Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Primær Tumor og MEF Cell Isolation å studere Lung Metastase

Published: May 20, 2015 doi: 10.3791/52609
* These authors contributed equally

Protocol

Alle mus forsøkene ble gjort i samsvar med protokoller godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komiteer (IACUC) av LSU School of Medicine. Alle instrumenter må autoklaveres før disseksjon.

1. Utarbeidelse av primære celler fra mus brystsvulster

  1. Bruk en musemodell som ble genmodifisert med musen Mammary Tumor Virus Polyoma Middle T-antigen (MMTV-PyMT-transgene mus), som spontant utvikle svulster som tidligere beskrevet 6.
  2. Offer-mus med Isofluran (99,9%) og spray 75% etanol for å sikre et sterilt miljø (figur 1A).
  3. Åpne hud fra området i urinåpningen til halsen med en saks. Pin huden ned for å gi enkel tilgang til organer (Figur 1b).
  4. Isoler mammary brysttumor og vask med kald steril fosfatbufret saltløsning (PBS) (pH 7,4) (figur 1C).
  5. Overfør til tumoren steril 10cm vevskulturskål og hakk det med en steril barberblad og saks til ca 1 mm 3 stykker. Påfølgende trinn skal utføres i en steril laminær hette.
  6. Inkuber hakket tumorvevet med Collagenase oppløst i serumfritt DMEM medier ved en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml på en vippe i 2 timer ved 37 ° C. Sentrifuger tumorvevet suspensjonen i 3 minutter ved 200 x g.
    MERK: Collagenase inkubasjon er avgjørende for enzymatisk dissosiering av vevet.
  7. Kast supernatanten og vask bunnfallet tre ganger med PBS (pH 7,4) ved sentrifugering i 3 minutter ved 200 x g. Etter den siste vask, dekanter supernatanten.
  8. Resuspender vev med 2 ml trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C under vipp. Sentrifuger suspensjonen i 3 min ved 200 xg og gjenta vaskinger.
  9. Resuspender pellet i vevet normal vekstmedium (DMEM, 10% FBS, 2 x pen / strep) på en 10 cm plate. Endremedia hver dag for de neste tre dagene. Kultur celler til ønsket celleantall er oppnådd.
    MERK: Omtrent 1x10 7-celler blir isolert fra denne prosedyren. Andre mus melke tumorigenesis modeller, for eksempel MMTV-Neu, gi lavere utbytte av celler i forhold til MMTV-PyMT. Ved bruk av modeller som gir en lavere yield, er det gunstig å begynne med større svulst og kultur celler lengre.

2. Mouse Lung Utvinning til Visual Lung Metastase

  1. Før ekstraksjon lunge, lever og fjerne membranen. Løsne ribbeina uten å forstyrre lungene.
  2. Med en fin saks, åpner den øvre del av luftrøret, som er nærmere til halsvene.
  3. Ved hjelp av et kateter, injiserer et middel slik som 1 ml Z-fix eller India blekk gjennom luftrøret for å fylle lungene (figur 2A). Embed Z-fix Lunger i parafin.
  4. De-beis lungene injisert med tusj i Fekete løsning(100 ml 70% alkohol og 10 ml 10% bufret formalin, og 5 ml iseddik) i 5 min. Definere tumornoduler på sekundære områder med ≥ 0,5 mm i diameter, bestemme knuter som metastaser.
    MERK: På grunn av bronkiene og bronchiole blokkering av svulsten, kan tumornoduler ikke absorberer 15% tusj, og dermed normalt lungevev vil være i svart, og tumornoduler vil være i hvit farge 7. Dette vil tillate visualisering av individuelle tumorknuter (figur 2B).

3. Klar Mouse Embryonic Fibroblaster (MEFs) fra mus embryoer

  1. Ofre gravide mus med isofluran (99,9%) og spray 75% etanol for å sikre et sterilt miljø.
  2. Åpne hud fra området i urinåpningen til halsen med saks og isolere embryoene fra livmoren.
  3. Vær forsiktig med å forstyrre embryoene når du åpner huden.
  4. Fjerne livmor horn og skyll dem i kaldt sterile PBS (pH 7,4).
  5. Separer embryoet fra sin placenta meget nøye og sted embryo i en 10 cm plate inneholdende iskald PBS (pH 7,4).
  6. Fjerne hodet, lever og tarm fra embryo og plassere den resterende del i en 12 brønners vevskulturplate inneholdende PBS (pH 7,4).
  7. Overfør embryoet kroppen til en annen 12-brønners plate inneholdende trypsin EDTA og skåret i små biter (~ 1 mm 3) ved hjelp av en steril barberblad og en saks. Inkuber det hakkede materiale med 5 ml trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C.
  8. Inaktivere trypsin ved å tilsette 1 ml bovint fosterserum (FBS) til de hakkede embryoer. Sentrifuger suspensjonen ved 200 xg hastighet i 10 minutter, fjern forsiktig supernatanten, resuspender pelleten med 1 ml varm DMEM medium og overføre hele innholdet i en 10 cm skål inneholdende 10 ml DMEM (med 20% FBS og 2 x Penicillin / Streptomycin ).
  9. Endre medium hver dag i to dager. Kultur cellene til ønsket celleantall er oppnådd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den tumorprogresjon på hvilket stadium å ofre dyret avhenger av den spesielle studier og IACUC retningslinjer. I figur 1A, en 100 dager gammel C57BL / 6 mus med muse Mammary Tumor Virus Polyoma Middle T-antigen (MMTV-PyMT) ble ofret på tre måneder. Huden ble åpnet fra området i urinåpningen til halsen med saksen og huden ble låst ned for å gi enkel tilgang til organer som vist i figur 1B. Dette tillot lett tilgang til tumoren som ble oppnådd i figur 1C. Den primære celler hentet fra svulstene er visualisert i Figur 1D. Siden mange gener mediere brystkreft metastasering til lungen 1, vi ekstrahert lungene (figur 2A) for å studere den metastatiske prosess. Lungene ble fylt med Z-fix og farget med tusj (figur 2B) for å visualisere tumornoduler. Figur 3 viser mus embryonale fibr oblasts isolert fra FVB belastning museembryoer.

Figur 1
Figur 1. Utarbeidelse av primære celler fra brystsvulster. (A) En 100 dager gammel kvinnelig mus med Polyoma Midt T-antigen (PyMT) ble ofret. (B) Huden ble låst ned for å gi enkel tilgang til brysttumor. (C) Brystet svulsten ble kuttet fra dyret . (D) De isolerte primære celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (Skala: 100 uM). Bildene viser cellene ved dag 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

laste / 52609 / 52609fig2.jpg "/>
Figur 2. Mouse lunge utvinning å visualisere lungemetastaser. (A) lunge ble oppblåst med Z-fix og (B) farget med tusj for å visualisere tumornoduler (skala bar: 500 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
. Figur 3. Klar Mouse Embryonic Fibroblaster (MEFs) fra mus embryoer MEF celler ble hentet fra en FVB museembryo (skala bar: 100 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen er for å isolere primærceller fra en frisk mus tumor. Lysatene fremstilt fra denne fremgangsmåten er nyttige for protein, DNA og RNA-analyse. Kreftceller fra den primære brysttumor ofte metastasere til hjerne, lunge og ben en. Inkludert er en teknikk for å ekstrahere lungen for påvisning av metastase. Farging lungen med en blekkflekk vil tillate visualisering av tumorknuter som vist i figur 2B. Fikse lungene i Z-fix-løsning vil gi oss mulighet til å gjøre deler av lungene, og flekker med antistoffer som er aktuelle å studere metastatiske mekanismer. Også inkludert er en protokoll for isolering av embryoniske muse-fibroblaster. Dette er nyttig for sammenligning av genekspresjon av primærtumorceller med den embryoniske fibroblast i samme dyr type.

Ved fremstilling av primære celler og MEFs, er den mest kritiske trinn hakking av materialet. Uten skikkelig sammenbrudd, low celle nummer vil bli oppnådd. Dersom en lav celletall er oppnådd, kan protokollen fortsatt bli fulgt, men cellene må dyrkes i en lengre tidsperiode .. I lungen utvinning, er riktig farging og avfarging nødvendig for å tillate for tumor nodul visualisering. Hvis du vil trekke RNA / protein fra lungene, vil det være bra å bruke lungene som er unstained og unfixed. Imidlertid kan RNA ekstraheres fra faste vev samt 8.

Siden metastatisk stadium av brystkreft utgjør den største trusselen mot det påvirkede individ 2, er det viktig å visualisere alle komponenter av bryst tumorigenesis. En stor utfordring i å forstå mekanismene for brystkreft progresjon er tilgjengeligheten av modeller som rekapitulere progresjon av sykdommen 9. Klarlegging av de molekylære mekanismene for brystkreft tumorigenesis og metastasering er oppnådd ved bruk av dyremodeller som mus 9, 10. De vanligste måtene å indusere mouse mammatumorer er genetisk ingeniør musene med predisponerer mutasjoner av onkogener eller svulst dempere, innføre kreftfremkallende, og injisere svært invasive kreftceller 10-12. Innhentet svulster kan da bli ytterligere analysert for genuttrykk. For brystkreft forskning, er genuttrykk profilering viktig siden det spår kliniske resultatet av pasienten 13.

Noen begrensninger eksisterer med musemodell for å studere bryst tumorigenesis. Selv mus dele molekylære og fysiologiske likheter med mennesker, har de ikke alltid rekapitulere alle aspekter av menneskelige sykdommer 5. Dette bør tas i betraktning når du bruker visse genmodifiserte mus. Totalt sett musemodeller gi en mer realistisk måte å analysere musebryst tumorigenesis fremfor andre nåværende modeller som vev kultur og isolerte humane tumorer. Til sammen gir dette protokollen for den videre etterforskningen av ulike aspekterav bryst tumorigenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone SH30243.01 Store at 4 °C
0.05% Trypsin-EDTA Life  technologies 25300-062 Store at – 20 °C
Collagenase Type IV Sigma-Aldrich C5138 Store at – 20 °C
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Pen Strep Life  technologies 15140-122 Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-106 Store at – 80 °C
Z-fix ANATECH #174 Store at RT
India Ink Yasutomo Store at RT
AERRANE (Isoflurane) Baxter NDC 10019-773-60 Store at RT
Ethanol EMD AX0441-3 Store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
  2. Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
  3. Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
  4. Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
  5. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
  6. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  7. Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
  8. Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
  11. Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
  12. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
  13. Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).

Tags

Medicine tumor bryst lunge primær MEF embryo fibroblaster cancer celle mus
Primær Tumor og MEF Cell Isolation å studere Lung Metastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dong, S., Maziveyi, M., Alahari, S.More

Dong, S., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis. J. Vis. Exp. (99), e52609, doi:10.3791/52609 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter