Abstract
Leverinflammation som ett svar på skada är en mycket dynamisk process med infiltration av distinkta subtyper av leukocyter inklusive monocyter, neutrofiler, T-cell undergrupper, B-celler, naturliga mördar (NK) och NKT-celler. Intravital mikroskopi av levern för att övervaka immuncellmigration är speciellt utmanande på grund av de höga krav på provberedning och fixering, optisk upplösning och långsiktig djur överlevnad. Ändå kunde dynamiken i inflammatoriska processer samt cellulära interaktionsstudier ger viktig information för att bättre förstå initieringen, progression och regression av inflammatorisk leversjukdom. Därför gjordes en mycket känslig och tillförlitlig metod etablerats för att studera migration och cell-cell-interaktioner av olika immunceller i muslever under långa perioder (ca 6 h) genom intravital två-foton-laserskanning mikroskopi (TPLSM) i kombination med intensivvård övervakning.
ent "> Den metod som innefattar en mild förberedelse och stabil fixering av levern med minimal störning av orgeln, långsiktiga intravital avbildning med multicolor multifotonmikroskop med praktiskt taget ingen fotoblekning eller fototoxiska effekter under en tidsperiod på upp till 6 timmar, vilket gör spårning av specifika leukocyter delmängder samt stabila avbildningsförhållanden på grund av omfattande övervakning av mus vitala parametrar och stabilisering av cirkulation, temperatur och gasutbyte.För att undersöka lymfocytmigration vid leverinflammation CXCR6.gfp knock-in-möss utsattes för intravital avbildning av levern enligt utgångsläget och efter akut och kronisk leverskada inducerad genom intraperitoneal injektion (er) av koltetraklorid (CCI4).
CXCR6 är en kemokinreceptor uttrycks på lymfocyter, främst på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - och undergrupper av T-lymfocyter såsom CD4 T-celler utan även slemhinnor Associrerad invariant (MAIT) T-celler 1. Efter migrationsmönster och placering av CXCR6.gfp + immunceller får en detaljerad inblick i deras förändrade beteende vid leverskada och därmed deras potentiella inblandning i sjukdomsförloppet.
Introduction
Visualiseringen av celler och cellfunktioner i hela organ eller till och med hela organismer har varit av stort intresse för mer än 50 år, däribland praktiskt taget alla delar av kroppen 2. Därför vissa tidiga studier redan anställda intravital avbildning av levern 3,4. Det finns dock flera begränsningar uppdaterade om långsiktigt stabil högupplösta avbildning av levervävnad.
På grund av den anatomiska positionen av levern i nära kontakt med membranet och mag-tarmkanalen 5, det vanligaste problemet för mikroskopisk intravital avbildning är rörelser som beror på andning och, i mindre utsträckning, peristaltisk av tarmkanalen 6. I jämförelse med andra fasta organ, är leverkirurgi särskilt utmanande. På grund av den täta mikrovaskulära strukturen, kan kirurgisk manipulation leda till massiva hemorragiska skador, nedsatt mikrocirkulation 7 och även aktivering av bosatta immune celler såsom Kupffer-celler 8. Därför mekanisk fixering av vävnaden som publicerats på annat håll 6,9 sannolikt störa intravital mikroskopi avbildning.
I en frisk lever, bosatt 10-15% av den totala blodvolymen i levern vaskulaturen, och orgeln mottar cirka 25% av den totala hjärtminutvolym 10, rendering orgeln mycket mottagliga för ändringar i cirkulationen (t.ex. blodtrycksfluktuationer ). Därför kommer störningar i leverblodflödet grund av t.ex. skjuvspänning, förskjutning, skada av överdriven hantering vävnad eller centraliserad cirkulation leda till artificiella förändringar i leukocyt vandrande beteende, nedsatt lever syresättning och därmed ytterligare leverskador, som påverkar leverimmunsvar samt som organbevarande och övergripande livstiden för djuret.
Tidiga mikroskopiska studier baserades på intravital epifluorescence microscopy, men flera tekniska begränsningar, till exempel fotoblekning och låg penetrationsdjup begränsa användningen av denna teknik för långsiktig avbildning av levern 4,11,12. Med utvecklingen av multifoton mikroskopi på 1990-talet, var begränsningarna i fotoblekning eller penetrationsdjup främst lösas, eftersom denna nya metod var tekniskt kapabla att utföra imaging studier i praktiskt taget alla organ enligt verkliga situationer 13-15. Men de viktigaste återstående utmaningar när det gäller avbildning av levern var: breath rörelser, autofluorescens av levervävnad, säkra oförändrat blodflöde i lever sinusoider, och speciellt stabil avbildning för längre perioder av flera hr 16.
Trots att flera studier adresserade funktion och migration av olika leukocyter i levern 17, t.ex. NKT-celler 18-20, T-celler 21,22, levermakrofager 23,24 eller neutrofiler 25, långsiktig multifoton microscopy avbildning hade ännu inte upprättats, en uppgift ännu svårare hos djur med akut eller kronisk leversjukdom på grund av den befintliga skador och därmed högre känslighet för ytterligare skador 26. Men övervakning vandrande beteende och cellulär funktion av leukocyter i levern i realtid möjliggör nya insikter i sin speciella roll i lever homeostas och sjukdom 27.
Kemokinreceptorn CXCR6 uttrycks på flera lymfocytundergrupper, inklusive naturliga mördarceller (NK) celler, NKT-celler och vissa T-cellspopulationer 18,28. Tidigare studier på möss har visat att CXCR6 och dess tillhörande ligand CXCL16 kan styra patrullering av NKT-celler på lever sinusoids under homeostas. Följaktligen har användningen av CXCR6.gfp möss (som bär en knock-in av grönt fluorescerande protein [gfp] i CXCR6 lokuset) beskrivits för att undersöka migration av lymfocyter i olika organ såsom hjärna 29och även levern 18,20, visande ökad infiltration av CXCR6.gfp celler vid inflammation.
Med den metod som i denna studie var det möjligt att följa dessa processer under en lång tid under stabila förhållanden. Den intravital multifotonbaserad förfarande tillåts avbildning som var mycket reproducerbar med minimal störning av djuret och orgel; optimerad för långsiktig djuröverlevnad av omfattande övervakning följt av noggrann kontroll av andning och cirkulation; och mycket flexibel och lätt att även anta andra parenkyma organ såsom njure eller mjälte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Experimenten utfördes i enlighet med den tyska lagstiftningen om djurstudier efter "Guide för vård och användning av försöksdjur" (NIH publikation, 8: e upplagan, 2011) och direktiv 2010/63 / EU om skydd av djur används för vetenskapliga ändamål (Europeiska unionens officiella tidning, 2010). Officiell tillstånd beviljades från regerings djurvård och använda office (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland).
OBS: Steg som kan utelämnas för korttids avbildning (t.ex. snap shots, 3-D-stackar eller också kortvarig tidsförlopp mikroskopi) är markerade med asterisk (*) för att minska förberedelsetid och förenkla kirurgiska protokollet. Imaging kan också utföras utan omfattande övervakning och cirkulationskontroll vid behov, dock överlevnadstiden kommer att minskas markant.
1. Mikroskop Setup och Pre-kirurgi Förberedelse (5-10 kmn)
- Slå systemet (mikroskop, makt Lab, laser, värmedyna, klimatkammare, webbkamera, sprutpumpanordning, respirator).
- Anslut O2 leverans till isofluran Vapor och ställ isofluran nivå till 1,5 vol% (v / v), anslut till ett litet djur respirator.
- För korttids avbildning, upprätthålla anestesi använder isofluran först efter den inledande ip anestesi induktion (se steg 2.2). Använd sedan 2 vol% (v / v) isofluran, och hålla avbildningstiden under 2 tim för att garantera en stabil levermikrocirkulation.
- Ställ andning till 120-140 andningscykler / min med en volym på 150-200 l.
- Konfigurera musen agaros skede. Bered 100 ml av 3% (vikt / vol) agaros, hälla det i en skål (ca 10 cm x 15 cm bas) i en vinkel av 40 °.
- Konfigurera kirurgiska arbetsområdet uppsamling av den instrumentering som krävs. För att förhindra mikrobiell infektion, desinficera instrument som använder en 1% lösning av Sekusept Forte S (9,9% vikt / vol), Glutaral 9,8% vikt / volym, Formaldehyd för 5 minuter före experimentet (Figur 1A).
- Skaffa återstående komponenter: hud desinfektionsmedel (t ex 10% povidon jodlösning), leverstadiet (stackar & bro), agaroslösning (3% (vikt / volym) i PBS), sprutpump med 5% (vikt / volym) glukoslösning (G-5), sprutpump med anestetisk lösning I (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 | ig / ml), bomullspinnar, n-butyl-2-Cyanoacrylat, och 1 x PBS. Sätt agaros skede skålen i inkubation kammare för förvärmning.
2. Trakeotomi (10-15 min)
- Använd C57BL / 6 möss från i hus avel väger 25-28 g. Hus mössen under specifika patogenfria förhållanden i enlighet med FELASA riktlinjerna, i en temperatur- och fuktighetskontrollerad miljö med en 12 timmars ljus / mörker-cykel 12 tim. Tillåt djuren fri tillgång till standardmöss diet (Sniff Standard Gnagare Diet) och vatten efter behag.
- Bedöva musen genom initial intraperitoneala (ip) injektion av 250 ul av anestetisk lösning II (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 1 mg / ml, buprenorfin 10 | ig / ml).
- * För underhåll under intravital avbildning, kontinuerligt administrera bedövningsmedel lösning I genom kontinuerlig ip-injektion (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 | ig / ml) med användning av en sprutpumpanordning med en flödeshastighet av 0,2 ml / h i kombination med inhalativ isofluran 0,5 vol% (vol / vol).
- Kontrollera reflexer efter 5 min (t.ex. nypa foten pad med pincett), desinficera huden för trakeotomi, börja förbereda om musen är i kirurgisk tolerant anestesi tillstånd.
- Applicera ögonskyddskräm (t.ex., Dexpantenol 50 mg / g) för att förhindra hornhinnan torkar ut (Figur 1B).
- Fixera musen på förberedelser bordet utsätta ventralsidan med tejp för extremiteter; försiktigt överanstränga nacken, fixera i detta läge, t ex., genom att använda ett gummiband hooked to framtänderna.
- Desinficera huden och päls med hjälp povidon jodlösning, genom att applicera desinfektionsmedel med en bomullspinne.
- Utför initial hud cut (0,5-1 cm längd) direkt under hakan (Figur 1C)
- Dissekera försiktigt bindväv mellan spottkörtlar (Figur 1D).
- Försiktigt riva upp muskel röret som omger luftstrupe (Figur 1E, F).
- Placera kirurgisk tråd under luftstrupen för senare ventilationsrör fixering (figur 1G).
- Öppen trakea med mikro-sax mellan broskringar som utför en T-formad inskärning (Figur 1H)
- Placera ventilationsröret i luftstrupen genom snittet (~ 0,5 cm). För att driva röret framåt, ta tag stjärtfenan änden med små anatomiska pincett och försiktigt föra röret i luftstrupen (figur 1I)
- Fixera röret med kirurgisk tråd (t.ex. (figur 1J, K).
- Försegla skuren med vävnadslim (t.ex. n-butyl-2-Cyanoacrylat) (figur 1L).
- Fixera röret i spetsen med tejp.
3. Laparatomy (15-20 min)
- Placera musen på värmedyna för att förhindra hypotermi. Raka buken, försiktigt bort håret från huden. Desinficera rakat hud och päls genom att använda povidon jodlösning.
- Utför en liten hud skära nedanför bröstbenet med kirurgiska saxar (Figur 2A). Utöka snittet i sidled under revbenen på båda sidor, etsande alla fartyg synliga blod att förhindra blödning.
- Utför försiktigt ett litet snitt i linea alba nedanför bröstbenet, öppna bukhinnan (Figur 2B). Utöka snittet till båda sidor med cauterization för att förhindra blödning (Figur 2C, D).
- Placera musen i agaros skede skålen (Figur 2E). Placera buntar av lämplig höjd på båda sidor av mus (vanligtvis 12-14 täckglas) (figur 2F).
- Placera andnings trigger sensor under övre delen av ryggen för att synkronisera mikroskop med andningen. Aktivera triggerenhet (figur 2G).
- Placera kirurgisk tråd (5-0) genom bröstbenet för att dra tillbaka revben (Figur 2i).
- Skär försiktigt ligament som förbinder lever och membranet (falciformligament) samt lever och mag-tarmkanalen med hjälp böjda kirurgisk sax. Skär falciformligament ner till aorta (Figur 2J).
4. Prov Setup (10-15 min)
- Placera musen på höger sida med en vinkel på 45 ° för enkel tillgång till stora lever lob.
- Lägg iscensättning bro under revbenen, som täcker bukenhålighet. Tillverkning en bro med hjälp av en vanlig täckglas med tejp beläggning för att täcka vassa kanter (Figur 2K).
- Placera stora leverlob på scenen. Försiktigt glider dubbla bollen penna sond eller en vadderad spatel nedanför levern och håll upp i orgeln med en våt bomullstuss eller våt vävnad. Lyft lob på bilden och tillämpa skonsam dra. Lobe kan böjas eller vikas. Ge extra noga med att enbart mild manipulation av levern (Figur 2L).
- Placera sidostöd stakes, t.ex. för att högar av små täckglas (20 mm x 20 mm), av ungefär samma höjd i levern lob bredvid stödja täckglas.
- Placera stora täckglas (24 mm x 50 mm) på levern lob. Se till att täckglas är orienterad så horisontell som möjligt (Figur 2 M).
OBS: Den täckglas ska vara i kontakt med vävnaden utan att klämma. Kontrollera om synliga tecken på nedsatt blodflöde (vit vävnad). Om Microcirclering störs, lägga ytterligare stöder insatser. - * Placera två oberoende intraperitoneala katetrar (Figur 2N) för långsiktig anestesi och G-5 ansökan. Installera katetrar i sidled i nedre delen av magen bredvid bakbenen.
OBS: De intraperitoneala katetrar kan vara self-made genom att ansluta 27 G nålar med flexibel silikonslang (Figur 3). - * Fixera nål med en slinga av 5-0 kirurgisk tråd på huden för att undvika oavsiktlig förflyttning.
- * Fäst sprutpump med anestesi lösning I till katetern 1, ställa flödet till 0,2 ml / h; fästa sprutpump med G-5 till katetern 2, ställa in flödeshastigheten till 0,1 ml / timme.
5. Mus Övervakning
- * Placera EKG-elektroder i fronten och hind extremiteter (Figur 4A).
- * Bifoga utgångsslangen till CO 2 nivåsensor.
- Lägg temperatursensor extern ansluten till värmedyna (Figur 4C).
6. Bädda och Tissue Fixering (5-10 min)
- Bered 100 ml av 3% (vikt / volym) agaros i 1X PBS. Bädda levern när temperaturen är vid 41 ° C med användning av en 5 ml spruta och en 18 G nål (figur 5A).
- Häll återstående agaros på täckglas och runt mus (Figur 5B, C). Vänta tills agarosen är helt gelatinerad.
- Ta bort överflödigt agaros använder Heidemann spatel, förbereder en View stor nog att skanna beredd leverlob (Figur 5D, E).
7. Imaging
- Överför musen till mikroskopet klimatkammare.
- Lägg 50-100 ml 1x PBS (förvärmd på 37 ° C).
- Täck prov skålen för att förhindra avdunstning (figur 5F).
- * Minska inhalativ isofluran till 0,5 vol% (vol / vol).
- * Börja övervakning programvara, inspelning EKG, hjärtfrekvens och utandnings CO2.
- Starta avbildning: öppna laSer fönsterluckor, identifiera visa fält av intresse, definiera övre och nedre gräns för Z-stackar, och börja intervallinspelning. Justera Z-stackar vid behov för att korrigera Z-drift (t.ex.. Grund av förändringar i blodtryck eller temperaturvariationer, figur (5G).
OBS: Efter avslutad bildperioden eller om omsättning eller bedövning av djuret blir instabilt, offra möss genom halsdislokation (utan uppvaknande från narkos).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera vår intravital TPLSM strategi, vi utsätts CXCR6 GFP / + möss för intravital TPLSM avbildning. Möss antingen lämnas obehandlade som baseline kontroller eller utsättas för en enda intraperitoneal injektion av koltetraklorid (CCI4) för att framkalla akut leverskada 20.
Videosekvenser togs över en tidsperiod av 2-5 timmar, och cellerna spåras över tid på grund av deras grön fluorescens. För att visa allmän cellulär motilitet, var alla spår som upptäcktes under förfarandet ritas som en överlagrad bild (figur 6A). Medan celler enligt huvudscenariot visade långväga migration längs lever sinusoider mot central ven, 18 timmar efter CCI4 behandling de CXCR6 + / GFP celler visade redan delvis nedsatt rörelsemönster. Även om vissa snabbrörliga celler fortfarande närvarande i lever sinusoiderna flera fokusområden var synliga med celler somhade ändrats från slumpmässig migration till lokal skanning, vilket indikerar en kemotaktisk respons rekrytera cellerna till området för skadan. Effekten var ännu mer uttalad efter 36 timmar, visar en nästan fullständig gripandet av CXCR6 + celler med praktiskt taget ingen aktiv migration. Även enligt huvudscenariot flesta vandrande celler hade variabla migrationshastigheter med slumpriktningsändringar, visade CCU 4 behandlade djur celler som endast långsamt kryper liksom vissa fritt rörliga celler patrullerar sinusoids efter 18 timmar, men inte efter 36 timmar. Använda färgkodade migrationsspår, kunde cellhastighet visualiseras direkt för att bedöma effekten av CCI4 behandlingen. Den försämrade migreringen var också synlig i den normaliserade spårdiagrammet (figur 6B), som visar att 18 timmar efter CCI4 mängden långväga spårar liksom den genomsnittliga spårlängden reducerades markant, medan efter 36 tim inga rörliga celler var detekterbara någon mer. I linje wed dessa fynd, den cellulära förskjutning, som beskriver förmågan hos en cell att fritt patrullera kärl, minskade med tiden, vilket indikerar en fångst av cellerna 36 timmar efter CCI4 behandling vid platsen för hepatocellulär skada (Figur 6C).
För att följa flyttbeteende CXCR6 + / GFP celler i levern mer i detalj, var migrationen hastighet representativa enskilda celler ritas för att visualisera deras nivå av rörlighet över tiden. Vi och andra tidigare beskrivits flera distinkt rörelsemönster i CXCR6 + / GFP celler: Aktiv slumpmässig genomsökning med en stickning rullande mönster, visar faser av cellrörlighet och tids vilande tillstånd; riktad cellulär rekrytering med celler skannar ett område av intresse, men fortfarande kan aktivt krypande; totala cellulära gripande åtföljs av immuncellsaktivering 18,20. Medan möss utan behandling visade främst celler som var fritt Motile med hastigheter upp till 15 nm / sek, som visas CXCR6 + / GFP celler i möss som behandlats med CCI4 markant reducerade cellmigration hastighet och partiell stillestånd redan efter 18 timmar och full vandrande gripande efter 36 timmar (Figur 7A). I linje med den enda cellanalys, statistiska data för alla celler i en sekvens avslöjade minskande total migration hastigheten efter CCI4 behandling (figur 7B), som också liknade med genomsnittspårhastigheter (Figur 7C) och spåra maxhastigheter migrations (Figur 7D), som visar att den metod var lämplig för att beskriva skillnader i cellmigration och positionering utveckla leversjukdom.
Figur 1:. Trakeotomi av musen (A) Kirurgisk utrustning som används för beredning. 1x standard patterenn pincett, 1x Semken pincett, 1x Dumont No.7 pincett, GRAEFE pincett (tandad, 2x rak / 1x böjda), 2x Blair upprullningsdon (4 fronter (trubbig)), dubbla bollen penna sond (t.ex. Amalgam poler 3PL), Heidemann spatel HD2, nål hållare (Mathieu eller Halsey), 1x små kirurgiska saxar (skarp / trubbig, 1xcurved, 1x raka), mikro-sax (t.ex. Vannas våren sax), 1x litet djur Cauter, bomullspinnar, öga skydds Salve, kirurgisk tråd, n-butyl-2-Cyanoacrylatglue. (B) ögon skyddas med hjälp av en ögonskydds salva. (C) Inledande hud skuren för luftstrupen förberedelse. (D) Dissektion av bindväv mellan mandibularlymfknutorna spottkörtlar. (E) Exposition av trakea. (F) Dissektion av muskelvävnaden som omger luftstrupen. (G) Placering av kirurgisk tråd under luftstrupen för fixering av röret. (H) Tracheal snitt använder microscissors mellan övre broskringar. (I) Insättning av ventilationsröret in i luftstrupen. (J) Placering av kraniala kirurgisk tråd att fixa röret på huden. (K) Dubbel fixering av röret. (I) Tätning kirurgiskt snitt använder n-butyl-2-Cyanoacrylat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Laparatomy och lever beredning (A) Initial hud snitt, var blodkärl flamberats att förhindra alltför stora blödningar. (B) Öppnande av peritoneum under bröstbenet. (C) Förlängning av peritoneal snitt använder cautery enhet. (D) Tätning av epigastrisk fartyg. (
Figur 3 "src =" / filer / ftp_upload / 52.607 / 52607fig3.jpg "/>
Figur 3:. Intraperitoneal kateter 27 G nålar i samband med flexibel silikonslang.
Figur 4: Övervakning av musen. (A) Placering av EKG-elektroder (grön, röd, blå kablar). Nålar för EKG detektion placeras subkutant enligt bilden. (B) Övervakning av EKG (röd), utandnings CO2 (blå) och hjärtfrekvens (röd) visar långsiktig progression (vänster) och faktisk mätning (höger). (C) Kyl kraftenhet för värmedyna kontroll. Temperatur är inställd på 36 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lever inbäddning och bildbehandling. (A) Inbäddning av lever lob. 3% agaros i PBS injiceras vid 41 ° C under locket glida med användning av en 2 ml spruta med en 18G nål. (B) Lever lob är helt inbäddad i agaros att minimera rörelse artefakter. (C) Tätning av bukhinnan med återstående agaros för att förhindra uttorkning. (D) Borttagning av agaros täckande mikroskop synfält efter full gelatinisering. (E) Framställning av View. F Justering av Z-nivå och utvärdering av prov blodflöde med ljusmikroskop. (D) Cover skålen för att förhindra överdriven avdunstning. Locket lyfts i bilden för att visa installationen. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.
Figur 6:. Spårning av CXCR6 GFP / + celler i kronisk leverskada efter CCI4 injektion Möss injicerades ip med 0,6 ml / kg CCI4 löst i solrosolja 18 h eller 36 h före avbildning. På dagen för experimentet, möss utsattes för intravital TPLSM såsom beskrivits. (A) Stillbilder av spårning cell. Spår från alla tidpunkter var lagrade visa cellulär motilitet och förskjutning. Bilder togs med hjälp av en enda stråle Titan Saphire Laser vid 840 nm och en TPLSM mikroskop. Områden skannades med 3-5 Z-stackar med en penetrationsdjup 70μm med en samplingsfrekvens på cirka 30 sekunder per skanning cykel. Spår var färgkodade för att visa migrationshastighet (ljusblå: långsam rörelse eller fastsittande celler; lila: rörliga celler). Skala barer: 100 μ; M. (B) XY-diagram av vägar normaliserade för deras ursprung visar spårrikt och spårlängd (um). (C) Total förskjutning av celler från deras ursprung. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Migration statistik CXCR6 gfp / + celler följt av intravital TPLSM i levervävnad i baslinjen och CCI4 behandlade möss Celler analyse för sin migrationshastighet patrullerar levern.. (A) representant hastighet av enskilda celler följt med tiden. Hastighet mättes vid varje tidpunkt och plottas för varje ram för sig. Linjer representerar individuella celler. Y-axlar skalas enligt maximal migration hastighet. (B) Statistical analys av A. Frame specifika hastigheter från alla celler grupperades och analyserades i baslinjen och CCI4 behandlade möss. (C) Genomsnittlig banan beräknades per spår och data från alla spår grupperades för analys. (D) Maxhastighet på varje spår ritades och analyseras. Alla experiment utfördes i grupper om tre djur, och resultaten bekräftades i två oberoende experiment. *** P <0,001 (tvåsidiga oparade Student t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med vår studie var att utveckla en mycket standardiserad, stabil och reproducerbar metod för intravital TPLSM avbildning av levern. Intravital avbildning i allmänhet har gett värdefulla insikter i cellulär beteende under verkliga förhållanden efter målsökande och samverkan mellan olika leukocytpopulationer inom utveckling, homeostas och sjukdom. Men något utmanande anatomiska position levern, på grund av vilka andnings och peristaltiska tarmrörelser direkt överförs till levern liksom deras höga bräcklighet jämfört med andra fasta organ införde flera utmaningar för en stabil långsiktig intravital avbildning. Under senare år har många experimentella studier på möss visat den mycket dynamiska karaktär immuncellinfiltration i skadade levern 28, med stora bidrag från bosatta eller infiltrerande monocyter / makrofager 30-32, neutrofiler 33 eller olika lymfocytundergrupper 34,35. Emellertid mOST av dessa uppgifter härrörde från slutpunktsanalyser (t.ex. multicolor flödescytometri efter offra djuren). Hittills bara få studier existerar beskriver dynamiken i cellulär trafik under leverinflammation med hjälp multi intravital avbildning. Använda inverterade mikroskop kringgår nödvändigheten för fixering och fuktande av levern på grund av den fast adhesion av vävnaden till glaset botten 24. Men eftersom många multifotonmikroskop är byggda som upprätt bildsystem, är mer avancerade förberedelser och fixeringsmetoder som behövs för att stabilisera vävnaden för tiden för avbildning. Vanligen har skräddarsydda mellansystem beskrivits för vävnadsfixering 6, 36,37, men med dessa är det viktigt att validera levern mikrocirkulationen, eftersom även minimalt tryck på vävnaden påverkar sinus blodflöde med ännu mer allvarliga effekter på sjuka levern 38 .
Därför följande punkter var annonsklädd i installationen av denna metod för att optimera de resultat som erhållits genom in vivo TPLSM imaging: Förbättra kvaliteten på beredningen av minimerade prov störning och störningar i mikrocirkulationen på grund av hanteringen frågor och ökad djur överlevnad; intensivvårdsövervakning och senare anpassning av anestesi, respiration och stabilisering av cirkulationen förbättras ytterligare djur överlevnad och minimerade fysiologiska artefakter, t.ex. orsakad av obalanser i blod pH. Kontrollerad andning i kombination med utlöst avbildning var nödvändigt för att eliminera rörelseartefakter på grund av synkronisering av mikroskopet med andningscykler. Inbäddning av orgeln i agaros innehållande fysiologiska saltkoncentrationer var fördelaktigt att försiktigt fixera orgeln efter beredning utan ytterligare mekanisk manipulation och förhindrade även uttorkning av provet. De flesta protokoll som används för lever mikroskopi ger bara otillräckliga metoder för sta ble, långsiktig anestesi. Dock kunde överlevnad djuren förbättras avsevärt med anestesi protokoll som här och i kombination med en övervakning har tillräckligt för att garantera överlevnad upp till 8 timmar. Alternativa metoder är generellt lämpliga att visualisera processer inom en tidsperiod på upp till 3 timmar, såsom neutrofila invasionen 39, men saknar möjligheten att bilden längre varaktiga processer såsom monocyter eller lymfocyter invasion 22 eller till och med celltillväxt 6. Förstå dynamiken i rekrytering, infiltration och cellulär interaktion under akut och kronisk leverinflammation kan ge mer detaljerad inblick i utvecklingen och utvecklingen av leversjukdom. Genom att använda denna förbättrade förståelse för immunopatologi det att vara möjligt att utforma terapier mycket mer raffinerad i form av att ta itu med målceller av intresse snarare än att använda t.ex. icke-selektiva immunosuppressiva tillvägagångssätt.
ove_content "> För att hantera positionering, transmigration och interaktion av leukocyter, är högkvalitativa bilder behövs för noggrann 4D spårning av cellerna i levern kärl och levervävnad 18,20,40.Metoden tillhandahåller vi här kan appliceras med användning av vanliga laboratoriereagens och utrustning, vilket gör den både lätt att hantera och kostnadseffektiv med minimal störning av provet. För att upprätthålla de fysiologiska betingelserna för musen för så länge som möjligt, är det nödvändigt att finjustera andningsvolym och frekvens för att styra syresättning och blod CO 2 nivåer. Även på grund av den kontinuerliga infusionen av vätskor i bukhinnan finns åtminstone en preliminär leverans att stabilisera cirkulation, EKG och hjärtfrekvensmätningar endast tillåta en partiell kontroll avseende stabilisering av cirkulationen. Genom att implementera direkt blodtryckskontroll och central venös flytande ansökan är det troligt att den vitala PARAMETers kan stabiliseras ännu mer, vilket leder till ytterligare förbättring av stabilitet och överlevnad.
Även under mycket kontrollerade betingelser, avbildning av djur som har utsatts för leverskador modeller som vanligtvis används i möss såsom acetaminofen inducerad leverskada, förblir CCI4 inducerad leverskada eller dietary inducerad fettlever utmanande. På grund av den grundläggande funktion levern i metabola statlig kontroll och dess centrala läge i cirkulationen, att förändringar av leverfunktion eller mikrocirkulation direkt påverkan långsiktiga överlevnad av djuren, därför begränsar möjligheten få långa TPLSM video-sekvenser av tungt skadade organ, t.ex. med allvarliga blödningar eller förstörda mikrovaskulatur. Även i kraftigt förändrad levermikroanatomi som i modeller med omfattande nekros, är det fortfarande svårt att studera cell-cell-interaktioner och lokal uppdelning av inflammatoriska cellaggregat, eftersom ingen stanställd "counter-färgning" för anatomiska strukturer (såsom hematoxylin-färgning i konventionell mikroskopi eller DAPI färgning i immunofluorescens) är tillgänglig för intravital TPLSM.The kvaliteten på de uppgifter som erhållits genom avbildningsprocessen vidare beror på märkningen intensiteten av cellerna och mikroskopisk installationen.
Flera tillvägagångssätt existerar för att visualisera GFP + celler i lever. Den högsta fluorescens med mycket låg bakgrundsfluorescens erhålles mellan 900 och 920 nm excitationsvåglängd. Den nästan fullständig förlust av lever bakgrundsfluorescens tillåter inte undersöker positioneringen av celler i levern, när den inte med användning av ytterligare fartygs trackers, såsom dextran eller lektin. Därför beslutade vi att bilden flytt leukocyter vid en våglängd på 840 nm, vilket ger det bästa förhållandet mellan GFP signalen och detaljerad men inte för ljust lever bakgrundsfluorescens.
Taget tillsammans, intrAVITAL TPLSM bildsystem infördes i denna studie kan tillämpas på ett brett utbud av leverspecifika intravital mikroskopi frågor. Med detta tillvägagångssätt är genomförbart med endast smärre modifieringar av kirurgiska ingrepp och vävnads iscensättning TPLSM avbildning i andra fasta organ såsom njurar, lever, urinblåsa, tarm eller bukspottkörteln, därför ger en mycket flexibel metod för att undersöka långsiktiga flyttande processer celler i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
