Protocol
सभी माउस प्रयोगों मेडिसिन के LSU के स्कूल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया। सभी उपकरणों विच्छेदन करने से पहले autoclaved किया जाना चाहिए।
माउस स्तन ट्यूमर से प्राथमिक कोशिकाओं की 1. तैयारी
- आनुवंशिक रूप से पहले से 6 वर्णित के रूप में अनायास ट्यूमर विकसित जो माउस स्तन ट्यूमर वायरस Polyoma मध्य टी एंटीजन (MMTV-PyMT ट्रांसजेनिक माउस), इंजीनियर के साथ किया गया था कि एक माउस मॉडल का प्रयोग करें।
- Isoflurane (99.9%) के साथ चूहों बलिदान और एक बाँझ वातावरण (चित्रा 1 ए) सुनिश्चित करने के लिए 75% इथेनॉल स्प्रे।
- कैंची से गर्दन को मूत्रमार्ग छिद्र के क्षेत्र से त्वचा को खोलें। अंगों (चित्रा 1 बी) के लिए आसान पहुँच अनुमति देने के लिए त्वचा के नीचे पिन।
- स्तन स्तन ट्यूमर अलग करने और ठंड बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (पीएच 7.4) (चित्रा 1C) से धो लें।
- ट्यूमर स्थानांतरणएक बाँझ 10cm टिशू कल्चर प्लेट लगभग 1 मिमी 3 टुकड़े करने के लिए एक बाँझ धार और कैंची से काट और। बाद के चरणों का एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक घुमाव पर 1mg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में सीरम मुक्त DMEM मीडिया में भंग Collagenase के साथ कटा हुआ ट्यूमर के ऊतक सेते हैं। एक्स जी 200 पर 3 मिनट के लिए ट्यूमर के ऊतक निलंबन अपकेंद्रित्र।
नोट: Collagenase ऊष्मायन ऊतक के enzymatic हदबंदी के लिए आवश्यक है। - सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 200 x जी पर 3 मिनट के लिए centrifuging द्वारा पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ वेग 3 बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला छानना।
- Nutating जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ ऊतक Resuspend। 200 XG पर 3 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र और washes दोहराएँ।
- एक 10cm थाली पर सामान्य विकास मध्यम (DMEM, 10% FBS, 2X कलम / स्ट्रेप) में ऊतक गोली Resuspend। परिवर्तनमीडिया अगले 3 दिनों के लिए हर दिन है। वांछित सेल नंबर तक संस्कृति कोशिकाओं प्राप्त की है।
नोट: लगभग 1x10 7 कोशिकाओं को इस प्रक्रिया से अलग किया जाएगा। MMTV-PyMT की तुलना में जब इस तरह के MMTV-Neu के रूप में अन्य माउस स्तन tumorigenesis के मॉडल, कोशिकाओं की कम उपज दे। एक कम उपज है कि उत्पादन मॉडल का उपयोग करते हैं, यह अब एक बड़ा ट्यूमर और संस्कृति कोशिकाओं के साथ शुरू करने के लिए फायदेमंद है।
2. माउस फेफड़ों निकालना फेफड़े मेटास्टेसिस कल्पना करने के लिए
- फेफड़ों की निकासी के लिए पहले, जिगर और डायाफ्राम को हटा दें। फेफड़ों के बिना परेशान पसलियों हटाना।
- कैंची की एक अच्छी जोड़ी के साथ, गले नस के करीब है जो श्वासनली का ऊपरी हिस्सा खुला।
- एक कैथेटर का उपयोग करना, फेफड़ों (2A चित्रा) को भरने के लिए श्वासनली से जेड-ठीक है या भारत स्याही की तरह के रूप में 1 मिलीलीटर एक एजेंट इंजेक्षन। एम्बेड आयल में फेफड़ों जेड तय कर लो।
- Fekete के समाधान में भारत स्याही के साथ इंजेक्शन फेफड़ों डी-दाग(100 मिलीलीटर 70% शराब, 10% बफर formalin के 10 एमएल, और हिमनदों एसिटिक एसिड के 5 एमएल) 5 मिनट के लिए। व्यास में एक ≥ 0.5 मिमी के साथ माध्यमिक स्थलों पर ट्यूमर पिंड को परिभाषित मेटास्टेसिस के रूप में पिंड निर्धारित करते हैं।
नोट: ट्यूमर से ब्रांकाई और bronchiole रुकावट, ट्यूमर पिंड 15% भारत स्याही को अवशोषित नहीं कर सकते हैं, और इस तरह सामान्य फेफड़े के ऊतकों काले रंग में हो जाएगा, और ट्यूमर पिंड सफेद रंग 7 में होगा कारण। इस व्यक्ति ट्यूमर पिंड (चित्रा 2 बी) के दृश्य की अनुमति देगा।
माउस भ्रूण से माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts की तैयारी 3.
- Isoflurane (99.9%) के साथ गर्भवती चूहों बलिदान और एक बाँझ वातावरण सुनिश्चित करने के लिए 75% इथेनॉल स्प्रे।
- कैंची से गर्दन को मूत्रमार्ग छिद्र के क्षेत्र से त्वचा खोलें और गर्भाशय से भ्रूण को अलग।
- त्वचा को खोलते समय भ्रूण परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- गर्भाशय सींग निकालें और ठंड काएं में उन्हें कुल्लापीबीएस (7.4 पीएच) चिढ़ाना।
- बर्फ के ठंडे पीबीएस (7.4 पीएच) युक्त एक 10cm थाली में इसकी बहुत ध्यान से नाल और जगह भ्रूण से भ्रूण अलग करें।
- भ्रूण से सिर, जिगर और पेट निकालें और पीबीएस (7.4 पीएच) युक्त एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में शेष भाग जगह है।
- एक और 12 अच्छी तरह से थाली युक्त trypsin EDTA के लिए भ्रूण शरीर स्थानांतरण और एक बाँझ धार और कैंची का उपयोग छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी 3) में कटौती। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए trypsin EDTA के 5 एमएल के साथ कटा सामग्री सेते हैं।
- कटा हुआ भ्रूण को 1 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफ बी एस) को जोड़कर trypsin निष्क्रिय। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 200 XG गति से निलंबन, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने गर्म DMEM माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend और 10 DMEM के मिलीलीटर के साथ (20% FBS और 2X पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एक 10cm पकवान करने के लिए सभी सामग्री को स्थानांतरित )।
- दो दिनों के लिए मध्यम हर दिन बदलते हैं। संस्कृति वांछित सेल जब तक कोशिकाओंनंबर उपलब्ध हो जाता है।
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Representative Results
पशु बलि के लिए, जिस पर ट्यूमर प्रगति मंच विशेष रूप से अध्ययन और IACUC दिशा निर्देशों पर निर्भर करता है। चित्रा 1 ए, माउस स्तन ट्यूमर वायरस Polyoma मध्य टी एंटीजन (MMTV-PyMT) के साथ एक 100 दिन पुराने C57BL 6 / माउस में तीन महीने में बलिदान था। त्वचा कैंची से गर्दन को मूत्रमार्ग छिद्र के क्षेत्र से खोला गया था और त्वचा चित्रा 1 बी के रूप में दिखाया अंगों के लिए आसान पहुँच की अनुमति देने के लिए नीचे टिकी थी। यह आंकड़ा 1 सी में प्राप्त हुई थी कि ट्यूमर के लिए आसान पहुँच की अनुमति दी। ट्यूमर से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं चित्रा -1 में कल्पना कर रहे हैं। कई जीनों फेफड़ों के 1 करने के लिए स्तन कैंसर मेटास्टेसिस मध्यस्थता के बाद से, हम मेटास्टैटिक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए फेफड़ों (2A चित्रा) निकाली गई। फेफड़ों जेड ठीक से फुलाया और ट्यूमर पिंड कल्पना करने के लिए भारत स्याही (चित्रा 2 बी) के साथ सना हुआ था। 3 चित्रा माउस भ्रूण fibr से पता चलता है FVB तनाव माउस भ्रूण से अलग ओब्लास्ट्स।
स्तन ट्यूमर से प्राथमिक कोशिकाओं की 1. तैयारी चित्रा। (ए) Polyoma मध्य टी एंटीजन (PyMT) के साथ एक 100 दिन पुराने महिला माउस का बलिदान किया गया था। (बी) त्वचा स्तन ट्यूमर के लिए आसान पहुँच की अनुमति देने के लिए नीचे टिकी थी। (सी) स्तन ट्यूमर जानवर से कट गया था । (: 100 माइक्रोन पैमाने पर पट्टी) (डी) पृथक प्राथमिक कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (DMEM) में सुसंस्कृत थे। छवियों दिन 3 पर कोशिकाओं को प्रदर्शित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2. माउस फेफड़ों निकासी फेफड़ों मेटास्टेसिस कल्पना करने के लिए। (पैमाने पर पट्टी: 500 माइक्रोन) (ए) फेफड़ों जेड-ठीक है और ट्यूमर पिंड कल्पना करने के लिए भारत स्याही के साथ दाग (बी) के साथ फुलाया गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
। माउस भ्रूण से माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts की तैयारी चित्रा 3. MEF कोशिकाओं को एक FVB माउस भ्रूण (पैमाने पर पट्टी: 100 माइक्रोन) से निकाले गए थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल एक ताजा माउस ट्यूमर से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए है। इस विधि से तैयार lysates प्रोटीन, डीएनए और आरएनए के विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं। प्राथमिक स्तन ट्यूमर से कैंसर कोशिकाओं अक्सर मस्तिष्क, फेफड़े और हड्डी करने के लिए 1 metastasize। शामिल मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए फेफड़ों को निकालने के लिए एक तकनीक है। चित्रा 2B के रूप में देखा एक स्याही दाग के साथ फेफड़ों धुंधला ट्यूमर पिंड के दृश्य के लिए अनुमति देगा। जेड-ठीक समाधान में फेफड़ों फिक्सिंग हमें फेफड़ों के कुछ वर्गों में बना है, और मेटास्टैटिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं कि एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए अनुमति देगा। इसके अलावा माउस भ्रूण fibroblasts के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है शामिल थे। यह वही जानवर प्रकार में भ्रूण तंतुप्रसू के साथ प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति की तुलना के लिए उपयोगी है।
प्राथमिक कोशिकाओं और MEFs की तैयारी में, सबसे महत्वपूर्ण कदम सामग्री की क़ीमा बनाने की है। लो, उचित टूटने के बिनाडब्ल्यू सेल नंबर हासिल किया जाएगा। एक कम सेल गिनती हासिल की है, तो प्रोटोकॉल अभी भी पीछा किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं फेफड़ों के निष्कर्षण में .. समय की एक लंबी अवधि के लिए संवर्धित करने की आवश्यकता होगी, उचित धुंधला और destaining ट्यूमर गुत्थी दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। फेफड़ों से शाही सेना / प्रोटीन निकालने के लिए, यह बेदाग और unfixed हैं कि फेफड़ों का उपयोग करने के लिए अच्छा होगा। हालांकि, आरएनए तय ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से 8 से निकाला जा सकता है।
स्तन कैंसर के मेटास्टेटिक चरण प्रभावित व्यक्ति 2 के लिए सबसे बड़ा खतरा बना हुआ है, यह स्तन tumorigenesis के सभी घटकों कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्तन कैंसर की प्रगति के तंत्र को समझने में एक बड़ी चुनौती रोग 9 की प्रगति पुनरावृत्ति कि मॉडल की उपलब्धता है। स्तन tumorigenesis और मेटास्टेसिस के आणविक तंत्र की व्याख्या इस तरह के चूहों 9, 10, के रूप में पशु मॉडल का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं। सबसे आम तरीके समझौता ज्ञापनों प्रेरित करने के लिएई स्तन ट्यूमर आनुवंशिक रूप से, ओंकोजीन या ट्यूमर शामक का म्यूटेशन पूर्व निपटान कैंसरकारी शुरू करने, और अत्यधिक आक्रामक कैंसर की कोशिकाओं को 10-12 इंजेक्शन लगाने के साथ चूहों इंजीनियर हैं। प्राप्त ट्यूमर तो आगे जीन की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यह मरीज 13 के नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी की है के बाद से स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए, जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा महत्वपूर्ण है।
कुछ सीमाएं स्तन tumorigenesis का अध्ययन करने के माउस मॉडल के साथ मौजूद हैं। चूहों मनुष्यों के साथ आणविक और शारीरिक समानता का हिस्सा हैं, वे हमेशा मानव रोगों 5 के सभी पहलुओं पुनरावृत्ति नहीं है। कुछ अनुवांशिक इंजीनियर चूहों का उपयोग करते समय यह ध्यान में रखा जाना चाहिए। कुल मिलाकर, माउस मॉडल ऐसे टिशू कल्चर और पृथक मानव ट्यूमर के रूप में अन्य मौजूद मॉडल पर माउस स्तन tumorigenesis के विश्लेषण करने के लिए एक और अधिक यथार्थवादी तरीका प्रदान करते हैं। साथ में ले ली, इस प्रोटोकॉल के विभिन्न पहलुओं की आगे की जांच के लिए अनुमति देता हैस्तन tumorigenesis की।
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Disclosures
लेखकों कोई खुलासे कर सकते है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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