Protocol
Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) van LSU School of Medicine goedgekeurd. Alle instrumenten moeten voorafgaand aan de dissectie worden geautoclaveerd.
1. Voorbereiding van de primaire cellen van Mouse borsttumoren
- Gebruik een muismodel dat genetisch werd ontworpen met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT-transgene muis), die spontaan ontwikkelen tumoren zoals eerder beschreven 6.
- Offer muizen met isofluraan (99,9%) en spuit 75% ethanol in een steriele omgeving (figuur 1A) waarborgen.
- Open de huid ter plaatse van de urethrale opening aan de hals met een schaar. Speld de huid naar een gemakkelijke toegang tot organen (Figuur 1B) mogelijk te maken.
- Isoleer de borstklier tumor en was met koude steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) (Figuur 1C).
- Breng de tumoreen steriele 10cm weefselkweek plaat en hak het met een steriel scheermesje en schaar om ongeveer 1 mm 3 stuks. Daaropvolgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroming kap.
- Incubeer de gehakte tumorweefsel met collagenase opgelost in serumvrij DMEM medium bij een eindconcentratie van 1 mg / ml op een rocker gedurende 2 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de suspensie tumorweefsel gedurende 3 minuten bij 200 x g.
OPMERKING: De collagenase incubatie essentieel voor enzymatische dissociatie van het weefsel. - Verwijder het supernatant en was het neerslag 3 maal met PBS (pH 7,4) door centrifugeren gedurende 3 min bij 200 x g. Na de laatste wasbeurt, giet het supernatant.
- Resuspendeer het weefsel met 2 ml trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C onder Tuimelschijfmeter. Centrifugeer de schorsing gedurende 3 min bij 200 xg en herhaal de wasbeurten.
- Resuspendeer het weefsel pellet in normale groei medium (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) op een 10cm plaat. Veranderingde media dagelijks gedurende de volgende 3 dagen. Kweekcellen tot het gewenste aantal cellen is verkregen.
OPMERKING: Ongeveer 1x10 7 cellen worden geïsoleerd van deze procedure. Andere muizen mammaire tumorigenese modellen, zoals MMTV-Neu, geven lagere opbrengst aan cellen in vergelijking met MMTV-PyMT. Bij gebruik van modellen met een lagere opbrengst te produceren, is het nuttig om te beginnen met een groter tumor en kweekcellen langer.
2. Mouse Lung Extraction te visualiseren longmetastase
- Voorafgaand aan long extractie, verwijder de lever en het middenrif. Verdrijven de ribben zonder de longen.
- Met een fijne schaar, opent het bovenste gedeelte van de trachea die dichter bij de halsader.
- Met behulp van een catheter, injecteert een middel zoals 1 ml Z-fix en India inkt door de luchtpijp in de longen (figuur 2A) vullen. Het insluiten Z-fix Longen in paraffine.
- De-vlek de longen geïnjecteerd met Oost-Indische inkt in Fekete's oplossing(100 ml 70% alcohol, 10 ml 10% gebufferde formaline en 5 ml ijsazijn) gedurende 5 min. Definieer tumor knobbeltjes op secundaire locaties met een ≥ 0,5 mm in diameter, bepalen de knobbeltjes als metastase.
LET OP: Door de bronchiën en bronchiole blokkade door de tumor, kunnen tumoren niet absorberen 15% Oost-Indische inkt, en dus normaal longweefsel zal zijn in het zwart, en tumoren zal worden in witte kleur 7. Dit visualisatie van afzonderlijke tumoren (figuur 2B) toe.
3. Voorbereiden van muis embryonale fibroblasten (MEF) van muizenembryo's
- Offer zwangere muizen met isofluraan (99,9%) en spuit 75% ethanol om een steriele omgeving te verzekeren.
- Open de huid ter plaatse van de urethrale opening aan de hals met een schaar en isoleer de embryo's uit de uterus.
- Wees voorzichtig niet om de embryo's te storen bij het openen van de huid.
- Verwijder de baarmoederhoorns en spoel ze in koud steRILE PBS (pH 7,4).
- Scheid het embryo uit de placenta zeer zorgvuldig en plaats embryo's in een 10cm plaat met ijskoud PBS (pH 7,4).
- Verwijder de kop, lever en darm van het embryo en plaats het resterende deel in een 12 well weefselkweek plaat met PBS (pH 7,4).
- Breng de embryo lichaam een 12 wells plaat met trypsine EDTA en in kleine stukjes (~ 1 mm 3) met een steriele scheermesje en schaar. Incubeer het gehakselde materiaal met 5 ml trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Inactiveer trypsine door toevoeging van 1 ml foetaal runderserum (FBS) met de gehakte embryo. Centrifugeer de suspensie bij 200 xg snelheid gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 1 ml warm DMEM medium geheel overgaat de inhoudsopgave voor een 10cm schotel met 10 ml DMEM (met 20% FBS en 2X penicilline / streptomycine ).
- Verander het medium elke dag gedurende twee dagen. Kweken van de cellen tot de gewenste cellnummer bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De tumorprogressie moment waarop het dier offeren hangt af van de studie en IACUC richtlijnen. In figuur 1A, 100 dagen oud C57BL / 6 muis met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT) werd geofferd op drie maanden. De huid werd geopend uit het gebied van de urethra opening aan de hals van de schaar en de huid was vastgepind om gemakkelijke toegang tot organen figuur 1B laten. Hierdoor konden gemakkelijk toegang tot de tumor die werd verkregen in figuur 1C. De uit de primaire tumor cellen worden gevisualiseerd in figuur 1D. Aangezien veel genen mediëren borstkankermetastasen aan de long 1, we geëxtraheerd de longen (figuur 2A) het metastatische proces te bestuderen. De long werd opgeblazen met Z-fix en gekleurd met Oost-Indische inkt (Figuur 2B) om de tumoren te visualiseren. Figuur 3 toont muis embryonale fibr oblasten geïsoleerd van FVB stam muis embryo's.
Figuur 1. Voorbereiding van de primaire cellen van borsttumoren. (A) Een 100 dagen oude vrouwelijke muis met de Polyoma Midden T-antigeen (PyMT) werd geofferd. (B) De huid werd vastgepind op een gemakkelijke toegang tot de borsttumor mogelijk te maken. (C) De borst tumor werd gesneden uit het dier . (D) De geïsoleerde primaire cellen werden gekweekt in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum en antibiotica (schaalbalk: 100 uM). De beelden tonen de cellen op dag 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
upload / 52.609 / 52609fig2.jpg "/>
Figuur 2. muizenlong extractie met longmetastasen visualiseren. (A) De long werd opgeblazen met Z-fix en (B) gekleurd met Oost-Indische inkt om tumoren te visualiseren (schaal bar: 500 uM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 3. Het voorbereiden van muis embryonale fibroblasten (MEF) van muizenembryo's MEF cellen werden geëxtraheerd uit een FVB muizenembryo (schaal bar: 100 uM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is voor het isoleren van primaire cellen van een nieuwe muis tumor. Lysaten bereid uit deze werkwijze bruikbaar voor eiwitten, DNA en RNA-analyse. Kankercellen uit de primaire borsttumor metastaseren vaak naar de hersenen, longen en botten 1. Inbegrepen is een techniek om de long voor de detectie van metastasen extraheren. Kleuring van de long met een inktvlek zal voor de visualisatie van tumoren zoals getoond in figuur 2B. Vaststelling van de longen in Z-fix oplossing zal ons toelaten om delen van de longen te maken en vlekken met antilichamen die geschikt zijn voor metastatische mechanismen te bestuderen zijn. Ook inbegrepen is een protocol voor de isolatie van de muis embryonale fibroblasten. Dit is nuttig voor het vergelijken van de genexpressie van de primaire tumorcellen met embryonale fibroblast dezelfde diersoort.
Bij de bereiding van primaire cellen en MEFs, de meest kritische stap is het hakken van het materiaal. Zonder de juiste afbraak, low aantal cellen zal worden bereikt. Als een lage celtelling wordt bereikt, kan protocol nog volgen, maar de cellen moeten worden gekweekt gedurende een langere periode .. In de long extractie juiste kleuren en ontkleuren essentieel om voor tumor nodule visualisatie. Om RNA / eiwit uit de longen te halen, zal het goed naar de longen dat ongekleurde en niet vastgelegde zijn te gebruiken. Echter, RNA wordt geëxtraheerd uit gefixeerde weefsels en 8.
Aangezien de metastatische fase van borstkanker de grootste bedreiging voor de betrokken persoon 2 vormt, is het belangrijk om alle componenten van de borst tumorgenese visualiseren. Een belangrijke uitdaging bij het begrijpen van de mechanismen van borstkanker progressie de beschikbaarheid van modellen die de progressie van de ziekte 9 recapituleren. Opheldering van de moleculaire mechanismen van borstkanker tumorvorming en metastase worden aangebracht door middel diermodellen zoals muizen 9, 10. De meest voorkomende manieren induceren mouse borsttumoren zijn genetisch ingenieur de muizen met predisponerende mutaties van oncogenen of tumor onderdrukkers, de invoering van kankerverwekkende stoffen, en het injecteren van zeer invasieve kankercellen 10-12. Verkregen tumoren kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op genexpressie. Voor borstkanker onderzoek, gene expression profiling is belangrijk omdat het voorspelt de klinische uitkomst van de patiënt 13.
Sommige beperkingen bestaan met de muis-model van het bestuderen van Ontstaan van borstkanker. Hoewel muizen delen moleculaire en fysiologische gelijkenissen met de mens, doen ze niet altijd herhalen alle aspecten van de menselijke ziekten 5. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het gebruik van bepaalde genetisch gemanipuleerde muizen. Over het algemeen, muis modellen bieden een meer realistische manier om de muis Ontstaan van borstkanker dan andere aanwezige modellen zoals weefselkweek en geïsoleerde menselijke tumoren te analyseren. Bij elkaar genomen, dit protocol maakt het mogelijk om nader onderzoek van de verschillende aspectenvan de borst ontstaan van tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
