Protocol
Alle mus forsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i LSU School of Medicine. Alle instrumenter skal autoklaveres før dissektion.
1. Fremstilling af primære celler fra mus brysttumorer
- Brug en musemodel, der var genetisk manipuleret med musebrysttumorvirus Polyoma mex T-antigen (MMTV-PyMT-transgene mus), som spontant udvikler tumorer som tidligere beskrevet 6.
- Sacrifice mus med Isofluran (99,9%) og spray 75% ethanol for at sikre et sterilt miljø (figur 1A).
- Åbne skindet fra det område af urinrørsåbningen til halsen med en saks. Pin huden ned for at give nem adgang til organer (Figur 1B).
- Isolere mamma brysttumor og vaskes med koldt sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) (pH 7,4) (figur 1C).
- Overfør tumorenen steril 10cm vævskulturplade og hak det med en steril barberblad og saks til ca. 1 mm3 stykker. Efterfølgende trin bør udføres i en steril laminar flow hætte.
- Inkubere hakkede tumorvæv med collagenase opløst i serumfrit DMEM-medium i en slutkoncentration på 1 mg / ml på en rocker i 2 timer ved 37 ° C. Centrifugeres tumorvæv suspension i 3 min ved 200 x g.
BEMÆRK: Collagenase inkubation er afgørende for enzymatisk dissociation af vævet. - Supernatanten fjernes, og bundfaldet vaskes 3 gange med PBS (pH 7,4) ved centrifugering i 3 min ved 200 x g. Efter den sidste vask, dekanter supernatanten.
- Resuspender vævet med 2 ml trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C under nuterende. Centrifugeres suspensionen i 3 minutter ved 200 xg og gentage vaskene.
- Resuspender vævspellet i normalt vækstmedium (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) på en 10 cm plade. Ændringmedierne hver dag for de næste 3 dage. Dyrke celler indtil det ønskede celletal er opnået.
BEMÆRK: Ca. 1x10 7 celler vil blive isoleret fra denne fremgangsmåde. Andre muse mamma tumorigenese modeller, såsom MMTV-Neu, giver lavere udbytte af celler sammenlignet med MMTV-PyMT. Når der anvendes modeller, der producerer et lavere udbytte, er det fordelagtigt at begynde med en større tumor og kultur celler længere.
2. Mouse Lung Ekstraktion at Visualiser Lung Metastase
- Før lunge ekstraktion, fjerne leveren og mellemgulvet. Løsne ribberne uden at forstyrre lungerne.
- Med en fin saks, åbne den øvre del af luftrøret som er tættere på halsvenen.
- Anvendelse af et kateter, injicere et middel, såsom 1 ml Z-fix eller tusch gennem luftrøret til at fylde lungerne (figur 2A). Integrer Z-fix Lunger i paraffin.
- De-pletten lungerne injiceret med tusch i Fekete løsning(100 ml 70% alkohol, 10 ml 10% pufret formalin og 5 ml iseddike) i 5 minutter. Definer tumorknuder på sekundære sites med en ≥ 0,5 mm i diameter, bestemme knuder som metastaser.
BEMÆRK: På grund bronkier og bronchiole blokering af tumoren, kan tumorknuder ikke absorbere 15% tusch og dermed normalt lungevæv vil være i sort, og tumorknuder vil være i hvid farve 7. Dette vil tillade visualisering af individuelle tumorknuder (figur 2B).
3. Forberedelse mus embryonale fibroblaster (MEF'er) fra musefostre
- Sacrifice drægtige mus med Isofluran (99,9%) og spray 75% ethanol for at sikre et sterilt miljø.
- Åbne skindet fra det område af urinrørsåbningen til halsen med en saks og isolere embryonerne fra livmoderen.
- Pas på ikke at forstyrre embryoner ved åbning af huden.
- Fjern uterine horn og skyl dem i koldt sterile PBS (pH 7,4).
- Adskil embryonet fra dets placenta meget omhyggeligt og sted embryoner i en 10cm plade indeholdende iskold PBS (pH 7,4).
- Fjerne hovedet, lever og tarm fra embryonet og placere den resterende del i en 12 brønd vævskultur-plade indeholdende PBS (pH 7,4).
- Overføre embryonet legeme til et andet 12-brønds plade indeholdende trypsin EDTA og skåret i små stykker (~ 1 mm 3) ved hjælp af et sterilt barberblad og saks. Inkubere snittede materiale med 5 ml trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C.
- Inaktivere trypsin ved at tilsætte 1 ml føtalt bovint serum (FBS) til de hakkede embryoner. Centrifuger suspensionen ved 200 xg hastighed i 10 min, fjern forsigtigt supernatanten, resuspender pellet med 1 ml varmt DMEM medium og overføre alt indholdet til en 10 cm skål indeholdende 10 ml DMEM (med 20% FBS og 2X Penicillin / Streptomycin ).
- Skift medium hver dag i to dage. Kultur cellerne indtil den ønskede celleantal er nået.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumor progression stadium, hvor at ofre dyret, afhænger af den særlige undersøgelse og IACUC retningslinjer. I figur 1A, en 100 dage gammel C57BL / 6 mus med musebrysttumorvirus Polyoma mex T-antigen (MMTV-PyMT) blev aflivet efter tre måneder. Huden blev åbnet fra det område, som urinrørsåbningen til halsen med saksen, og huden blev holdt nede for at tillade nem adgang til organer som vist i figur 1B. Dette tillod let adgang til tumor, der blev opnået i figur 1C. De primære celler opnået fra tumorerne visualiseres i figur 1D. Da mange gener medierer brystkræft metastase til lungen 1, Tekstmængden lungerne (figur 2A) for at studere den metastatiske proces. Den lunge blev oppustet med Z-fix og farvet med tusch (figur 2B) for at visualisere tumorknuder. Figur 3 viser muse embryonale fibr oblaster isoleret fra FVB stamme musefostre.
Figur 1. Fremstilling af primære celler fra brysttumorer. (A) En 100 dage gamle hunmus med Polyoma mex T-antigen (PyMT) blev aflivet. (B) Huden blev holdt nede for at tillade let adgang til brysttumor. (C) brysttumor Den blev skåret fra dyret . (D) De isolerede primære celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (skala bar: 100 uM). Billederne viser cellerne på dag 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
upload / 52609 / 52609fig2.jpg "/>
Figur 2. Mouse lunge ekstraktion at visualisere lunge metastase. (A) lunge blev oppustet med Z-fix og (B) farvet med tusch til at visualisere tumorknuder (skala bar: 500 uM). Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3. Forberedelse Mouse Embryonale fibroblaster (MEF'er) fra museembryoer MEF celler blev udvundet fra en FVB mus embryo (skala bar: 100 uM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er til isolering primære celler fra en frisk mus tumor. Lysater fremstillet fra denne metode er nyttige til protein, DNA og RNA-analyse. Kræftceller fra primær brysttumor ofte metastaserer til hjernen, lunger og knogler 1. Inkluderet er en teknik til at udtrække lungen til påvisning af metastaser. Farvning lungen med en blæk plet vil give mulighed for visualisering af tumorknuder som det ses i figur 2B. Fastsættelse lungerne i Z-fix løsning vil gøre det muligt for os at gøre dele af lungerne, og plette med antistoffer, der er passende til at studere metastatiske mekanismer. Også inkluderet er en protokol til isolering af muse embryonale fibroblaster. Dette er nyttigt til sammenligning af genekspressionen af de primære tumorceller med den embryonale fibroblast i samme dyreart.
Ved fremstillingen af primære celler og MEF'er, det mest kritiske trin er hakningen af materialet. Uden ordentlig opdeling, low celle nummer vil blive nået. Hvis et lavt celletal er opnået, kan protokollen stadig følges, men cellerne skal dyrkes i en længere periode .. I lungen ekstraktion, er afgørende korrekt farvning og affarvning at muliggøre tumor knuden visualisering. At udtrække RNA / protein fra lungerne, vil det være godt at bruge lungerne, der er unstained og optagne. Dog kan RNA ekstraheres fra fikserede væv samt 8.
Da den metastatiske fase af brystkræft udgør den største trussel mod de berørte enkelte 2, er det vigtigt at visualisere alle komponenter i bryst tumorigenese. En stor udfordring i at forstå mekanismer i brystkræft progression er tilgængeligheden af modeller, rekapitulere progression af sygdommen 9. Belysning af de molekylære mekanismer i bryst tumorigenese og metastase opnås ved anvendelse af dyremodeller, såsom mus 9, 10. De mest almindelige måder at inducere musene brysttumorer er genetisk ingeniør mus med prædisponerende mutationer af onkogener eller tumorsuppressorer, indførelse kræftfremkaldende stoffer, og injektion stærkt invasive kræftceller 10-12. Opnåede tumorer kan derefter yderligere analyseres for genekspression. For forskning i brystkræft, genekspression profilering er vigtigt, da det forudsiger det kliniske resultat af patienten 13.
Nogle begrænsninger findes med musemodel studere bryst tumorigenese. Selvom mus deler molekylære og fysiologiske ligheder med mennesker, de ikke altid rekapitulere alle aspekter af menneskelige sygdomme 5. Dette bør tages i betragtning ved anvendelse af visse genetisk modificerede mus. Samlet set musemodeller giver en mere realistisk måde at analysere musen brystkirtler tumorigenesis frem for andre nuværende modeller som vævskultur og isolerede humane tumorer. Tilsammen denne protokol giver mulighed for yderligere undersøgelse af forskellige aspekteraf brystkræft tumorigenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
