Protocol
Tutti gli esperimenti di topo sono stati fatti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati (IACUC) di LSU School of Medicine. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima della dissezione.
1. Preparazione di cellule primarie di tumore al seno del mouse
- Utilizzare un modello di topo che è stato geneticamente con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-Antigen (topo MMTV-PyMT transgenico), che si sviluppano spontaneamente tumori come descritto in precedenza 6.
- Sacrificare topi con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per assicurare un ambiente sterile (Figura 1A).
- Aprire la pelle dalla superficie dell'orifizio uretrale al collo con le forbici. Pin la pelle verso il basso per consentire un facile accesso agli organi (Figura 1B).
- Isolare il tumore al seno mammaria e lavare con freddo fosfato sterile salina tamponata (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
- Trasferire il tumoreuna piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri e tritare con una lama di rasoio sterile e forbici a circa 1 mm 3 pezzi. Fasi successive devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sterile.
- Incubare il tessuto tumorale tritato con collagenasi disciolto nel siero mezzi DMEM ad una concentrazione finale di 1 mg / ml su un bilanciere per 2 ore a 37 ° C. Centrifugare la sospensione tessuto tumorale per 3 min a 200 x g.
NOTA: L'incubazione Collagenase è essenziale per la dissociazione enzimatica del tessuto. - Eliminare il supernatante e lavare il precipitato 3 volte con PBS (pH 7,4) per centrifugazione per 3 min a 200 x g. Dopo l'ultimo lavaggio, decantare il surnatante.
- Risospendere il tessuto con 2 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C mentre oscillante. Centrifugare la sospensione per 3 min a 200 xg e ripetere i lavaggi.
- Risospendere il pellet in tessuto normale terreno di coltura (DMEM, 10% FBS, penna 2X / strep) su un piatto 10 cm. Cambiamentoi media ogni giorno per i prossimi 3 giorni. Cellule coltura fino numero di cellulare desiderato si ottiene.
NOTA: circa 1x10 7 cellule saranno isolati da questa procedura. Altri modelli tumorigenesi del mouse mammari, come MMTV-Neu, danno minore resa delle celle rispetto a MMTV-PyMT. Quando si utilizzano i modelli che producono un rendimento inferiore, è utile cominciare con una più grande cellule tumorali e cultura più lunghi.
2. polmone mouse estrazione di visualizzare Lung Metastasi
- Prima di procedere all'estrazione del polmone, rimuovere il fegato e il diaframma. Rimuovere le costole senza disturbare i polmoni.
- Con un bel paio di forbici, aprire la parte superiore della trachea che è più vicino alla vena giugulare.
- Utilizzando un catetere, iniettare un agente chimico come 1 ml di Z-fix o inchiostro India attraverso la trachea per riempire i polmoni (Figura 2A). Incorpora la Z-fix Polmoni in paraffina.
- De-macchia polmoni iniettati con inchiostro di china in soluzione di Fekete(100 ml 70% alcool, 10 ml di 10% formalina tamponata, e 5 ml di acido acetico glaciale) per 5 min. Definire noduli tumorali nei siti secondari con un ≥ 0,5 mm di diametro, determinare i noduli come metastasi.
NOTA: a causa di un blocco bronchi e bronchioli dal tumore, noduli tumorali non possono assorbire il 15% inchiostro di china, e quindi normale tessuto polmonare sarà in nero, e noduli tumorali saranno di colore bianco 7. Questo permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali individuali (Figura 2B).
3. Preparazione embrionali fibroblasti di topo (MEF) da embrioni di topo
- Sacrificio topi in gravidanza con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per garantire un ambiente sterile.
- Aprire la pelle dalla superficie dell'orifizio uretrale al collo con le forbici e isolare gli embrioni dall'utero.
- Fare attenzione a non disturbare gli embrioni quando si apre la pelle.
- Rimuovere le corna uterine e sciacquarli sotto ste freddorile PBS (pH 7,4).
- Separare l'embrione dalla sua placenta con molta attenzione e mettere gli embrioni in un piatto 10 centimetri contenente ghiaccio freddo PBS (pH 7,4).
- Togliere la testa, fegato e intestino dall'embrione e posizionare la parte restante in una piastra di coltura tissutale 12 pozzetto contenente PBS (pH 7,4).
- Trasferire il corpo dell'embrione ad un altro 12 pozzetti contenente tripsina EDTA e tagliato in piccoli pezzi (~ 1 mm 3) con una lama di rasoio sterile e forbici. Incubare il materiale tagliato con 5 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C.
- Inattivare tripsina aggiungendo 1 ml di siero fetale bovino (FBS) per gli embrioni tritate. Centrifugare la sospensione a 200 velocità xg per 10 minuti, rimuovere con attenzione il surnatante, risospendere il pellet con 1 ml di terreno DMEM caldo e trasferire tutti i contenuti per un piatto di 10 centimetri contenente 10 ml di DMEM (con il 20% FBS e 2X penicillina / streptomicina ).
- Cambia il mezzo ogni giorno per due giorni. Coltivare le cellule fino cella desideratail numero è raggiunto.
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Representative Results
Lo stadio progressione tumorale in cui sacrificare l'animale dipende dalla particolare studio e orientamenti IACUC. Nella Figura 1A, un 100 giorni vecchio C57BL / 6 del mouse con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-antigene (MMTV-PyMT) è stato sacrificato a tre mesi. La pelle è stata aperta dalla zona dell'orifizio uretrale al collo con le forbici e la pelle era immobilizzato per consentire un facile accesso agli organi come mostrato nella Figura 1B. Questo ha permesso un facile accesso al tumore ottenuta nella Figura 1C. Le cellule primarie ottenute dai tumori sono visualizzate nella Figura 1D. Dal momento che molti geni mediano seno metastasi del cancro al polmone 1, abbiamo estratto i polmoni (Figura 2A) per studiare il processo metastatico. Il polmone è stato gonfiato con Z-fix e colorati con inchiostro di china (Figura 2B) per visualizzare i noduli tumorali. Figura 3 mostra topo FIBR embrionali oblasts isolato dal FVB embrioni di topo sforzo.
Figura 1. Preparazione di cellule primarie di tumori al seno. (A) A 100 giorni vecchio mouse femmina con la Polyoma Medio T-Antigen (PyMT) è stato sacrificato. (B) La pelle è stato immobilizzato per consentire un facile accesso al tumore mammario. (C) Il tumore al seno è stato tagliato dall'animale . (D) Le cellule primarie isolate sono state coltivate in Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici (barra della scala: 100 micron). Le immagini mostrano le cellule a giorno 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Estrazione del polmone del mouse per visualizzare metastasi polmonari. (A) Il polmone è stato gonfiato con Z-fix e (B), macchiate di inchiostro di china per visualizzare noduli tumorali (barra della scala: 500 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3. Preparazione embrionali fibroblasti di topo (MEF) da embrioni di topo MEF cellule sono state estratte da un embrione di topo FVB (barra della scala: 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è per isolare cellule primarie di un tumore del mouse fresca. I lisati preparati da questo metodo sono utili per le proteine, DNA e RNA analisi. Le cellule tumorali del tumore mammario primario spesso metastatizzano al cervello, polmoni e ossa 1. Incluso è una tecnica per estrarre il polmone per il rilevamento di metastasi. Colorazione polmone con una macchia di inchiostro permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali, come mostrato nella Figura 2B. Fissaggio dei polmoni in soluzione Z-fix ci permetterà di fare sezioni di polmoni, e macchia con anticorpi che sono appropriati per studiare i meccanismi metastatici. Inoltre è incluso un protocollo per l'isolamento di fibroblasti embrionali di topo. Ciò è utile per confrontare l'espressione genica delle cellule tumorali primarie con l'fibroblasti embrionali nello stesso tipo di animale.
Nella preparazione di pile e MEF, la fase più critica è la macinazione del materiale. Senza ripartizione corretta, losarà raggiunto il numero di cellulare w. Se si raggiunge un conteggio di cellule basso, protocollo può ancora essere seguito, ma le cellule dovrà essere coltivate per un periodo di tempo più lungo .. Nell'estrazione polmone, corretta colorazione e decolorazione è essenziale per consentire la visualizzazione del tumore nodulo. Per estrarre l'RNA / proteine dai polmoni, sarà bene utilizzare polmoni che sono senza macchia e non fissato. Tuttavia, l'RNA può essere estratto da tessuti fissati nonché 8.
Dal momento che la fase metastatica del tumore al seno costituisce la più grande minaccia per l'individuo colpito 2, è importante visualizzare tutti i componenti della tumorigenesi seno. Una sfida importante per la comprensione dei meccanismi di progressione del cancro al seno è la disponibilità di modelli che ricapitolano la progressione della malattia 9. Il chiarimento dei meccanismi molecolari della tumorigenesi della mammella e delle metastasi vengono raggiunti utilizzando modelli animali, come i topi 9, 10. I modi più comuni per indurre mouse tumori mammari sono geneticamente ingegnere topi con mutazioni predisponenti di oncogeni o soppressori tumorali, introducendo sostanze cancerogene, e l'iniezione di cellule tumorali altamente invasivo 10-12. I tumori ottenuti possono poi essere ulteriormente analizzati per l'espressione genica. Per la ricerca sul cancro al seno, l'espressione genica è importante in quanto predice il decorso clinico del paziente 13.
Esistono alcune limitazioni con il modello murino di studiare tumorigenesi mammaria. Anche se i topi condividono similitudini molecolari e fisiologici con gli esseri umani, non sempre ricapitolano tutti gli aspetti delle malattie umane 5. Questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si utilizzano alcuni topi geneticamente ingegnerizzati. Nel complesso, modelli murini forniscono un modo più realistico per analizzare il mouse mammaria tumorigenesi rispetto ad altri modelli presenti quali la cultura dei tessuti e tumori umani isolati. Nel loro insieme, questo protocollo permette di ulteriori indagini di diversi aspettidella tumorigenesi seno.
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Disclosures
Gli autori non hanno informativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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