Protocol
所有的小鼠实验均按照批准的医学LSU学校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议完成。所有仪器之前必须清扫高压灭菌。
从小鼠乳腺肿瘤1.准备原代细胞
- 使用已遗传工程与小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤中的T抗原（MMTV-PyMT转基因小鼠），其自发地产生肿瘤如前所述6小鼠模型。
- 牺牲小鼠用异氟醚（99.9％）和喷75％的乙醇，以确保一无菌环境（ 图1A）。
- 打开从尿道口与剪刀颈部的区域中的皮肤。引脚上的皮朝下，以方便获取器官（ 图1B）。
- 隔离乳腺乳房肿瘤，并用冷的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）中（ 图1C）。
- 转移的肿瘤无菌10厘米组织培养板和用无菌刀片和剪刀砍它到约1mm 3件。随后的步骤应在无菌层流罩下进行。
- 孵育切碎的肿瘤组织与胶原酶溶解在无血清DMEM培养基以1mg / ml的终浓度上的摇杆2小时，在37℃。离心肿瘤组织的悬浮液3分钟，在200×g下。
注：胶原酶孵育对于组织酶解必不可少。 - 弃上清，用PBS（pH7.4）中离心3分钟，在200×g下洗涤沉淀物3次。最后一次洗涤后，倒出上清液。
- 悬浮用2ml胰蛋白酶的EDTA 5分钟的组织，在37℃，同时章动。离心该悬浮液3分钟，在200×g离心并重复洗涤。
- 重悬组织沉淀在正常生长培养基（DMEM，10％FBS，2X青霉素/链霉素）到10cm的板。变化每天在接下来的3天的媒体。培养细胞直到所需的细胞数量被获得。
注：约合1×10 7细胞会从这个过程中分离出来。其他小鼠乳腺肿瘤模型，如MMTV-NEU，相比MMTV-PyMT给细胞的产量较低。当使用产生较低产量模型，它是有益的开始与一个较大的肿瘤和培养细胞更长。
2.小鼠肺提取形象化肺转移
- 之前肺提取，取出肝脏和隔膜。去除肋，而不会干扰肺部。
- 用细剪刀，打开更靠近颈静脉气管的上部。
- 使用导管，经气管注射的试剂如1毫升Z-fix或印度油墨的填补肺（ 图2A）。嵌入的石蜡Z-修复肺部。
- 德在染色菲克特的解决方案注入墨汁肺（100毫升70％的乙醇，将10毫升的10％缓冲的福尔马林和5ml冰醋酸）中5分钟。限定肿瘤结节在辅助站点与≥直径0.5mm，确定结节为转移。
注：由于支气管和细支气管阻塞的肿瘤，肿瘤结节不能吸收15％印油墨，因而正常肺组织将是黑白的，而肿瘤结节会以白色为主色调7。这将允许个体肿瘤结节（ 图2B）的可视化。
3.从小鼠胚胎准备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）
- 牺牲孕鼠用异氟烷（99.9％）和喷75％的乙醇，以确保一无菌环境。
- 打开从尿道口与剪刀颈部的区域中的皮肤和分离从子宫的胚胎。
- 要小心，不要打开皮肤的时候打扰胚胎。
- 取出子宫角和冲洗他们在寒冷的STE激怒的PBS（pH 7.4）中。
- 在含有冰冷的PBS（pH7.4）中10厘米板分离其胎盘非常仔细地和地方的胚胎的胚胎。
- 除去头，肝脏和肠从胚胎，并将其余部分在含有PBS（pH7.4）中在12孔组织培养板。
- 胚体转移到另一12孔板中含有胰蛋白酶EDTA和切成使用无菌刀片和剪刀小块（约1 立方毫米）。孵化用5ml胰蛋白酶的EDTA切碎材料5分钟，在37℃。
- 加入1ml胎牛血清（FBS），以短切胚胎灭活胰蛋白酶。离心悬浮液，在200×g离心速度为10分钟，小心取出上清液，重悬沉淀用1毫升温的DMEM培养基和所有的内容传送到10cm的培养皿含有10ml的DMEM（20％FBS和2X青霉素/链霉素）。
- 每一天两天的改变介质。培养细胞，直到所需的细胞号为止。
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Representative Results
肿瘤进展的阶段，在该牺牲动物取决于特定研究和IACUC准则。在图1A中，100日龄C57BL / 6小鼠用小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤中的T抗原（MMTV-PyMT）被处死三个月。皮肤从尿道口的区域中打开与剪刀的颈部和皮肤被牵制，以允许如图1B容易获得器官。这使得容易获得图1C中得到的肿瘤。从肿瘤中获得的原代细胞可视化在图1D。因为许多基因介导的乳腺癌转移到肺1中，我们所提取的肺（ 图2A）来研究转移过程。肺是用充气Z-修复和沾上墨汁（ 图2B），以可视化的肿瘤结节。 图3显示了小鼠胚胎FIBR从州应变FVB小鼠胚胎中分离。
从图乳腺肿瘤1.准备原代细胞。 （A）A 100日龄的雌性小鼠与多瘤中间T抗原（PyMT）被处死。（二）皮肤被固定下来，以方便进入乳腺肿瘤。（C）乳房肿瘤是从动物切（D）的分离的初级细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清和抗生素的培养（比例尺：100μM）。图像显示细胞3天，请点击此处查看该图的放大版本。
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图2.小鼠肺提取形象化肺转移。 （一）肺膨胀是与Z-修复和（B）沾上墨汁，以可视化的肿瘤结节（比例尺：500微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.准备从小鼠胚胎小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）MEF细胞从FVB小鼠胚胎（比例尺：100微米）提取。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议是用于从新鲜小鼠肿瘤中分离的原代细胞。从这个方法制备的裂解物是蛋白质，DNA和RNA分析是有用的。从原发性乳腺肿瘤的癌细胞往往转移到脑，肺和骨骼1。包括的是一种技术，以提取肺检测转移。染色的肺用墨汁染色将使肿瘤结节的可视化， 如图2B所示。在固定Z-修复解决方案肺部将使我们能够使肺部切片，染色并用恰当的研究转移机制的抗体。还包括的是一个协议的小鼠胚胎成纤维细胞的分离。这是原发肿瘤细胞的基因表达与同一动物类型的胚胎成纤维细胞进行比较是有用的。
在原代细胞和MEF中的制备中，最关键的步骤是材料的切碎。如果没有适当的细分，卤味瓦特细胞数目将得以实现。如果一个低细胞计数实现的，协议仍可以遵循，但细胞将需要培养的时间更长的时间。在肺提取，适当的染色和脱色至关重要，以允许肿瘤结节可视化。提取肺RNA /蛋白质，这将是很好用的肺是未染色的和不固定的。然而，RNA可以提取从固定的组织，以及8。
自乳腺癌的转移期构成为受影响的个体2的最大威胁，它以可视化乳房肿瘤发生的所有组件是很重要的。在了解乳腺癌发展机制的一个主要挑战就是那概括该病9的进展车型的可用性。乳房肿瘤发生和转移的分子机制的阐明通过使用动物模型来实现，如小鼠9，10，最常见的方法来诱导鳞状Ë乳腺肿瘤的基因工程小鼠的预处置癌基因或抑癌基因突变，致癌物质引入，以及注射高度侵袭性肿瘤细胞10-12。得到的肿瘤可随后用于基因表达进行进一步分析。对于乳腺癌的研究，基因表达分析是重要的，因为它预言的病人13的临床结果。
一些局限性研究乳腺肿瘤的小鼠模型存在。虽然小鼠与人类共享的分子和生理相似之处，它们并不总是概括人类疾病5的所有方面。这应该使用某些遗传工程小鼠时予以考虑。总体来说，小鼠模型提供了一个更现实的方法来分析小鼠乳腺肿瘤的发生比其他车型存在诸如组织培养和分离的人类肿瘤。综合来看，该协议允许不同方面的进一步调查乳腺肿瘤的发生。
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Disclosures
作者没有披露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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