Protocol
Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committees (IACUC) von LSU School of Medicine genehmigt wurde. Alle Instrumente müssen vor der Dissektion autoklaviert werden.
1. Herstellung von primären Zellen aus Mausbrusttumoren
- Eine Maus-Modell, das genetisch mit dem Maus-Brusttumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT transgenen Maus), das spontan entwickeln Tumore wie zuvor beschrieben 6 konstruiert wurde.
- Opfern Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung (1A) zu gewährleisten.
- Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere. Pin der Haut nach unten, um einfachen Zugang zu Organen (1B) zu ermöglichen.
- Isolieren Sie die Brustbrusttumor und mit kaltem sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) (Abbildung 1c).
- Übertragen Sie den Tumoreine sterile 10 cm Gewebekulturplatte und hacken sie mit einer sterilen Rasierklinge und Schere auf ca. 1 mm 3 Stück. Die nachfolgenden Schritte sollten in einer sterilen Sterilbank durchgeführt werden.
- Inkubiere die gehackte Tumorgewebe mit Collagenase in serumfreiem DMEM-Medium mit einer Endkonzentration von 1 mg / ml gelöst auf einer Wippe für 2 h bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie das Tumorgewebe Suspension 3 min bei 200 x g.
HINWEIS: Die Collagenase-Inkubation ist für enzymatische Dissoziation des Gewebes. - Überstand verwerfen und wäscht den Niederschlag 3-mal mit PBS (pH 7,4) durch Zentrifugation für 3 min bei 200 x g. Nach dem letzten Waschen, Dekantieren des Überstandes.
- Resuspendieren des Gewebes mit 2 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C, während Taumel. Zentrifugieren Sie die Suspension 3 min bei 200 xg und wiederholen Sie die Wäschen.
- Resuspendieren Gewebepellet in normalem Wachstumsmedium (DMEM, 10% FBS, 2X Pen / Strep) auf eine 10 cm Platte. Veränderungdie Medien jeden Tag für die nächsten 3 Tage. Kulturzellen, bis die gewünschte Anzahl von Zellen erhalten wird.
HINWEIS: Etwa 1x10 7 Zellen werden aus diesem Verfahren isoliert werden. Andere Maus-Mammatumorgenese Modellen wie MMTV-Neu ergeben niedrigere Ausbeute an Zellen im Vergleich mit MMTV-PyMT. Bei der Verwendung von Modellen, die einen niedrigeren Ertrag erzeugen, ist es vorteilhaft, mit einem größeren Tumor und Kulturzellen länger zu beginnen.
2. Maus Lung Extraction auf Lungenmetastasen visualisieren
- Vor der Lunge Extraktion, entfernen Sie die Leber und die Membran. Verdrängen die Rippen ohne die Lungen zu stören.
- Mit einer feinen Schere, öffnen Sie den oberen Teil der Luftröhre, die näher an der Halsschlagader ist.
- Verwendung eines Katheters, injiziert ein Mittel wie beispielsweise 1 ml Z-fix oder Tusche durch die Luftröhre in die Lunge (2A) zu füllen. Betten Sie die Z-fix Lungs in Paraffin.
- De-Fleck die Lungen mit Tusche in Fekete-Lösung eingespritzt(100 ml 70% -igem Alkohol, 10 ml 10% igem gepuffertem Formalin und 5 ml Eisessig) für 5 min. Definieren Tumorknoten an sekundären Standorten mit ≥ 0,5 mm im Durchmesser, bestimmen die Knötchen als Metastasierung.
HINWEIS: Aufgrund der Bronchien und Bronchiolen Blockade durch den Tumor, können Tumorknoten nicht absorbieren 15% Tusche und damit normalem Lungengewebe wird in schwarz, und die Tumorknoten wird in weißer Farbe 7 sein. Dies wird die Visualisierung individueller Tumorknoten (2B) zu ermöglichen.
3. Vorbereitung embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) aus Maus Embryonen
- Opfern trächtige Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung sichergestellt.
- Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere und Isolierung der Embryonen aus dem Uterus.
- Achten Sie darauf, um die Embryonen stören beim Öffnen der Haut.
- Entfernen Sie die Gebärmutterhörner und spülen Sie sie in kaltem sterile PBS (pH 7,4).
- Trennen Sie den Embryo von seiner Plazenta sehr sorgfältig und Ort Embryonen in einer 10 cm Platte mit eiskaltem PBS (pH 7,4).
- Entfernen Sie den Kopf, Leber und Darm aus dem Embryo und legen Sie den restlichen Teil in einer 12-Well-Gewebekulturplatte enthält PBS (pH 7,4).
- Übertragen Sie die Embryo Körper in einen anderen 12 Well-Platte mit Trypsin EDTA und in kleine Stücke (ca. 1 mm 3) mit einer sterilen Rasierklinge und Schere. Inkubieren Häckselgut mit 5 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C.
- Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 1 ml fötales Rinderserum (FBS), um die geschnittenen Embryonen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg Geschwindigkeit für 10 Minuten, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, das Pellet mit 1 ml warmem DMEM-Medium, und all der Inhalt in einer 10 cm Schale mit 10 ml DMEM (mit 20% FBS und 2X Penicillin / Streptomycin ).
- Ändern Sie das Medium jeden Tag für zwei Tage. Kultur die Zellen, bis die gewünschte ZelleZahl erreicht ist.
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Representative Results
Die Tumorprogression Stadium, in dem das Tier zu opfern, hängt von der jeweiligen Studie und IACUC Richtlinien. In 1A einer 100 Tage alte C57BL / 6-Maus mit der Maus-Mammatumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT) wurde nach drei Monaten geopfert. Die Haut wurde von dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere geöffnet und die Haut wurde festgenagelt, um einfachen Zugang zu Organen, wie in 1B gezeigt, zu ermöglichen. Dies erlaubt einen einfachen Zugang zum Tumor, der in 1C erhalten. Die primären Zellen aus den Tumoren erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1D visualisiert. Seit vielen Genen vermitteln Brustkrebsmetastasen in der Lunge 1 extrahierten wir die Lunge (2A), um die metastatischen Prozess zu untersuchen. Die Lunge wurde mit Z-fix aufgepumpt und mit Tusche (2B), um die Tumorknötchen visualisieren gefärbt. Figur 3 zeigt embryonalen Maus fibr den Oblast von FVB-Stamm Maus-Embryonen isoliert.
Abbildung 1. Herstellung von primären Zellen von Brusttumoren. (A) Ein 100 Tage alte weibliche Maus mit dem Polyoma Middle T-Antigen (PyMT) wurde geopfert. (B) Die Haut wurde festgenagelt, um einen einfachen Zugang zu den Mamma-Tumor zu ermöglichen. (C) Das Brusttumor wurde von der Tier geschnitten . (D) Die isolierten primären Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt kultiviert (Maßstab: 100 & mgr; M). Die Bilder zeigen die Zellen am Tag 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Maus-Lunge-Extraktion, um Lungenmetastasen zu visualisieren. (Maßstab: 500 & mgr; M) (A) Die Lunge wurde mit Z-fix und (B) mit Tusche gefärbt, um Tumorknoten visualisieren aufgeblasen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3. Vorbereitung embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) aus Maus Embryonen MEF-Zellen wurden aus einer FVB Mausembryo (Maßstab: 100 & mgr; M) extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll ist zur Isolierung von primären Zellen aus einer neuen Maus-Tumor. Lysate aus diesen Verfahren hergestellt werden, sind nützlich für die Protein-, DNA- und RNA-Analyse. Krebszellen aus dem primären Brusttumor metastasieren häufig zum Gehirn, Lunge und Knochen 1. Eingeschlossen ist eine Technik, die zur Detektion von Lungenmetastasen zu extrahieren. Anfärben der Lunge mit einem Tintenfleck wird zur Visualisierung von Tumorknoten zu ermöglichen, wie in 2B zu sehen. Zur Festsetzung der Lunge in Z-fix-Lösung wird uns erlauben, Teile der Lunge zu machen, und Fleck mit Antikörpern, die angemessen, metastasiertem Mechanismen zu studieren sind. Ebenfalls enthalten ist ein Protokoll für die Isolierung von embryonalen Maus-Fibroblasten. Dies ist nützlich für den Vergleich der Genexpression von der primären Tumorzellen mit der embryonalen Fibroblasten in der gleichen Tierart.
Bei der Herstellung von Primärelementen und MEFs, ist der wichtigste Schritt die Hacken des Materials. Ohne die richtige Aufteilung, low Zellzahl erreicht wird. Wenn eine niedrige Zellzahl erreicht ist, kann noch Protokoll folgen, aber die Zellen benötigen, um für eine längere Zeitdauer kultiviert werden .. In der Lunge Extraktion, ist die richtige Färbung und Entfärbung wesentlich, damit Tumorknotens Visualisierung zu ermöglichen. Um RNA / Protein aus der Lunge zu extrahieren, wird es gut, Lunge, die ungefärbten und unbefestigten sind zu verwenden. Jedoch kann RNA aus fixierten Geweben sowie 8 extrahiert werden.
Da der metastasierten Stadium von Brustkrebs stellt die größte Bedrohung für die betroffene Person 2, ist es wichtig, dass alle Komponenten des Brusttumorgenese zu visualisieren. Eine große Herausforderung für das Verständnis Mechanismen von Brustkrebs Progression ist die Verfügbarkeit von Modellen, die das Fortschreiten der Erkrankung 9 rekapitulieren. Aufklärung der molekularen Mechanismen von Brusttumorentstehung und Metastasierung sind durch Verwendung von Tiermodellen, wie Mäuse 9, 10 erzielt. Die gebräuchlichsten Methoden zur Induzierung mouse Brusttumoren gentechnisch den Mäusen mit prädisponierenden Mutationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, die Einführung Karzinogene und Einspritzen sehr invasiv Krebszellen 10-12. Erhalten Tumoren können dann weiter für die Genexpression analysiert werden. Für Brustkrebs-Forschung, ist Genexpressions wichtig, da sie das klinische Ergebnis von Patienten 13 prognostiziert.
Einige Einschränkungen gibt es mit der Maus-Modell zu studieren Mammatumorgenese. Obwohl Mäuse teilen molekularen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen, sie nicht immer zu rekapitulieren alle Aspekte des menschlichen Krankheiten 5. Dies sollte bei der Verwendung bestimmter gentechnisch veränderten Mäusen in Betracht gezogen werden. Insgesamt Mausmodelle bieten einen realistischeren Weg, um Maus-Mammatumorgenese über andere anwesende Modelle wie Gewebekultur und isolierten menschlichen Tumoren zu analysieren. Zusammengenommen werden, ermöglicht dieses Protokoll für die weitere Untersuchung der verschiedenen Aspektevon Brusttumorgenese.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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