Protocol
Toutes les expériences de souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation comités (IACUC) de LSU School of Medicine. Tous les instruments doivent être stérilisés à l'autoclave avant la dissection.
1. Préparation des cellules primaires de tumeurs mammaires de souris
- Utiliser un modèle de souris qui a été génétiquement modifié avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (de la souris MMTV-PyMT transgénique), qui développent spontanément des tumeurs comme décrit précédemment 6.
- Sacrifiez souris avec l'isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d'éthanol pour assurer un environnement stérile (figure 1A).
- Ouvrir la peau à partir de la zone de l'orifice urétral pour le cou avec des ciseaux. Epingler la peau vers le bas pour permettre un accès facile pour les organes (Figure 1B).
- Isoler la tumeur mammaire du sein et laver avec de froid phosphate stérile saline tamponnée (PBS) (pH 7,4) (figure 1C).
- Transférer la tumeurune plaque de culture tissulaire de 10 cm stérile et couper avec des ciseaux et une lame de rasoir stérile à 1 mm environ trois morceaux. Les étapes suivantes devraient être effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile.
- Incuber le tissu tumoral hachée avec de la collagénase dissous dans un milieu de DMEM exempt de sérum à une concentration finale de 1 mg / ml sur une bascule pendant 2 heures à 37 ° C. Centrifuger la suspension de tissu de la tumeur pendant 3 min à 200 x g.
NOTE: L'incubation de la collagénase est essentiel pour la dissociation enzymatique du tissu. - Jeter le surnageant et laver le précipité trois fois avec du PBS (pH 7,4) par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g. Après le lavage final, décanter le surnageant.
- Remettre en suspension le tissu avec 2 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C tout en déplaçant en nutation. Centrifuger la suspension pendant 3 min à 200 xg et répéter les lavages.
- Remettre en suspension le culot de tissus dans un milieu de croissance normal (DMEM, 10% de FBS, 2 x pen / strep) sur une plaque de 10 cm. Changementles médias tous les jours pour les 3 prochains jours. des cellules de culture jusqu'à ce que le nombre de cellules désiré soit obtenu.
REMARQUE: Environ 1x10 7 cellules sera isolé de cette procédure. D'autres modèles de tumorigenèse mammaire de la souris, telles que MMTV-Neu, donnent un rendement plus faible de cellules par rapport à MMTV-PyMT. Lors de l'utilisation des modèles qui produisent un rendement plus faible, il est avantageux de commencer avec un plus grand cellules tumorales et de culture plus longues.
2. Souris Lung Extraction de visualiser métastases pulmonaires
- Avant l'extraction du poumon, le foie et supprimer le diaphragme. Déloger les côtes sans déranger les poumons.
- Avec une belle paire de ciseaux, ouvrez la partie supérieure de la trachée, qui est plus proche de la veine jugulaire.
- L'utilisation d'un cathéter, injecter un agent tel que 1 ml de Z-fixage ou l'encre de Chine à travers la trachée pour remplir les poumons (Figure 2A). Incluez le Z-fix Poumons dans de la paraffine.
- De-tache les poumons injectés avec l'encre de Chine dans la solution de Fekete(100 ml 70% d'alcool, 10 ml de formaline à 10% tamponnée et 5 ml d'acide acétique glacial) pendant 5 min. Définir les nodules tumoraux dans des sites secondaires avec a ≥ 0,5 mm de diamètre, déterminer que les nodules métastases.
NOTE: En raison de l'obstruction des bronches et des bronchioles par la tumeur, nodules tumoraux ne peuvent pas absorber 15% d'encre de Chine, et donc le tissu pulmonaire normale seront en noir et nodules tumoraux seront de couleur blanche 7. Cela permettra la visualisation des nodules tumoraux individuels (Figure 2B).
3. Préparation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) à partir embryons de souris
- Sacrifiez souris enceintes avec l'isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d'éthanol pour assurer un environnement stérile.
- Ouvrir la peau à partir de la zone de l'orifice urétral pour le cou avec des ciseaux et isoler les embryons de l'utérus.
- Veillez à ne pas déranger les embryons lors de l'ouverture de la peau.
- Retirez les cornes utérines et les rincer à ste froidrile PBS (pH 7,4).
- Séparer l'embryon de son placenta très soigneusement et placer des embryons dans une plaque de 10 cm contenant PBS glacé (pH 7,4).
- Retirer la tête, le foie et l'intestin de l'embryon et placer la partie restante dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits contenant du PBS (pH 7,4).
- Transférer le corps de l'embryon à un autre 12 plaque puits contenant la trypsine EDTA et les couper en petits morceaux (~ 1 mm 3) à l'aide d'une lame de rasoir et les ciseaux stérile. Incuber le matériau haché avec 5 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
- Inactiver la trypsine par addition de 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) pour les embryons hachées. Centrifugeuse la suspension à 200 vitesse de g pendant 10 min, retirez avec précaution le surnageant, remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu de DMEM chaud et transférer tout le contenu dans un plat de 10 cm contenant 10 ml de DMEM (avec 20% de FBS et 2X pénicilline / streptomycine ).
- Changer le support chaque jour pendant deux jours. Culture des cellules jusqu'à ce que la cellule souhaitéenombre est atteint.
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Representative Results
Le stade de progression de la tumeur à laquelle sacrifier l'animal dépend de l'étude particulière et des lignes directrices du IACUC. Dans la figure 1A, 100 aujourd'hui âgé de souris C57BL / 6 avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (MMTV-PyMT) a été sacrifié à trois mois. La peau a été ouvert à partir de la zone de l'orifice de l'urètre à la nuque avec des ciseaux et de la peau a été clouée au sol pour permettre un accès facile à des organes comme le montre la figure 1B. Cela a permis un accès facile à la tumeur que l'on a obtenu à la figure 1C. Les cellules primaires obtenues à partir de tumeurs sont visualisés sur la figure 1D. Etant donné que de nombreux gènes médiation sein métastase de cancer du poumon à 1, nous avons extrait les poumons (Figure 2A) pour étudier le processus métastatique. Le poumon a été gonflé avec Z-fixage et colorées avec l'encre de Chine (figure 2B) pour visualiser les nodules tumoraux. La figure 3 montre souris embryonnaire fibr oblasts isolé à partir d'embryons de souris FVB souche.
Figure 1. Préparation des cellules primaires de tumeurs du sein. (A) 100 jours vieille souris femelle avec le Polyome Moyen T-Antigen (PyMT) a été sacrifié. (B) La peau a été clouée au sol pour permettre un accès facile à la tumeur mammaire. (C) La tumeur du sein a été coupé de l'animal . (D) Les cellules primaires isolées ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal (barre d'échelle: 100 um). Les images affichent les cellules au jour 3. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. d'extraction du poumon de la souris pour visualiser les métastases du poumon. (A) Le poumon a été gonflé avec Z-fix et (B) colorées avec l'encre de Chine pour visualiser nodules tumoraux (de la barre d'échelle: 500 um). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3. Préparation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) à partir de cellules MEF embryons de souris ont été extraites d'un embryon de souris FVB (barre d'échelle: 100 M). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole est destiné à isoler des cellules primaires à partir d'une tumeur de souris frais. Les lysats préparés à partir de ce procédé sont utiles pour les protéines, l'ADN et analyse de l'ARN. Les cellules cancéreuses de la tumeur primaire du sein métastasent souvent vers le cerveau, les poumons et les os 1. Inclus est une technique pour extraire le poumon pour la détection des métastases. La coloration du poumon avec une tache d'encre permettra la visualisation des nodules tumoraux comme on le voit sur la figure 2B. Fixant les poumons en solution Z-fix va nous permettre de faire des sections de poumons, et les taches avec des anticorps qui sont appropriés pour étudier les mécanismes métastatiques. On y trouve aussi un protocole pour l'isolement des fibroblastes embryonnaires de souris. Ceci est utile pour comparer l'expression de gènes de cellules tumorales primaires avec les fibroblastes embryonnaires de la même espèce animale.
Dans la préparation de cellules primaires et les MEF, l'étape la plus critique est le hachage de la matière. Sans ventilation adéquate, lole nombre de cellules w sera atteint. Pour un faible nombre de cellules est obtenue, le protocole peut encore être suivi, mais les cellules devront être cultivées pendant une période de temps plus longue .. Dans l'extraction du poumon, la coloration et décoloration approprié est essentielle pour permettre la visualisation nodule de la tumeur. Pour extraire l'ARN / protéine à partir de poumons, il sera bon d'utiliser les poumons qui sont non colorées et non fixée. Cependant, l'ARN peut être extrait à partir de tissus fixés et 8.
Étant donné que le stade métastatique du cancer du sein représente le plus grand danger pour la personne affectée 2, il est important de visualiser toutes les composantes de la tumorigenèse mammaire. Un défi majeur dans les mécanismes de la progression du cancer du sein est la compréhension de la disponibilité de modèles qui récapitulent la progression de la maladie 9. L'élucidation des mécanismes moléculaires de la tumorigenèse du sein et de métastases sont obtenus en utilisant des modèles animaux, tels que des souris, 9 10. Les moyens les plus courants pour induire mouse tumeurs mammaires sont génétiquement ingénieur des souris avec des mutations d'oncogènes ou suppresseurs de tumeurs pré-élimination, en introduisant des agents cancérigènes, et en injectant des cellules cancéreuses hautement invasives 10-12. Les tumeurs obtenues peuvent ensuite être analysés en outre pour l'expression du gène. Pour la recherche sur le cancer du sein, le profil d'expression génique est importante car elle prévoit le résultat clinique du patient 13.
Certaines limitations existent avec le modèle de la souris de l'étude de la tumorigenèse mammaire. Bien que les souris partagent des similitudes moléculaires et physiologiques avec les humains, ils ne sont pas toujours récapitulent pas tous les aspects de maladies humaines 5. Ceci doit être pris en considération lors de l'utilisation de certaines souris génétiquement modifiées. Dans l'ensemble, des modèles de souris offrent un moyen plus réaliste pour analyser la tumorigenèse mammaire de souris par rapport aux autres modèles actuels tels que la culture des tissus et des tumeurs humaines isolées. Pris dans leur ensemble, ce protocole permet de poursuivre l'examen de différents aspectsde la tumorigenèse mammaire.
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Disclosures
Les auteurs ont aucune divulgation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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