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Medicine

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

Published: May 20, 2015 doi: 10.3791/52609
* These authors contributed equally

Protocol

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comités Use (IACUC) de la Escuela de Medicina LSU. Todos los instrumentos deben esterilizarse en autoclave antes de la disección.

1. Preparación de células primarias de tumores mamarios de ratón

  1. Use un modelo de ratón que fue manipulado genéticamente con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (ratón MMTV-PYMT transgénicos), que espontáneamente desarrollan tumores a lo descrito previamente 6.
  2. Sacrificar los ratones con isoflurano (99,9%) y el spray etanol al 75% para asegurar un ambiente estéril (Figura 1A).
  3. Abra la piel de la zona del orificio uretral al cuello con unas tijeras. Pin de la piel hacia abajo para permitir el fácil acceso a los órganos (Figura 1B).
  4. Aislar el tumor de mama mamaria y lavar con fosfato estéril frío solución salina tamponada (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
  5. Transferir el tumoruna placa de cultivo tisular de 10 cm estéril y cortar con una cuchilla de afeitar estéril y tijeras para aproximadamente 1 mm 3 piezas. Los pasos siguientes deben realizarse en una campana de flujo laminar estéril.
  6. Incubar el tejido tumoral picado con colagenasa disuelto en medio DMEM libre de suero a una concentración final de 1 mg / ml en un agitador durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar la suspensión de tejido tumoral durante 3 min a 200 x g.
    NOTA: La incubación colagenasa es esencial para la disociación enzimática del tejido.
  7. Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado 3 veces con PBS (pH 7,4) por centrifugación durante 3 minutos a 200 x g. Después del lavado final, se decanta el sobrenadante.
  8. Resuspender el tejido con 2 ml de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C mientras nutación. Centrifugar la suspensión durante 3 min a 200 xg y repetir los lavados.
  9. Resuspender el sedimento de tejido en medio de crecimiento normal (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) en una placa de 10 cm. Cambiolos medios de comunicación todos los días durante los próximos 3 días. Se obtienen células de cultivo hasta el número de células deseado.
    NOTA: Aproximadamente 1x10 7 células se aisló de este procedimiento. Otros modelos de la tumorigénesis mamaria de ratón, como MMTV-Neu, dan menor rendimiento de las células en comparación con MMTV-PYMT. Al utilizar los modelos que producen un menor rendimiento, es beneficioso para comenzar con un tumor y cultura más grandes células más largas.

2. Extracción de pulmón de ratón para visualizar pulmón metástasis

  1. Antes de la extracción de pulmón, eliminar el hígado y el diafragma. Desalojar las costillas sin molestar a los pulmones.
  2. Con un buen par de tijeras, abrir la parte superior de la tráquea, que está más cerca de la vena yugular.
  3. El uso de un catéter, se inyecta un agente tal como 1 ml de Z-fix o India tinta a través de la tráquea para llenar los pulmones (Figura 2a). Incrustar el Z-fix Pulmones en parafina.
  4. De-mancha los pulmones inyectados con tinta china en la solución de Fekete(100 ml 70% de alcohol, 10 ml de formalina al 10% tamponada, y 5 ml de ácido acético glacial) durante 5 min. Definir nódulos tumorales en los sitios secundaria con un ≥ 0,5 mm de diámetro, determinar los nódulos como metástasis.
    NOTA: Debido a la obstrucción bronquios y bronquiolos por el tumor, nódulos tumorales no pueden absorber 15% tinta china, y por lo tanto el tejido pulmonar normal serán en negro, y nódulos tumorales serán de color blanco 7. Esto permitirá la visualización de nódulos tumorales individuales (Figura 2B).

3. Preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de embriones de ratón

  1. Sacrificar los ratones embarazadas con isoflurano (99,9%) y el spray etanol al 75% para asegurar un ambiente estéril.
  2. Abra la piel de la zona del orificio uretral al cuello con unas tijeras y aislar los embriones desde el útero.
  3. Tenga cuidado de no molestar a los embriones al abrir la piel.
  4. Retire los cuernos uterinos y enjuague en ste fríairritar a PBS (pH 7,4).
  5. Separar el embrión de su placenta muy cuidadosamente y colocar los embriones en una placa de 10 cm que contiene hielo frío PBS (pH 7,4).
  6. Retire la cabeza, el hígado y el intestino del embrión y colocar la porción restante en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos que contenía PBS (pH 7,4).
  7. Transferir el cuerpo embrión a otra placa de 12 pocillos que contenía EDTA tripsina y cortado en trozos pequeños (~ 1 mm 3) utilizando una cuchilla de afeitar estéril y tijeras. Incubar el material picado con 5 ml de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C.
  8. Inactivar la tripsina mediante la adición de 1 ml de suero bovino fetal (FBS) a los embriones picadas. Centrifugar la suspensión a 200 la velocidad xg durante 10 minutos, retire con cuidado el sobrenadante, resuspender el precipitado con 1 ml de medio DMEM cálido y transferir todo el contenido de un plato de 10 cm que contiene 10 ml de DMEM (con 20% de SFB y 2X penicilina / estreptomicina ).
  9. Cambie el medio todos los días durante dos días. Cultivar las células hasta celda deseadase alcanza número.

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Representative Results

La etapa de progresión del tumor en la que sacrificar el animal depende del estudio en particular y las directrices IACUC. En la Figura 1A, un viejo ratón C57BL / 6 100 días con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (MMTV-PYMT) fue sacrificado a los tres meses. La piel se abre desde el área del orificio uretral al cuello con las tijeras y la piel se fijó hacia abajo para permitir el fácil acceso a los órganos como se muestra en la Figura 1B. Esto permitió un fácil acceso al tumor que se obtuvo en la Figura 1C. Las células primarias obtenidas a partir de los tumores se visualizan en la Figura 1D. Dado que muchos genes median la metástasis del cáncer de mama al pulmón 1, se extrajeron los pulmones (Figura 2A) para estudiar el proceso metastásico. El pulmón se infla con Z-fix y se tiñó con tinta china (Figura 2B) para visualizar los nódulos tumorales. La Figura 3 muestra fibr ratón embrionario provincias aisladas de embriones FVB cepa de ratón.

Figura 1
Figura 1. Preparación de células primarias de tumores de mama. (A) Un viejo ratón hembra 100 días con el Polioma Medio T-antígeno (PYMT) fue sacrificado. (B) La piel fue inmovilizado para permitir un fácil acceso al tumor mamario. (C) El tumor de mama se redujo de los animales . (D) Las células primarias aisladas se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos (barra de escala: 100 M). Las imágenes muestran que las células en el día 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. extracción de pulmón de ratón para visualizar la metástasis de pulmón. (A) El pulmón se infla con Z-fix y (B) teñido con tinta china para visualizar nódulos tumorales (barra de escala: 500 M). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
. Figura 3. Preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de embriones de ratón MEF células fueron extraídas de un embrión de ratón FVB (barra de escala: 100 M). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo es para el aislamiento de células primarias a partir de un tumor de ratón fresco. Los lisados ​​preparados a partir de este método son útiles para la proteína, el ADN y análisis de ARN. Las células cancerosas del tumor primario de mama a menudo metástasis en el cerebro, pulmón y hueso 1. Incluido es una técnica para extraer el pulmón para la detección de metástasis. La tinción del pulmón con una mancha de tinta permitirá la visualización de nódulos tumorales como se ve en la Figura 2B. La fijación de los pulmones en solución Z-fix nos permitirá hacer secciones de los pulmones, y la tinción con anticuerpos que son apropiados para estudiar los mecanismos de metástasis. También se incluye un protocolo para el aislamiento de fibroblastos embrionarios de ratón. Esto es útil para comparar la expresión génica de las células tumorales primarias con el fibroblasto embrionario en el mismo tipo de animal.

En la preparación de las células primarias y MEFs, el paso más crítico es que el picado del material. Sin desglose adecuado, lose logrará el número de células w. Si se consigue un bajo recuento de células, el protocolo aún puede ser seguido, pero tendrá que ser cultivado durante un período de tiempo más largo .. En la extracción de pulmón de las células, la tinción y la decoloración adecuada es esencial para permitir la visualización nódulo tumoral. Para extraer ARN / proteína de los pulmones, que será bueno para usar los pulmones que son sin mancha y sin fijar. Sin embargo, el ARN se puede extraer de los tejidos fijos, así 8.

Desde la etapa de metástasis de cáncer de mama representa la mayor amenaza a la persona afectada 2, es importante visualizar todos los componentes de la tumorigénesis de mama. Un reto importante en la comprensión de los mecanismos de la progresión del cáncer de mama es la disponibilidad de modelos que recapitular la progresión de la enfermedad 9. La elucidación de los mecanismos moleculares de la tumorigénesis de mama y metástasis se logran mediante el uso de modelos animales, tales como ratones 9, 10. Las formas más comunes para inducir moustumores mamarios e ingeniero son genéticamente a los ratones con mutaciones de oncogenes o supresores de tumores pre-eliminación, la introducción de sustancias cancerígenas, y la inyección de células de cáncer altamente invasivos 10-12. Tumores obtenidos pueden ser analizados para la expresión génica. Para la investigación del cáncer de mama, de perfiles de expresión génica es importante, ya que predice la evolución clínica del paciente 13.

Existen algunas limitaciones con el modelo de ratón de estudiar la tumorigénesis mamaria. Aunque los ratones comparten similitudes moleculares y fisiológicos con los seres humanos, no siempre se recapitulan todos los aspectos de las enfermedades humanas 5. Esto debe tenerse en cuenta cuando se utilizan ciertos ratones modificados genéticamente. En general, los modelos de ratón proporcionan una forma más realista para analizar ratón mamaria tumorigénesis sobre otros modelos actuales como el cultivo de tejidos y tumores humanos aislados. En conjunto, este protocolo permite la investigación posterior de los diferentes aspectosde la tumorigénesis de mama.

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Disclosures

Los autores no tienen revelaciones.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone SH30243.01 Store at 4 °C
0.05% Trypsin-EDTA Life  technologies 25300-062 Store at – 20 °C
Collagenase Type IV Sigma-Aldrich C5138 Store at – 20 °C
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Pen Strep Life  technologies 15140-122 Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-106 Store at – 80 °C
Z-fix ANATECH #174 Store at RT
India Ink Yasutomo Store at RT
AERRANE (Isoflurane) Baxter NDC 10019-773-60 Store at RT
Ethanol EMD AX0441-3 Store at RT

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References

  1. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
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  3. Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
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Medicina Número 99 tumor mama pulmón primaria MEF embrión fibroblastos cáncer célula ratón
Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis
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Dong, S., Maziveyi, M., Alahari, S.More

Dong, S., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis. J. Vis. Exp. (99), e52609, doi:10.3791/52609 (2015).

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