Protocol
כל ניסויי העכבר נעשו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות (IACUC) של בית הספר לרפואה של LSU. כל המכשירים חייבים להיות autoclaved לפני הנתיחה.
1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולי שד עכבר
- להשתמש במודל עכבר שהונדס גנטי עם וירוס עכבר החלב גידול Polyoma התיכון T-Antigen (עכבר MMTV-PyMT-מהונדס), אשר באופן ספונטני לפתח גידולים כפי שתואר בעבר 6.
- להקריב עכברים עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית (איור 1 א).
- פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים. הצמד את העור כלפי מטה, כדי לאפשר גישה קלה לאיברים (איור 1).
- לבודד את הגידול בשד החלב ולשטוף עם פוספט סטרילי הקר שנאגרו (PBS) (pH 7.4) (איור 1 ג).
- העבר את הגידול לצלחת תרבות 10 ס"מ רקמות סטריליים וקוצצת אותו בסכין גילוח סטרילי ומספריים כ 1 מ"מ 3 חתיכות. יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימה למינרית סטרילי.
- דגירה רקמת גידול הקצוצה עם Collagenase מומס בתקשורת DMEM סרום ללא בריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר על כיסא נדנדה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ההשעיה רקמת גידול 3 דקות ב 200 x גרם.
הערה: הדגירה Collagenase חיונית לניתוק האנזימטית של הרקמה. - בטל supernatant ולשטוף את המשקע 3 פעמים עם PBS (pH 7.4) על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x גרם. לאחר לשטוף הסופי, למזוג supernatant.
- Resuspend רקמות עם 2 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן nutating. צנטריפוגה ההשעיה למשך 3 דקות ב XG 200 ולחזור על שוטף.
- Resuspend גלולה הרקמה במדיום גידול רגיל (DMEM, 10% FBS, 2X עט / סטרפטוקוקוס) על צלחת 10 ס"מ. שינויהתקשורת כל יום במשך 3 הימים הבאים. תרבות תאים עד מספר תא רצוי מתקבל.
הערה: כ 1x10 7 תאים יהיו מבודדת מהליך זה. מודלים אחרים החלב עכבר tumorigenesis, כגון MMTV-Neu, נותנים תשואה נמוכה יותר של תאים בהשוואה לMMTV-PyMT. בעת שימוש במודלים המייצרים תשואה נמוכה יותר, זה מועיל להתחיל עם תאי גידול והתרבות גדולים יותר.
2. עכבר ריאות הפקה לדמיין ריאות גרורה
- לפני מיצוי ריאות, להסיר את הכבד והסרעפת. לעקור את הצלעות מבלי להפריע לריאות.
- עם זוג נאה של מספריים, לפתוח את החלק העליון של קנה הנשימה שהוא קרוב יותר לוריד הצוואר.
- באמצעות קטטר, להזריק סוכן כגון 1 מיליליטר של Z-תיקון או דיו הודו דרך קנה הנשימה כדי למלא את הריאות (איור 2 א). להטביע את Z-לתקן ריאות בפרפין.
- דה-להכתים את הריאות הוזרקו דיו הודו בפתרון של Fekete(אלכוהול 100 מיליליטר 70%, 10 מיליליטר של 10% שנאגרו פורמלין, ו 5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית) במשך 5 דקות. הגדר גושים סרטניים באתרים משניים עם ≥ 0.5 מ"מ קוטר, לקבוע את הגושים כגרורות.
הערה: בשל חסימת הסמפונות וbronchiole על ידי הגידול, גושים סרטניים לא יכולים לספוג 15% דיו הודו, ובכך רקמת ריאה נורמלית תהיה בשחור, וגושי גידול יהיו בצבע לבן 7. זה יאפשר להדמיה של גושים בודדים גידול (איור 2).
3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים
- להקריב עכברים בהריון עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית.
- פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים ולבודד את העוברים מהרחם.
- היזהר שלא להפריע לעוברים בעת פתיחת העור.
- הסר את קרן הרחם ולשטוף אותם בSTE הקרלהרגיז PBS (pH 7.4).
- הפרד את העובר מהשליה שלה בזהירות רבה ועוברי מקום בצלחת 10 ס"מ המכילות קרח הקר PBS (pH 7.4).
- הסר את הראש, בכבד ובמעיים מן העובר ומניח את החלק שנותר בצלחת תרבית רקמה גם 12 המכילה PBS (pH 7.4).
- העבר את גוף העובר לעוד EDTA טריפסין המכיל 12 צלחת היטב ולחתוך לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ 3) באמצעות סכין גילוח סטרילי ומספריים. דגירה החומר הקצוץ עם 5 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- להשבית טריפסין על ידי הוספת 1 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) לעוברים הקצוצים. צנטריפוגה ההשעיה במהירות XG 200 במשך 10 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, resuspend גלולה עם 1 מיליליטר של מדיום DMEM החם ולהעביר את כל התוכן לצלחת 10 ס"מ המכילה FBS 10 מיליליטר של DMEM (עם 20% ו2X פניצילין / סטרפטומיצין ).
- לשנות הבינוני בכל יום ליומיים. תרבות התאים עד תא רצוימספר מושגת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלב התקדמות גידול שבלהקריב בעלי החיים תלויים במחקר המסוים והנחיות IACUC. באיור 1 א, C57BL / 6 עכבר בן 100 יום עם וירוס גידול עכבר החלב Polyoma התיכון T-Antigen (MMTV-PyMT) הוקרב בשלושה חודשים. העור נפתח מאזור פתח השופכה לצוואר עם המספריים והעור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לאיברים כפי שמוצגים באיור 1. זה אפשר גישה קלה לגידול שהושג באיור 1 ג. התאים הראשוניים המתקבלים מהגידולים הם דמיינו באיור 1D. מאז גנים רבים לתווך גרורות סרטן שד לריאות 1, חלצנו את הריאות (איור 2 א) ללמוד את התהליך גרורתי. הריאות היו מנופחת עם Z-תיקון ומוכתם בדיו הודו (איור 2) כדי להמחיש את הגושים הסרטניים. איור 3 מראה fibr העוברי של העכבר אובלסט מבודד מעוברי עכברי זן FVB.
איור 1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולים בשד. () נקבת עכבר בן 100 יום עם Polyoma התיכון T-Antigen (PyMT) הוקרב. (ב) העור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לגידול החלב. (ג) הגידול בשד נחתך מבעלי החיים . (ד) התאים הראשוניים המבודדים היו בתרבית בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). התמונות מציגות את התאים ביום 3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להעלות / 52,609 / 52609fig2.jpg "/>
איור 2. מיצוי ריאות עכבר כדי להמחיש גרורות ריאות. () הריאות נופחו עם Z-תיקון ו (ב) מוכתם בכתמי דיו הודו לדמיין גושים סרטניים (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. תאי איור 3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים MEF חולצו מעובר עכבר FVB (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא לבידוד תאים ראשוניים מגידול עכבר טרי. Lysates הוכן משיטה זו שימושי לחלבון, DNA וניתוח RNA. תאים סרטניים מהגידול השד הראשוני לעתים קרובות לשלוח גרורות למוח, הריאות ועצמות 1. כלול הוא טכניקה כדי לחלץ את הריאות לגילוי של גרורות. מכתים את הריאות עם כתם דיו יאפשר להדמיה של גושים סרטניים כפי שניתן לראות באיור 2. תיקון הריאות בפתרון Z-תיקון יאפשר לנו להפוך את הקטעים של ריאות, ואת הכתם עם נוגדנים המתאימים ללמוד מנגנונים גרורתי. כמו כן, נכלל הוא פרוטוקול לבידוד של fibroblasts העוברי של העכבר. זה שימושי להשוואת ביטוי גנים של תאי גידול הראשוניים עם פיברובלסטים העובריים באותו הסוג של בעלי החיים.
בהכנה של תאים וMEFs ראשוניים, השלב הקריטי ביותר הוא המעושה של החומר. ללא פירוט ראוי, loמספר תא w יושג. אם ספירת תאים נמוכה מושגת, עדיין יכול להיות אחרי פרוטוקול, אבל התאים צריכים להיות מתורבת לתקופה ארוכה יותר של זמן .. בחילוץ הריאות, כתמים וdestaining נכונים הוא חיוניים כדי לאפשר להדמיה גולה גידול. כדי לחלץ RNA / חלבון מריאות, זה יהיה טוב לשימוש ריאות שבלא כתם ומבולבל. עם זאת, ניתן לחלץ RNA מרקמות קבועות וכן 8.
מאז השלב גרורתי של סרטן השד מהווה את האיום הגדול ביותר לאדם המושפע 2, חשוב לדמיין את כל המרכיבים של יצירת גידולי שד. אתגר גדול בהבנת מנגנונים של התקדמות סרטן השד הוא הזמינות של דגמים שלסכם את ההתקדמות של המחלה 9. הבהרת המנגנונים המולקולריים של tumorigenesis שד וגרורות מושגות באמצעות מודלים של בעלי חיים, כגון עכברים 9, 10. הדרכים הנפוצות ביותר כדי לגרום לmousגידולי החלב דואר גנטית להנדס עכברים עם מראש סילוק מוטציות של אונקוגנים או מדכאי גידול, החדרת חומרים מסרטנים, והזרקת תאי סרטן פולשני מאוד 10-12. גידולים שהתקבלו לאחר מכן ניתן לנתח נוספים לביטוי גנים. למחקר סרטן השד, פרופיל ביטוי גנים הוא חשוב שכן הוא צופה תוצאה הקלינית של החולה 13.
מגבלות מסוימות קיימות עם מודל העכבר של לימוד tumorigenesis החלב. למרות שעכברים לשתף דמיון מולקולרי ופיזיולוגי עם בני אדם, שהם לא תמיד לשחזר את כל ההיבטים של מחלות בבני אדם 5. זה צריך להילקח בחשבון בעת שימוש בעכברים מהונדסים גנטי מסוימים. בסך הכל, מודלים עכבר מספקים דרך מציאותית יותר לנתח tumorigenesis החלב עכבר מעל דגמים הנוכחיים אחרים כגון תרבית רקמה וגידולים אנושיים מבודדים. יחדיו, פרוטוקול זה מאפשר לחקירה נוספת של היבטים שוניםשל tumorigenesis שד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים לא גילויים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
