Protocol
Tüm farenin deneyleri Tıp LSU Okulu Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı komite (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapıldı. Tüm cihazlar diseksiyon öncesinde otoklavlanmalıdır gerekir.
Fare göğüs tümörlerinden gelen primer hücre hazırlanması 1.
- Genetik olarak, daha önce tarif edildiği gibi 6 spontan tümörler geliştirmektedir fare meme tümörü virüs Polyoma Orta T-antijen (MMTV PyMT transgenik fare) ile tasarlanmış olan bir fare modeli kullanarak.
- İzofluran (% 99.9) ile fareler kurban ve steril bir ortamı (Şekil 1A) sağlamak için% 75 etanol püskürtün.
- Makasla boyun üretral orifis alanı cildi açın. Organların (Şekil 1B) kolay erişim sağlamak için cilt aşağı pin.
- Meme, meme tümörü izole ve soğuk, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (pH 7.4) (Şekil 1C) ile yıkayın.
- Tümörün aktarınsteril 10cm doku kültürü plakası yaklaşık 1 mm 3 adet steril jilet ve makas ile doğrayın ve. Daha sonraki aşamalar, steril bir laminer akış başlığı içinde yapılmalıdır.
- 37 ° C 'de 2 saat süre ile bir rocker 1 mg / ml lik bir nihai konsantrasyonda serumsuz DMEM ortamı içinde çözülmüş kollajenaz ile kesilmiş tümör dokusu inkübe edin. X gr 200'de 3 dakika boyunca tümör dokusu süspansiyon santrifüjleyin.
Not: Kolajenaz inkübasyon doku enzimatik ayrışması için gereklidir. - Süpernatant atılır ve 200 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj ile, PBS (pH 7.4) ile Çökelti 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatant süzün.
- Nutating ise 37 ° C 'de 5 dakika boyunca tripsin EDTA, 2 ml ile doku yeniden süspanse edin. 200 x g'de 3 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüj ve yıkama tekrarlayın.
- 10 cm plaka, normal büyüme ortamında (DMEM,% 10 FBS, 2X pen / strep) doku pelletini. DeğişiklikOrtam Sonraki 3 gün boyunca her gün. İstediğiniz hücre sayısı kadar Kültür hücreleri elde edilir.
NOT: Yaklaşık 1x10 7 hücreleri bu prosedür izole edilecektir. MMTV PyMT karşılaştırıldığında örneğin MMTV-Neu gibi diğer fare meme tümör oluşumu modelleri, hücrelerin daha düşük verim verir. Bir düşük değerli ürününü oluşturmak modeller kullanılarak, bu artık bir daha büyük bir tümör ve Kültür hücreleri ile başlamak için faydalıdır.
2. Fare Akciğer Ekstraksiyon Akciğer Metastazı gözünüzde canlandırın için
- Akciğer çıkarma öncesinde, karaciğer ve diyaframı çıkarın. Akciğerleri rahatsız etmeden kaburga yerinden.
- Makas ince çift, şah damarından daha yakın olan trakea üst kısmını açın.
- Bir kateter kullanılarak, akciğer (Şekil 2A) doldurmak için trakea yoluyla Z-fix ya da Hindistan, mürekkep gibi 1 ml bir madde enjekte edilir. Göm parafin Akciğerler Z-düzeltin.
- Fekete çözümü Hindistan mürekkep enjekte akciğerleri De-leke(100 mi% 70 alkol,% 10 tamponlu formalin 10 ml buzlu asetik asit 5 mi) 5 dakika boyunca. Çapında bir ≥ 0.5 mm ile ikincil bölgelerde tümör nodülleri tanımlayın metastaz olarak nodüller belirler.
NOT: tümör tarafından bronşlar ve bronşiyol tıkanmaya, tümör nodülleri% 15 Hindistan mürekkebi absorbe edemez ve bu nedenle normal akciğer dokusu siyah olacak ve tümör nodülleri beyaz renk 7 olacak dolayı. Bu tek tek tümör nodülleri (Şekil 2B) görselleştirme sağlayacaktır.
Fare Embriyolar gelen fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) hazırlanması 3.
- İzofluran (% 99.9) ile birlikte hamile fareler kurban ve steril bir ortam sağlamak için% 75 etanol püskürtün.
- Makasla boyun üretral orifis alanı cildi açın ve rahim embriyolar izole.
- Cildi açarken embriyolar rahatsız etmemek için dikkatli olun.
- Rahim boynuzları çıkarın ve soğuk ste onları yıkayınPBS (pH 7.4) içinde çözündürülür.
- Buz soğukluğunda PBS (pH 7.4) içeren 10 cm'lik tabak içinde olan çok dikkatli bir şekilde plasenta ve yer embriyolar embriyo ayırın.
- Embriyo kafa, karaciğer ve gut çıkarın ve PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir 12 gözlü doku kültür plakalarında kalan kısmı yerleştirin.
- Başka bir 12 kuyu plaka içeren tripsin EDTA embriyo gövdesini aktarın ve steril bir jilet ve makas kullanarak küçük parçalara (~ 1 mm 3) oyulmuş. 37 ° C'de 5 dakika boyunca tripsin EDTA, 5 ml kıyılmış malzeme inkübe edin.
- Doğranmış embriyolar 1 ml cenin sığır serumu (FBS) eklenerek tripsin inaktive. Santrifüj, 10 dakika boyunca 200 x g hızında süspansiyonu, dikkatli bir şekilde, süpernatant kaldırmak sıcak DMEM ortamı, 1 ml ile pelet tekrar süspansiyon ve 10 mi DMEM (% 20 FBS ve 2X penisilin / streptomisin içeren 10 cm'lik tabak bütün içeriğini aktarmak ).
- İki gün için orta her gün değiştirin. Kültür, istenen hücre kadar hücrelernumara elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
hayvan kurban etmek tümör ilerleme aşaması, belirli çalışma ve IACUC kurallarına bağlıdır. Şekil 1A, fare meme tümörü virüs Polyoma Orta T-antijen (MMTV PyMT) ile 100 günlük bir C57BL / 6 farede üç ayda kurban edilmiştir. cilt makas ile boyun üretral orifis alanı açılmış ve cilt Şekil 1B gösterildiği gibi organlara kolay erişim sağlamak için aşağı tuş oldu. Bu durum, Şekil 1C'de elde edildi tümör kolay ulaşılmasına izin vermektedir. tümörlerden elde edilen birincil hücreler Şekil 1D görselleştirilmektedir. Birçok genin akciğer 1 meme kanseri metastazı aracılık yana, metastatik süreci incelemek için akciğerlere (Şekil 2A) ekstre edildi. Akciğer Z-fix ile şişirilir ve tümör nodülleri görselleştirmek için çini mürekkebi (Şekil 2B) ile boyandı. Şekil 3 fare embriyonik fibr gösterir FVB suşu fare embriyoları izole oblast.
Meme Tümörlerinde Primer Hücreleri 1. Hazırlık Şekil. (A) Polyoma Orta T-Antijen (PyMT) ile 100 günlük dişi fare kurban edildi. (B) cilt meme tümör kolay erişim sağlamak için aşağı tuş oldu. (C) göğüs tümörü hayvan kesildi . (100 uM ölçek çubuğu), (D) izole edilmiş primer hücrelerde Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile takviye edilmiş (DMEM) 'de kültürlenmiştir. görüntüler 3. günde hücreleri görüntüler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/ 52.609 / 52609fig2.jpg "upload />
Şekil 2. Fare akciğer çıkarma akciğer metastazı görselleştirmek için. (Ölçek çubuğu: 500 uM) (A) Akciğer Z-fix ve tümör nodülleri görselleştirmek için çini mürekkebi ile boyandı (B) ile şişirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Fare Embriyolar gelen Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF'ler) hazırlanması Şekil 3. MEF hücreleri FVB fare embriyo (Ölçek çubuğu: 100 uM) çıkarıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, taze fare tümör primer hücrelerin izole edilmesi içindir. Bu yöntemle hazırlanan lizatlar protein, DNA ve RNA analizleri için de yararlıdır. Primer meme tümörün kanserli hücreleri genellikle beyin, akciğer ve kemik 1 metastaz. Dahil metastaz saptanması için akciğer çıkarmak için kullanılan bir tekniktir. Şekil 2B'de görüldüğü gibi, bir mürekkep lekesi ile akciğer boyama tümör nodülleri görünüm için izin verir. Z-fix çözeltisi içinde akciğerlere Tespit bize akciğer bölümleri yapmak ve metastatik mekanizmalarını incelemek için uygun antikorlar ile leke sağlayacaktır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlar izolasyonu için bir protokol dahildir. Bu, aynı hayvan türü embriyosu akciğer fibroblast primer tümör hücrelerin gen ekspresyonunu karşılaştırmak için faydalıdır.
Birincil hücre ve MEFS hazırlanmasında, en kritik adım malzemenin kıyma olduğunu. Lo uygun arıza olmadanw hücre sayısı elde edilecektir. Düşük hücre sayısı elde edilir, protokol de takip edilebilir, ancak hücre akciğer ekstraksiyonunda .. daha uzun bir dönem için daha kültive edilmesi gerekecektir uygun boyanması ve destaining tümör nodülü görselleştirme için izin vermek için gereklidir. Akciğerlerden RNA / protein ayıklamak için, lekesiz ve sabitlenmemiş olan akciğerler kullanmak iyi olacaktır. Bununla birlikte, RNA sabit dokularda da 8 elde edilebilir.
Meme kanseri metastatik evre etkilenen bireysel 2 büyük tehdit bu yana, meme tümör oluşumu tüm bileşenlerini görselleştirmek için önemlidir. Meme kanseri ilerlemesi mekanizmalarını anlamada büyük bir meydan okuma hastalığı 9 ilerlemesini özetlemek modellerin bulunmasıdır. Meme tümör oluşumu ve metastaz moleküler mekanizmaların açıklanması, fare 9, 10 olarak, hayvan modelleri kullanılarak elde edilmiştir. En yaygın yolu mous indüklemee meme tümörleri, genetik, onkogenler veya tümör bastırıcılarının mutasyon öncesi bertaraf kanserojen tanıtan ve son derece invaziv kanser hücrelerini enjekte 10-12 ile fareler mühendis vardır. Elde edilen tümörler daha sonra gen ekspresyonu için analiz edilebilir. Hastanın 13 klinik sonuçlarını tahmin beri meme kanseri araştırmaları için, gen ifadesi profilleme önemlidir.
Bazı sınırlamalar meme tümörogenez okuyan fare modeli ile mevcuttur. Fareler insanlarla moleküler ve fizyolojik benzerlikler paylaşmak rağmen, her zaman insan hastalıklarının 5 tüm yönlerini özetlemek yok. Bazı genetik olarak fareler kullanılarak, bu göz önüne alınması gerekmektedir. Genel olarak, fare modelleri gibi doku kültürü ve izole edilmiş insan tümörler gibi diğer mevcut modellere göre fare meme tümörogenez analiz etmek daha gerçekçi bir yol sağlar. Birlikte ele alındığında, bu protokol farklı yönlerini daha fazla araştırma için izin verirMeme tümör oluşum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir açıklama yok.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).