Abstract
Воспаления печени в ответ на повреждение является весьма динамический процесс с участием проникновение различных подтипов лейкоцитов, включая моноциты, нейтрофилы, Т-клеток подмножеств, В-клетки, природные клетки-киллеры (NK) и NKT-клеток. Прижизненные микроскопия печени для контроля миграции иммунных клеток является очень сложным из-за высоких требований в отношении подготовки образцов и фиксацию, оптическое разрешение и долгосрочное выживание животных. Тем не менее, динамика воспалительных процессов, а также исследований клеточных взаимодействий может обеспечить критическую информацию, чтобы лучше понять инициации, прогрессирования и регресс воспалительного заболевания печени. Таким образом, весьма чувствительны и надежный метод был создан для изучения миграции и клетка-клетка-взаимодействия различных иммунных клеток в печени мышей в течение длительных периодов времени (около 6 ч) по прижизненной двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) в сочетании с интенсивной терапии мониторинг.
ЛОР "> метод, предусмотренный включает в себя тщательная подготовка и стабильную фиксацию печени с минимальной возмущения органа; долгосрочный прижизненный визуализации с использованием многоцветной многофотонную микроскопии практически без фотовыцветания или фототоксических эффектов в течение периода времени до 6 часов, что позволяет отслеживать конкретных лейкоцитов подмножеств и стабильных условий формирования из-за обширных мониторинга мыши жизненно важных параметров и стабилизации кровообращения, температуры и газообмена.Для исследования лимфоцитов миграцию от воспаления печени CXCR6.gfp нокаут у мышей подвергали прижизненной визуализации печени под исходных условий и после острого и хронического повреждения печени, вызванного внутрибрюшинной инъекции (ов) четыреххлористого углерода (CCl 4).
CXCR6 является рецептор хемокинов экспрессируется на лимфоцитах, в основном на природные клетки-киллеры T (НКТ) -, естественных киллеров (NK) - и подмножеств Т-лимфоцитов, таких как CD4 Т-клеток, но также слизистой оболочки associально инвариантным (MAIT) Т-клетки 1. После миграционную картину и позиционирование CXCR6.gfp + иммунных клеток позволила детально заглянуть в их измененном поведении после повреждения печени и, следовательно, их возможного участия в прогрессировании заболевания.
Introduction
Визуализация клеток и клеточных функций в целых органов или даже целых организмов был большой интерес для более чем 50 лет, в том числе практически во всех частях тела 2. Таким образом, некоторые ранние исследования уже используются прижизненной визуализации печени 3,4. Тем не менее, существуют некоторые ограничения в курсе относительно долгосрочного стабильного изображений с высоким разрешением ткани печени.
Из-за анатомическом положении печени в тесном контакте с мембраной и желудочно-кишечного тракта 5, наиболее распространенной проблемой для микроскопического прижизненной визуализации это движение за счет дыхания и, в меньшей степени, перистальтические из желудочно-кишечного тракта 6. По сравнению с другими твердыми органов, хирургия печени является чрезвычайно сложным. Из-за плотной структуры микрососудов, хирургических манипуляций может привести к массовым поражением геморрагических, нарушение микроциркуляции 7, а также активацию резидента яmmune клетки, такие как клетки Купфера 8. Таким образом, механическая фиксация ткани, опубликованы в другом месте 6,9, скорее всего, вмешиваться в прижизненной визуализации микроскопии.
В здоровой печени, 10-15% от общего объема крови находится в пределах сосудистой печени, и орган получает около 25% от общего сердечного выброса 10, что делает орган очень чувствительны к изменениям в обращении (например, колебания артериального давления ). Таким образом, сбои в печеночного кровотока, обусловленная, например, напряжение сдвига, смещения, травмы чрезмерной обработки тканей или централизованного обращения приведет к искусственным изменениям в лейкоцитарной миграционного поведения, нарушение оксигенации печени и поэтому дальнейшего повреждения печени, поражающими печень иммунный ответ, а также как сохранение органов и общего времени жизни животного.
Ранние микроскопические исследования были основаны на прижизненных эпифлуоресцентной мимикроскопия, но некоторые технические ограничения, такие как фото отбеливания и низкой глубины проникновения ограничить использование этого метода для долгосрочного изображений печени 4,11,12. С развитием МФ микроскопии в 1990-х годах, ограничения фото отбеливания или глубины проникновения в основном решена, так как это новый метод был технически способна выполнять исследования изображений практически во всех органах в реальных жизненных ситуациях 13-15. Тем не менее, основные нерешенные проблемы в отношении визуализации печени были: движения дыхания, автофлуоресценции ткани печени, обеспечения неизменном кровоток в печени синусоид и особенно стабильное изображение в течение длительного периода нескольких часов 16.
Хотя некоторые исследования имя функции и миграцию различных лейкоцитов в печени 17, например, NKT-клетки 18-20, Т-клетки 21,22, макрофаги печени 23,24 или нейтрофилы 25, долгосрочные многофотонное мicroscopy изображений еще не было успешно установлено, задача еще более сложная у животных с острой или хронической болезни печени в связи с существующей повреждения и поэтому более высокая чувствительность к дальнейшему повреждению 26. Однако мониторинг миграционное поведение и функцию клеток лейкоцитов в печени в режиме реального времени позволяет новый взгляд в их конкретной роли в гомеостазе заболевания печени и 27.
CXCR6 хемокинов рецептор экспрессируется на несколько подмножеств лимфоцитов, в том числе естественных киллеров (NK) клеток, НКТ-клеток и некоторых популяций Т-клеток 18,28. Предыдущие исследования на мышах показали, что CXCR6 и его родственный лиганд CXCL16 может управлять патрулирование НКТ-клеток на синусоиды печени во время гомеостаза. Следовательно, использование мышей CXCR6.gfp (несущий детонации-ин зеленого флуоресцентного белка [GFP] в локусе CXCR6) был описан исследовать миграцию лимфоцитов в различных органах, таких как мозг 29а также печень 18,20, показав увеличилось проникновение CXCR6.gfp клеток на воспаление.
С помощью способа, представленной в данном исследовании можно было выполнить следующие процессы в течение длительного периода времени при стабилизированных условиях. Прижизненный процедура, основанная многофотонное разрешается изображений, который был хорошо воспроизводимым с минимальным возмущением животного и органа; оптимизирована для долгосрочного выживания животного расширенного мониторинга с последующим тщательным контролем дыхания и кровообращения; и очень гибкий и легко принять и для других паренхиматозных органах, таких как почки или селезенки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты были проведены в соответствии с немецким законодательством, регулирующим исследования на животных Вслед за «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных" (NIH публикации, 8-е издание, 2011) и Директива 2010/63 / ЕС по защите животных используется для научных целей (Официальный журнал Европейского Союза, 2010). Официальное разрешение было предоставлено из государственного ухода за животными и офисного использования (LANUV Северный Рейн-Вестфалия, Гельзенкирхен, Германия).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, которые могут быть исключены на короткий срок томографии (например, мгновенные снимки, 3-D стеки или также короткая продолжительность покадровой микроскопии), отмечены звездочкой (*), чтобы уменьшить время на подготовку и упростить хирургическое протокол. Изображений также может быть выполнена без существенного контроля и управления циркуляции при необходимости, однако, продолжительность жизни будет значительно снижена.
1. Микроскоп Настройка и перед операцией Подготовка (5-10 мильп)
- Переключить система на (микроскоп, мощность лаборатории, лазерной, грелку, климатической камере, веб-камеры, устройства шприц насоса, респиратор).
- Подключите O 2 питания к изофлурановой пара и установить изофлурановой уровень в 1,5% по объему (v / v), подключение к небольшой животных респиратор.
- За короткий срок визуализации, поддерживать анестезию с помощью изофлурана только после первоначального индукции IP анестезии (см шаг 2,2). Затем с помощью 2% по объему (V / V) изофлураном и сохранить время формирования изображения ниже 2 ч, чтобы гарантировать стабильную микроциркуляции печени.
- Набор дыхание до 120-140 дыхательных циклов / мин с объемом 150-200 мкл.
- Настройка этап мыши агарозы. Подготовьте 100 мл 3% (вес / объем) агарозы, заливки его в чашку (приблизительно 10 см х 15 см основание) под углом 40 °.
- Настройка хирургическое рабочее пространство сбора необходимых приборов. Для предотвращения микробной инфекции, дезинфекции инструментов, используя 1% -ный раствор Sekusept Forte S (9,9% вес / об), Глутарал 9,8% вес / об, Формальдегид в течение 5 мин до начала эксперимента (фиг.1А).
- Получить остальные компоненты: дезинфицирующее кожи (например, 10% -ный раствор повидона йода), печени (этап стеки и мост), раствора агарозы (3% (вес / объем) в PBS), шприцевой насос с 5% (вес / объем) раствора глюкозы (G-5), шприцевой насос с анестезирующего раствора I (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 0,5 мг / мл, фентанил 5 мкг / мл), ватные тампоны, н-бутил-2-Cyanoacrylat и 1x PBS. Положите в агарозном этап блюдо в инкубационной камере для нагрева.
2. трахеотомия (10-15 мин)
- Используйте C57BL / 6 мышей от в доме разведения весом 25-28 г. Дом мышей под конкретного патогена условиях в соответствии с руководящими принципами FELASA, в температуры и влажности окружающей среды под контролем с 12 ч света / 12 ч темноты. Разрешить животным свободный доступ к стандартной мыши диеты (Sniff стандартную диету грызунов) и воды вволю.
- Обезболить мыши, инициализацииционного внутрибрюшинно (IP) инъекции 250 мкл раствора анестетика II (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 1 мг / мл, бупренорфин 10 мкг / мл).
- * Для содержания в течение прижизненной визуализации, постоянно вводить обезболивающий раствор I путем непрерывной инъекции IP (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 0,5 мг / мл, фентанил 5 мкг / мл) с использованием устройства типа шприцевого насоса при скорости потока 0,2 мл / ч в Сочетание с ингаляционного изофлуран 0,5% по объему (об / об).
- Проверьте рефлексы после 5 мин (например, щепотка ног колодки щипцами), дезинфекции кожи для трахеотомии, начать подготовку, если мышь находится в хирургическом толерантного государства анестезии.
- Применить глаз защитный крем (например, Декспантенол 50 мг / г), чтобы предотвратить роговицы от высыхания (рис 1б).
- Зафиксируйте курсор по подготовке таблицы подвергая брюшной стороне с помощью клейкой ленты для конечностей; мягко затягивать шею, зафиксировать в этом положении., например, с помощью резиновой ленты подключили тО резцов.
- Лечить кожу и мех с использованием повидон раствор йода, путем применения дезинфицирующего средства с помощью ватного тампона.
- Выполните первоначальную разрез кожи (0,5-1 см длиной) прямо под подбородком (рис 1C)
- Осторожно рассекают соединительной ткани между слюнных желез (рис 1D).
- Осторожно разорвать открытую мышечную трубку, окружающую трахею (рис 1E, F).
- Поместите хирургическое нить под трахеи для последующего крепления вентиляционной трубки (рис 1G).
- Открыть трахеи с микро-ножницы между хрящевых колец, выполняющих Т-образный разрез (рис 1H)
- Поместите вентиляционную трубку в трахею через разрез (~ 0,5 см). Чтобы подтолкнуть трубку вперед, захватить хвостовой конец с небольшими анатомических щипцов и аккуратно продвигать трубку в трахею (рисунок 1I)
- Зафиксируйте трубу с хирургической нити (например, (фиг 1J, К).
- Упрощенный уплотнение с клеем ткани (например, н-бутил-2-Cyanoacrylat) (рис 1 л).
- Зафиксируйте трубку в головку с помощью клейкой ленты.
3. Laparatomy (15-20 мин)
- Поместите курсор на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение. Бритье живот, осторожно удалите волосы с поверхности кожи. Лечить бритая кожа и мех с помощью решения повидон йода.
- Выполните мелкой шкуркой сократить ниже грудины, используя хирургические ножницы (рис 2а). Продлить разрез в поперечном направлении ниже ребер с обеих сторон, прижигание все видимые кровеносные сосуды, чтобы предотвратить кровотечение.
- Тщательно выполнить небольшой надрез на белой линии ниже грудины, открывая брюшины (рис 2б). Продлить разрез с обеих сторон, используя cauterizвания, чтобы предотвратить кровотечение (рис 2С, D).
- Поместите курсор в агарозном стадии блюдо (рис 2Е). Поместите штабеля соответствующей высоте на обеих сторонах мыши (обычно 12-14) покровные стекла (фиг 2f).
- Поместите дыхания триггерный датчик под ними верхней части спины, чтобы синхронизировать микроскоп с дыханием. Активируйте спусковой механизм (рис 2G).
- Поместите хирургической нити (5-0) через грудины, чтобы убрать ребра (рис 2i).
- Аккуратно вырежьте связки, соединяющей печени и диафрагмы (серповидной связки), а также печени и желудочно-кишечного тракта с помощью изогнутых хирургические ножницы. Отрежьте серповидные связки до аорты (рис 2J).
4. Пример установки (10-15 мин)
- Поместите курсор на правой стороне под углом 45 ° для легкого доступа к большим доли печени.
- Добавить постановка мост ниже ребер, охватывающих брюшной полостиполости. Производство мост с помощью стандартного покровного стекла с помощью клейкой ленты покрытия для покрытия острых кромок (рис 2K).
- Поместите большой доли печени на сцене. Тщательно скольжения двойной шаровой стилуса зонда или мягкий шпатель ниже печени и удерживайте верхнюю часть органа, используя влажную ватным тампоном или влажной ткани. Поднимите лепесток на слайд и нежный сопротивление. Лоб может быть согнуты или сложить. Обеспечить дополнительную заботу, чтобы только нежным манипуляции печени (рис 2L).
- Поместите боковая, поддерживающие ставки, например, сваи малого скользит крышку (20 мм х 20 мм), примерно такого же высоте доли печени рядом с ним, чтобы поддержать покровное.
- Поместите большой покровное (24 мм х 50 мм) на доли печени. Убедитесь, что крышка скольжения ориентирована максимально горизонтально (рис 2М).
ПРИМЕЧАНИЕ: скольжения Крышка должна быть в контакте с тканью без сжимая его. Проверьте наличие видимых признаков нарушения кровотока (белый ткани). Если microcircавляет нарушается, добавить дальнейшей поддержки ставки. - * Место два независимых интраперитональные катетеры (рис 2N) для долгосрочного анестезии и G-5 приложений. Установка катетера в поперечном направлении в нижней части живота рядом задних конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: внутрибрюшинного катетеры могут быть самодельные путем подключения 27 G иглы с гибкой трубкой силикона (Рисунок 3). - * Закрепиться иглы с петлей 5-0 хирургической нити на кожу, чтобы избежать случайного перемещения.
- * Прикрепить шприца с анестезией раствором я катетера 1, определите скорость потока до 0,2 мл / ч; приложить шприцевой насос с G-5 катетера 2, установите скорость потока до 0,1 мл / ч.
5. Контроль мыши
- * Место ЭКГ электродов в передние и задние конечности (рис 4А).
- * Прикрепите трубку истечения СО 2 датчика уровня.
- Добавить внешнего датчика температуры, подключенных к тепловым панели (рис 4C).
6. Вложение и тканей Фиксация (5-10 мин)
- Подготовьте 100 мл 3% (вес / объем) агарозы в 1X PBS. Код для вставки печень, когда температура в 41 ° С, используя шприц 5 мл и 18 G иглы (рис 5а).
- Налейте оставшееся агарозы на покровное и вокруг мыши (фиг.5В, С). Подождите, пока агарозном полностью клейстеризованный.
- Удалите излишки агарозы с использованием шпателя Heidemann, подготовка достаточно viewfield большой, чтобы сканировать подготовленный доли печени (рис 5D, E).
7. изображений
- Трансфер мышь в микроскоп климатической камере.
- Добавить 50-100 мл 1x PBS (предварительно нагретый на 37 ° С).
- Обложка образца блюдо, чтобы предотвратить испарение (рис 5F).
- * Уменьшение вдыхании изофлуран до 0,5% по объему (об / об).
- * Начать мониторинг программного обеспечения, запись ЭКГ, частоту сердечных сокращений и выдоха CO 2.
- Начните изображений: открыть лаSER жалюзи, определить вид областях, представляющих интерес, определить верхнюю и нижнюю границу для Z-стеки, и начните запись промежутка времени. Отрегулируйте Z-стеки, если необходимо скорректировать Z-дрейф (напр., В связи с изменениями артериального давления и колебания температуры, рис (5G).
Примечание: после завершения периода формирования изображения, или если обращение или анестезии животных становится нестабильным, пожертвовать мышей путем смещени шейных позвонков (без пробуждения от анестезии).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проверки нашего прижизненный подход TPLSM, мы подвергли GFP / + мышей CXCR6 для прижизненной визуализации TPLSM. Мышей либо лечить качестве исходных управления или подвергают одной внутрибрюшинной инъекции четыреххлористого углерода (CCl 4), чтобы вызвать повреждение печени острый 20.
Видео последовательности были приняты в течение периода времени 2-5 ч, и клетки были прослежены в течение долгого времени из-за их зеленой флуоресценции. Чтобы показать общую клеточную подвижность, все треки, которые были обнаружены во время процедуры были построены в наложенные изображения (рис 6а). В то время как клетки под исходных условий показал, междугородной миграции вдоль синусоиды печени к центральной вене, 18 часа после CCl 4 ЛЕЧЕНИЯ + / GFP клетки CXCR6 показал уже частично нарушенные двигательные стереотипы. Хотя некоторые быстро движущихся клетки все еще присутствуют в синусоиды печени, несколько тематических областей были видны с клетками, которыеизменилось от случайного перехода на локальном сканировании, что свидетельствует о хемотаксиса ответ подбора клеток в области раны. Эффект был еще более выраженным после 36 часов, показывая почти полное арест CXCR6 + клеток практически без активной миграцией. В то время как в соответствии с исходными условиями большинство мигрирующих клеток было переменную скорость миграции со случайными изменения направления, CCl 4 обработанных животных показали, клетки, которые были медленно ползают, а также некоторые свободно подвижные клетки патрулирование синусоиды после 18 часов, но не после 36 ч. Использование цветных миграции треков, скорость Ячейка может быть визуализированы непосредственно оценить эффект лечения CCl 4. Нарушение миграции также видна в нормализованном дорожки схемы (фиг.6В), показывая, что 18 ч после CCl 4 количество междугородных отслеживает, а также средняя длина дорожки была заметно снижена, а после 36 ч не подвижные клетки не были обнаружены любые больше. В соответствии шIth этих результатов, сотовый объем, который описывает способность клетки свободно патрулировать сосудистую, уменьшилось с течением времени, что указывает на захват клеток 36 ч после обработки CCl 4 в месте повреждения гепатоцеллюлярной (фиг.6С).
Для выполнения миграционную поведение CXCR6 + / GFP клеток в печени более подробно, скорость миграции репрезентативных отдельных клеток наносили на график, чтобы визуализировать их уровень подвижности с течением времени. Мы и другие ранее описал несколько моделей отличается движения CXCR6 + / GFP клеток: активным случайным ползком с камнем в схеме прокатки, показывая фазы клеточного подвижности и временных покоя государств; направлены сотовой найма с клетками сканирования области интересов, но все еще способны к активному сканированию; Общая сотовой арест сопровождается иммунной 18,20 клеточной активации. В то время как мыши без лечения, главным образом, показали, клетки, которые были свободно Мотиле со скоростью до 15 мкм / сек, CXCR6 + / GFP клеток у мышей, получавших CCl 4 Отображается заметно снижается скорость миграции клеток и частичного ареста уже после 18 ч и полный миграционный арест после 36 ч (рис 7А). В соответствии с анализом одну ячейку, статистические данные всех клеток в последовательности показал уменьшение общей скорости миграции после CCl 4 лечения (рис 7В), который также был напоминал по средней скорости движения поездов (фиг.7С) и отслеживать максимальную скорость миграции (Рисунок 7D), показывая, что подход вполне подходит для описания различий в клеточной миграции и позиционирование на развития болезни печени.
Рисунок 1:. Трахеотомия мыши (А) Хирургический оборудование, используемое для подготовки. 1 стандартный скороговоркойп щипцы, 1x Semken щипцы, 1x Дюмон № 7 щипцы, Грефе пинцет (зубчатые, 2x прямо / 1x изогнутые), 2x Блэр ретракторы (4 направлениям (тупой)), дважды мяч стилуса зонда (например, амальгамы Burnisher 3PL), Heidemann шпатель HD2, держатель иглы (Mathieu или Хэлси), 1x небольшие хирургические ножницы (острый / тупой, 1xcurved, 1x прямые), микро-ножницы (например, Vännäs Весенние Ножницы), 1x зверек Cauter, ватные тампоны, глаз защитные Salve, хирургическое резьба, н-бутил-2-Cyanoacrylatglue. (B) глаза защищены с помощью глаз защитную мазь. (C) Начальная порезаться для подготовки трахеи. (D) Вскрытие соединительной ткани между подчелюстной слюнных желез. (Е) Экспозиция трахеи. (F) Препарирование мышечной ткани, окружающей трахею. (G) Размещение хирургической нити под трахеи для фиксации трубки. (H) Tracheаль разрез с помощью microscissors между верхними кольцами хряща. (I) Вставка вентиляционную трубу в трахею. (J) Размещение черепной хирургической нити, чтобы исправить трубки к коже. (К) двойной фиксации трубки. (I) Уплотнение хирургический разрез, используя н-бутил-2-Cyanoacrylat. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Laparatomy и печени препарат () Начальная разрез кожи, кровеносные сосуды прижигали, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение. (B) Открытие брюшины под грудиной. (C) Расширение брюшной Резка с использованием прижигания устройства. (D) Герметизация эпигастральной судов. (
Рисунок 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Внутрибрюшинное катетер 27 G иглы, связанные с гибкой силиконовой трубки.
Рисунок 4: Мониторинг мыши. () Размещение электродов ЭКГ (зеленый, красный, синий кабелей). Иглы для обнаружения ЭКГ помещают подкожно, как показано. (B) мониторирование ЭКГ (красный), выдоха CO 2 (синий) и частота сердечных сокращений (красный), показывающий долгосрочное развитие (слева) и фактическое измерение (справа). (C) с контролем температуры блока питания для контроля тепла площадку. Температура устанавливается на 36 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: вложение печени и изображений. () Вложение доли печени. 3% агарозы в PBS вводят в 41 ° С под покровным стеклом использованием 2 мл шприца с с 18G иглу. (В) Печень лопасть полностью встроен в агарозе, чтобы минимизировать артефакты движения. (C) Уплотнение брюшины с остальными агарозы, чтобы предотвратить обезвоживание. (Г) удаление агарозном покрытие микроскопа поле зрения после полной желатинизации. (E) Подготовка viewfield. F Регулировка Z-уровня и оценки образца кровотока с помощью световой микроскопии. (D) Крышка блюдо, чтобы предотвратить чрезмерное испарение. Крышка снимается в картине, чтобы показать установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия этой фигуры.
Рисунок 6:. Отслеживание CXCR6 GFP / + клеток при хроническом повреждения печени после CCl 4 инъекции Мышам вводили внутрибрюшинно 0,6 мл / кг CCl 4, растворенного в подсолнечном масле 18 ч или 36 ч до визуализации. В день эксперимента мышей подвергали прижизненной TPLSM, как описано. () Неподвижные изображения слежения клеток. Следы от всех временных точках были наложены, чтобы показать клеточную подвижность и смещение. Изображения были сделаны с использованием одного луча титан Сапфир лазер на 840 нм и TPLSM микроскопа. Области были отсканированы принимать 3-5 Z-стеки с глубиной проникновения 70 мкм с частотой дискретизации 30 секунд за один цикл сканирования. Следы были цветом, чтобы показать скорость миграции (светло-голубой: медленное перемещение или сидячие клетки; фиолетового: подвижные клетки). Шкала бары: 100 μ; М. (B) XY-диаграммы путей, нормированных для их происхождения с указанием трек направленность и длину дорожки (мкм). (C) Суммарный объем клеток из их происхождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: статистика Миграционные GFP / + клеток CXCR6 затем прижизненной TPLSM в ткани печени в начале и CCl 4 у мышей, получавших клетки анализировали на их скорости миграции патрулирование печени.. (А) представитель скорость отдельных клеток с последующим течением времени. Скорость измерялась в каждый момент времени, и график для каждого кадра в отдельности. Линии представляют отдельные клетки. Y-оси масштабируется в соответствии с максимальной скоростью миграции. (B) Санкт-atistical анализ A. Рамка определенных скоростях от всех клеток были сгруппированы и проанализированы в начале исследования и CCl 4 мышей, обработанных. (C) Средняя скорость трек в расчете на трассе и данных из всех треков были сгруппированы для анализа. (D) Максимальная скорость каждого трека построена и проанализирована. Все эксперименты проводились в группах 3 животных и результаты были подтверждены в двух независимых экспериментах. *** Р <0,001 (двусторонний непарный Стьюдента-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью нашего исследования было разработать максимально стандартизированные, стабильные и воспроизводимые метод прижизненной TPLSM визуализации печени. Прижизненные изображения в целом дал ценные сведения сотовой поведения в реальных условиях жизни после наведения и взаимодействия различных групп населения лейкоцитов в развитии, гомеостаза и болезни. Тем не менее, несколько сложным анатомическом положении печени, из-за которой дыхательной и перистальтический кишечного движение непосредственно передаются в печени, а также их высокой хрупкости по сравнению с другими твердыми органов наложены несколько проблем для стабильного долгосрочного прижизненной визуализации. За последние годы, многие экспериментальные исследования на мышах показали, высоко динамичный характер иммунной клеточной инфильтрацией в поврежденной печени 28, при этом основные взносы от резидента или проникновения моноцитов / макрофагов 30-32, нейтрофилы 33 или различные субпопуляций лимфоцитов 34,35. Тем не менее, мOST этих данных были получены из конечных точек анализа (например, многоцветная проточной цитометрии после умерщвления животных). До сих пор существуют только несколько исследований, описывающая динамику сотового трафика при воспалении печени с помощью многоцветной прижизненный изображений. Использование инвертированных микроскопов обходит необходимость фиксации и увлажнения печени благодаря твердой адгезии ткани на стекле снизу 24. Однако, поскольку многие многофотонные микроскопы строятся вертикально, систем визуализации, более сложные по подготовке и фиксации методы необходимы для стабилизации ткани на момент съемки. Как правило, на заказ постановка системы были описаны для тканей фиксации 6, 36,37, однако с этим крайне важно, чтобы проверить микроциркуляцию печени, поскольку даже минимальное давление на ткани влияет синусоидальный ток крови с еще более серьезными воздействия на больной печенью 38 ,
Таким образом, были отмечены следующие моменты объявленияодетый в настройках этого метода оптимизации результатов, полученных в естественных условиях TPLSM изображений: Повышение качества подготовки минимизированное образца возмущения и нарушения микроциркуляции за счет решения вопросов, связанных и увеличение выживаемости животных; Мониторинг интенсивной терапии и последующей адаптации анестезии, дыхания и стабилизации кровообращения усиливается выживания животных и сведены к минимуму физиологических артефактов, например, вызванных дисбалансом в рН крови. Контролируемое дыхание в сочетании с срабатывании изображений имеет важное значение для устранения артефактов движения из-за синхронизации микроскопа с дыхательных циклов. Вложение органа в агарозы, содержащих физиологические концентрации солей было выгодно, чтобы мягко фиксировать орган после подготовки без какой-либо дополнительной механической манипуляции и предотвратить также обезвоживание образца. Большинство протоколов, используемых для печени микроскопии обеспечивают лишь незначительный методы ГНА BLE, долгосрочные анестезия. Тем не менее, выживание животных может быть значительно повышена с протоколом анестезии, представленной здесь, так и в сочетании с мониторингом было достаточно, чтобы гарантировать выживание до 8 ч. Альтернативные способы в целом пригодны для визуализации процессов в течение периода времени до 3 часов, таких как нейтрофилов вторжения 39, но не имеют возможности изображения больше прочного процессы, такие как моноцитов или лимфоцитов вторжения 22 или даже пролиферации клеток 6. Понимание динамики набора, инфильтрации и сотовой взаимодействия при остром и хроническом воспалении печени может обеспечить более детальный анализ развития и прогрессирования заболевания печени. С помощью этого расширенного понимания иммунопатологии можно будет разработать методы лечения гораздо более изощренными в плане адресации клеток-мишеней, представляющих интерес, а не с помощью, например, неселективных иммуносупрессивных подходов.
ove_content "> Для решения позиционирования, переселение и взаимодействие лейкоцитов, высокое качество изображения необходимы для точного отслеживания 4D клеток в сосудистой печени и печеночной ткани 18,20,40.Метод, который мы обеспечиваем здесь можно применять, используя обычные лабораторные реагенты и оборудование, что делает его простая в обращении и экономически эффективным с минимальным возмущением образца. Для поддержания физиологических условий мыши для как можно дольше, необходимо точно отрегулировать объем дыхания и частоты для управления оксигенации и крови уровней СО 2. Хотя из-за непрерывной инфузии жидкостей в брюшной полости имеется по крайней мере предварительное питания для стабилизации измерения кровообращения, ЭКГ и частоты сердечных только позволит частичный контроль в отношении стабилизации кровообращения. При реализации прямого контроля артериального давления и центрального венозного Жидкость Применение вполне вероятно, что жизненно PARAMETERS могут быть стабилизированы даже больше, что привело к дальнейшему усилению стабильности и выживания.
Даже при строго контролируемых условиях, изображения животных, которые были подвергнуты моделей повреждения печени, обычно используемых в мышей, такие как ацетаминофен индуцированного поражения печени, CCl 4 индуцированного поражения печени или диетическая индуцированных жировая болезнь печени остается сложной. В связи с существенным функции печени при метаболическом государственного контроля и его центральное положение в циркуляции, изменения функциональности печени или микроциркуляции непосредственно влияет долгосрочная выживаемость животных, тем самым ограничивая возможность получить длинные TPLSM видео-последовательности в значительной степени поврежденные органы, например, с тяжелыми кровотечениями или уничтожены микрососудов. Кроме того, в сильно измененном микроанатомии печени, как в моделях с обширными некрозами, по-прежнему трудно учиться клетка-клетка-взаимодействия и местного обособления воспалительных клеточных агрегатов, потому что ни станdardized "контр-окрашивание" для анатомических структур (таких, как гематоксилин-окрашивания в обычной микроскопии или DAPI окрашивания в иммунофлюоресценции) доступен для прижизненной качества TPLSM.The полученных в процессе визуализации данных в дальнейшем, зависит от интенсивности маркировки клеток и микроскопическое настройки.
Существует несколько подходов для визуализации GFP + клеток в печени. Наибольшее флуоресценции с очень низкой фоновой флуоресценции получают от 900 до 920 нм длины волны возбуждения. Почти полная потеря фоне печени флуоресценции не позволяет исследовать расположение клеток в печени, если не используются дополнительные трекеры сосудов, такие как декстран или лектина. Поэтому, мы решили изображение мигрирующих лейкоцитов при длине волны 840 нм, давая наилучшее соотношение между GFP сигнала и подробной, но не слишком ярком фоне печени флуоресценции.
Взятые вместе, ВВЕДЕНИСистема формирования изображения неживого TPLSM введена в данном исследовании могут быть применены к широкому кругу из печени конкретных прижизненной микроскопии вопросы. При таком подходе, TPLSM изображений в других твердых органов, таких как почки, печень, мочевой пузырь, кишечник или поджелудочной железы возможна лишь с незначительными модификациями хирургических процедур и ткани постановки, тем самым обеспечивая гибкую подход, чтобы исследовать долгосрочные миграционные процессы клеток в VIVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
