroll angående stabilisering av sirkulasjonen. Ved å implementere direkte blodtrykkskontroll og sentralt vene flytende programmet er det sannsynlig at den vitale parametere kan stabiliseres enda mer, noe som fører til ytterligere forbedring av stabilitet og overlevelse.
Selv under svært kontrollerte betingelser, avbildning av dyr som er blitt utsatt for leverskader modeller som vanligvis brukes i mus som paracetamol-indusert leverskade, CCI4 indusert leverskade eller diettinduserte fettleversykdom forblir utfordrende. På grunn av den essensielle funksjon av leveren i metabolske statlig kontroll og sin sentrale posisjon i sirkulasjon, til endringer i leveren funksjonalitet eller mikrosirkulasjon direkte påvirker langsiktig overlevelse av dyrene, derfor begrenser muligheten skaffe lange TPLSM video-sekvenser av tungt ødelagte organer, f.eks med alvorlige blødninger eller ødelagt microvasculature. Også i sterkt endret levermikroanatomi som i modeller med omfattende nekroser, er det fortsatt vanskelig å studere celle-celle-interaksjoner og lokale compartmentalization av inflammatoriske celle aggregater, fordi ingen standardized "kontrafarging" for anatomiske strukturer (for eksempel hematoksylin-farging i konvensjonell mikroskopi eller DAPI farging i immunfluorescens) er tilgjengelig for intravital TPLSM.The kvaliteten av de data som oppnås ved avbildningsprosessen videre avhenger av intensiteten merking av cellene og mikroskopisk oppsett.
Flere tilnærminger eksisterer for å visualisere GFP + celler i leveren. Den høyeste fluorescens med meget lav bakgrunnsfluorescens oppnås mellom 900 og 920 nm eksitasjonsbølgelengde. Den nesten fullstendig tap av lever bakgrunnsfluorescens ikke tillater å undersøke plassering av cellene i leveren, når den ikke er bruk av ytterligere fartøyets bane slik som dekstran eller lektin. Derfor bestemte vi oss for å image de trekkende leukocytter ved en bølgelengde på 840 nm, noe som gir det beste forholdet mellom GFP signal og detaljert, men ikke for lyse leveren bakgrunn fluorescens.
Tatt sammen, intrAVITAL TPLSM avbildningssystem introdusert i denne studien kan anvendes på et bredt utvalg av leverspesifikke intravital mikros spørsmål. Med denne fremgangsmåten, er TPLSM avbildning i andre faste organer slik som nyre, lever, blære, tarm eller bukspyttkjertel bart med bare mindre modifikasjoner av de kirurgiske prosedyrer og vev staging, derfor gir en svært fleksibel måte for å undersøke langtids trekkende prosesser av celler i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
