Protocol
Todos os experimentos foram realizados em ratos de acordo com protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso (IACUC) da LSU School of Medicine. Todos os instrumentos devem ser autoclavados antes da dissecção.
1. Preparação de células primárias de tumores de mama mouse
- Use um modelo de camundongo que foi geneticamente modificada com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (mouse MMTV-PyMT-transgênica), que se desenvolvem espontaneamente tumores como descrito anteriormente 6.
- Sacrificar os ratinhos com isoflurano (99,9%) e pulverizar etanol 75% para assegurar um ambiente estéril (Figura 1A).
- Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura. Pin a pele para baixo para permitir fácil acesso aos órgãos (Figura 1B).
- Isolar o tumor da mama mamária frio e lava-se com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
- Transferência do tumor auma placa de cultura de 10 centímetros de tecido estéril e cortá-la com uma lâmina de barbear estéril e tesoura para aproximadamente 1 mm3 peças. Os passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de fluxo laminar estéril.
- Incubar o tecido tumoral picada com colagenase dissolvido em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1 mg / ml num agitador rotativo durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar a suspensão do tecido do tumor durante 3 min a 200 x g.
NOTA: A incubação da colagenase é essencial para a dissociação enzimática do tecido. - Descartar o sobrenadante e lavar o precipitado três vezes com PBS (pH 7,4) por centrifugação durante 3 minutos a 200 x g. Após a lavagem final, decanta-se o sobrenadante.
- Ressuspender o tecido com 2 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C, enquanto de nutação. Centrifugar a suspensão durante 3 minutos a 200 xg e repetir as lavagens.
- Ressuspender o sedimento de tecido em meio de crescimento normal (DMEM, FBS a 10%, 2X pen / strep) numa placa de 10 centímetros. Mudançaa mídia todos os dias para os próximos 3 dias. Células de cultura de células até que o número desejado é obtido.
NOTA: Aproximadamente 1x10 7 células serão isoladas a partir deste procedimento. Outros modelos tumorigénese mamário de ratinho, tal como MMTV-neu, dar menor rendimento de células quando comparado com MMTV-PyMT. Quando utilizando modelos que produzem um rendimento inferior, é benéfico para começar com um maior células tumorais e de cultura mais longos.
2. Rato Lung Extração de Visualize Lung Metástase
- Antes da extração do pulmão, do fígado e remover o diafragma. Desalojar as costelas sem perturbar os pulmões.
- Com um par de tesouras finas, abrir a parte superior da traqueia, que está mais perto da veia jugular.
- Usando um catéter, injectar um agente, tal como 1 ml de Z-fix ou Índia tinta através da traqueia para encher os pulmões (Figura 2A). Incorporar o Z-fix Pulmões em parafina.
- De-manchar os pulmões injetados com nanquim em solução de Fekete(100 ml de álcool a 70%, 10 mL de formalina a 10% tamponada, e 5 ml de ácido acético glacial), durante 5 min. Definir nódulos tumorais em locais secundários com um ≥ 0,5 mm de diâmetro, determinar os nódulos como metástase.
NOTA: Devido ao bloqueio brônquios e bronquíolos pelo tumor, nódulos tumorais não pode absorver 15% da tinta da Índia, e, assim, tecido pulmonar normal será em preto e nódulos tumorais será na cor branca 7. Isto irá permitir a visualização de nódulos tumorais individuais (Figura 2B).
3. Preparar mouse embrionárias fibroblastos (MEFs) a partir de embriões de camundongos
- Sacrifício camundongos grávidas com isoflurano (99,9%) e spray de etanol de 75% para garantir um ambiente estéril.
- Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura e isolar os embriões do útero.
- Tenha cuidado para não perturbar os embriões ao abrir a pele.
- Remova os cornos uterinos e enxaguá-los em ste friorile PBS (pH 7,4).
- Separa-se a partir de embriões placenta sua muito cuidadosamente e embriões lugar numa placa de 10 centímetros contendo PBS gelado (pH 7,4).
- Remover a cabeça, fígado e intestino a partir do embrião e colocar a parte restante em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo PBS (pH 7,4).
- Transferir o corpo do embrião para uma outra placa de 12 poços contendo EDTA de tripsina e cortados em pedaços pequenos (~ 1 mm3) utilizando uma lâmina de barbear esterilizada e tesoura. Incubar o material cortado com 5 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C.
- Inactivar a tripsina por adição de 1 ml de Soro Fetal Bovino (FBS) para os embriões picados. Centrifugar a suspensão a 200 xg velocidade durante 10 minutos, remover o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender o sedimento com 1 ml de meio DMEM morno e transferir todo o conteúdo para um prato de 10 centímetros contendo 10 ml de DMEM (com 20% de FBS e 2X de Penicilina / Estreptomicina ).
- Mudar a forma todos os dias durante dois dias. Cultura das células até célula desejadanúmero é alcançado.
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Representative Results
A fase de progressão do tumor em que a sacrificar o animal depende do estudo particular e orientações IACUC. Na Figura 1A, um velho C57BL / 6 do mouse 100 dias com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (MMTV-PyMT) foi sacrificado em três meses. A pele foi aberta a partir da área do orifício uretral para o pescoço com as tesouras e a pele foi fixado para baixo para permitir o fácil acesso a órgãos como mostrado na Figura 1B. Isto permitiu um fácil acesso ao tumor que foi obtido na Figura 1C. As células primárias obtidas a partir dos tumores são visualizados na Figura 1D. Uma vez que muitos genes medeiam a metástase do cancro da mama para o pulmão 1, extraiu-se que os pulmões (Figura 2A) para estudar o processo metastático. O pulmão foi inflado com Z-fix e corados com nanquim (Figura 2B) para visualizar os nódulos tumorais. A Figura 3 mostra rato FIBR embrionárias oblasts isolado a partir de embriões de camundongos FVB tensão.
Figura 1. Preparação de células primárias de tumores de mama. (A) A idade do rato fêmea com o Polioma Oriente T-Antigen (PyMT) 100 dias foi sacrificado. (B) A pele foi fixado para baixo para permitir fácil acesso ao tumor mamário. (C) O tumor de mama foi cortado do animal (D). As células primárias isoladas foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e antibióticos (barra de escala: 100? M). As imagens mostram as células no dia 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. extracção de pulmão do rato para visualizar a metástase pulmonar. (A) O pulmão foi inflado com Z-fix e (B) corada com tinta nanquim para visualizar nódulos tumorais (barra de escala: 500 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3. Preparar mouse embrionárias fibroblastos (MEFs) a partir de embriões de camundongos MEF células foram extraídas de um embrião de rato FVB (barra de escala: 100 M). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo é para isolar células primárias de um tumor fresco mouse. Os lisados preparados a partir de este método são úteis para a proteína, ADN e análise de ARN. As células cancerosas de tumor da mama primário frequentemente metastizar para o cérebro, pulmão e osso 1. Inclui-se uma técnica para extrair o pulmão para a detecção de metástases. A coloração do pulmão com uma mancha de tinta vai permitir a visualização dos nódulos tumorais como pode ser visto na Figura 2B. Que fixa os pulmões em solução Z-fix nos permitirá fazer secções de pulmões, e manchar com anticorpos que são apropriados para estudar mecanismos metastáticos. Também está incluído um protocolo para o isolamento de fibroblastos embrionários de ratinho. Isto é útil para comparar a expressão de genes das células de tumor primárias com o fibroblasto embrionário no mesmo tipo de animal.
Na preparação de células primárias e MEFs, a etapa mais crítica é a trituração do material. Sem repartição adequada, loo número de células W será alcançado. Se uma baixa contagem de células é conseguida, o protocolo pode ainda ser seguido, mas as células terão de ser cultivadas durante um longo período de tempo .. Na extracção do pulmão, a coloração adequada e descoloração é essencial para permitir a visualização do nódulo de tumor. Para extrair RNA / proteína a partir de pulmões, que vai ser bom para usar pulmões que são imaculado e não fixo. No entanto, o RNA pode ser extraído a partir de tecidos fixos, bem 8.
Desde a fase metastática do câncer de mama representa a maior ameaça para o indivíduo afetado 2, é importante visualizar todos os componentes de tumorigênese da mama. Um desafio importante na compreensão dos mecanismos de progressão do câncer de mama é a disponibilidade de modelos que recapitulam a progressão da doença 9. A elucidação dos mecanismos moleculares da tumorigénese da mama e de metástases são alcançados através da utilização de modelos animais, tais como ratinhos 9, 10. As formas mais comuns para induzir compue tumores mamários são manipular geneticamente os ratos com mutações de oncogenes ou supressores de tumor pré-disposição, a introdução de substâncias cancerígenas, e injetando células cancerosas altamente invasivos 10-12. Tumores obtidos podem depois ser ainda analisados quanto à expressão do gene. Para a investigação do cancro da mama, perfil de expressão gênica é importante, uma vez que prevê a evolução clínica do paciente 13.
Algumas limitações existem com o modelo do rato de estudar tumorigênese mamária. Embora ratinhos partes moleculares semelhanças fisiológicas e com seres humanos, eles nem sempre recapitular todos os aspectos de doenças humanas 5. Isto deve ser tomado em consideração quando se utiliza certos ratos geneticamente modificados. No geral, modelos de ratos proporcionam uma forma mais realista para analisar mamário de ratinho tumorigenesis sobre outros modelos atuais como cultura de tecidos e tumores humanos isolados. Tomados em conjunto, este protocolo permite a uma investigação mais aprofundada dos diferentes aspectostumorigenesis de mama.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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