Protocol
وقد أجريت جميع التجارب الماوس وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان الاستخدام (IACUC) من مدرسة LSU الطب. يجب تعقيمها جميع الصكوك قبل تشريح.
1. إعداد الخلايا الأولية من الفأر أورام الثدي
- استخدام نموذج الفأر الذي تم هندستها وراثيا مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (الماوس MMTV-PyMT المعدلة وراثيا)، الذي وضع بشكل عفوي الأورام كما هو موضح سابقا 6.
- التضحية الفئران مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة (الشكل 1A).
- فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص. دبوس الجلد أسفل للسماح سهولة الوصول إلى أجهزة (الشكل 1B).
- عزل الورم الثدي الثدي ويغسل مع الفوسفات العقيمة الباردة مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة) (الشكل 1C).
- نقل الورم إلىمعقمة لوحة الثقافة 10CM النسيج وختم عليها بشفرة حلاقة معقمة ومقص لحوالي 1 ملم 3 قطع. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة في معقم غطاء تدفق الصفحي.
- احتضان الأنسجة السرطانية المفروم مع كولاجيناز الذائبة في المصل وسائل الاعلام DMEM مجانا بتركيز نهائي من 1mg / مل على الكرسي الهزاز لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. الطرد المركزي تعليق نسيج الورم لمدة 3 دقائق في 200 ز س.
ملاحظة: حضانة كولاجيناز أمر ضروري لتفارق الأنزيمية للأنسجة. - تجاهل طاف ويغسل الراسب 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 ز س. بعد غسل النهائي، صب طاف.
- Resuspend والأنسجة مع 2 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حين الإيماء. الطرد المركزي تعليق لمدة 3 دقائق في 200 x ج وكرر يغسل.
- resuspend الكرية الأنسجة في متوسط النمو الطبيعي (DMEM، و 10٪ FBS، 2X القلم / بكتيريا) على طبق من ذهب 10CM. تغييروسائل الإعلام كل يوم لمدة 3 أيام القادمة. يتم الحصول على الخلايا الثقافة حتى عدد الخلايا المطلوبة.
ملاحظة: سيتم عزل ما يقرب من 1X10 7 خلايا من هذا الإجراء. نماذج تكون الأورام الثديية الماوس الأخرى، مثل MMTV-نوي، وإعطاء محصول أقل من خلايا بالمقارنة مع MMTV-PyMT. عند استخدام النماذج التي تنتج العائد أقل، فمن المفيد أن تبدأ مع أكبر ورم والثقافة الخلايا لفترة أطول.
2. الرئة ماوس استخراج لتصور الرئة الانبثاث
- قبل استخراج الرئة، وإزالة الكبد والحجاب الحاجز. طرد الأضلاع دون إزعاج الرئتين.
- مع زوج جيد من مقص، فتح الجزء العلوي من القصبة الهوائية والتي هي أقرب إلى حبل الوريد.
- باستخدام القسطرة، حقن عامل مثل 1 مل من Z-الإصلاح أو الهند الحبر من خلال القصبة الهوائية لملء الرئتين (الشكل 2A). تضمين Z-إصلاح الرئتين في البارافين.
- دي صمة عار على الرئتين حقن الحبر الهند في حل فيكيت ل(100 مل الكحول 70٪، و 10 مل من 10٪ من الفورمالين مخزنة، و 5 مل من حمض الخليك الجليدي) لمدة 5 دقائق. تحديد العقيدات ورم في مواقع الثانوية مع ≥ 0.5 مم في القطر، وتحديد العقيدات باسم الانبثاث.
ملاحظة: نظرا لانسداد الشعب الهوائية والقصيبة من الورم، العقيدات الورم لا يمكن أن تمتص 15٪ الهند الحبر، وبالتالي أنسجة الرئة الطبيعية ستكون باللون الأسود، وسوف العقيدات ورم يكون في اللون الأبيض 7. وهذا سوف يسمح التصور العقيدات الورم الفردية (الشكل 2B).
3. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) من أجنة الفئران
- التضحية الفئران الحوامل مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة.
- فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص وعزل الأجنة من الرحم.
- يجب الحرص على عدم تعكير صفو الأجنة عند فتح الجلد.
- إزالة قرون الرحم وشطف لهم في الظريف البارديثير غضب PBS (7.4 درجة الحموضة).
- فصل الجنين من المشيمة بدقة بالغة والأجنة مكان في لوحة 10CM تحتوي على الجليد الباردة PBS (7.4 درجة الحموضة).
- إزالة الرأس والكبد والأمعاء من الجنين ووضع الجزء المتبقي في 12 جيدا لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4).
- نقل جثة الجنين إلى 12 لوحة جيدا تحتوي على التربسين EDTA آخر ومقطعة إلى قطع صغيرة (~ 1 مم 3) باستخدام شفرة حلاقة معقمة ومقص. احتضان المواد المفروم مع 5 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تعطيل التربسين بإضافة 1 مل مصل بقري جنيني (FBS) للأجنة المفروم. الطرد المركزي تعليق على 200 سرعة x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة بعناية طاف، resuspend وبيليه مع 1 مل من المتوسط الدافئة DMEM ونقل جميع المحتويات إلى طبق 10CM تحتوي على 10 مل من DMEM (مع 20٪ FBS و2X البنسلين / الستربتوميسين ).
- تغيير المتوسطة كل يوم لمدة يومين. ثقافة الخلايا حتى الخلية المطلوبةيتم تحقيق الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مرحلة تطور الورم الذي للتضحية الحيوان تعتمد على دراسة معينة ومبادئ توجيهية IACUC. في الشكل 1A، وهو القديم C57BL / 6 الماوس 100 يوم مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (MMTV-PyMT) وضحى في ثلاثة أشهر. وافتتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص والجلد وتمركزها للسماح سهولة الوصول إلى الأجهزة كما هو مبين في الشكل 1B. هذا يسمح سهولة الوصول إلى الورم التي تم الحصول عليها في الشكل 1C. وتصور الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من الأورام في الشكل 1D. منذ العديد من الجينات توسط الثدي الانبثاث سرطان الرئة إلى 1، ونحن استخراج الرئتين (الشكل 2A) لدراسة عملية النقيلي. وقد تضخم الرئة مع Z-الإصلاح وملطخة الهند الحبر (الشكل 2B) لتصور العقيدات الورم. ويبين الشكل 3 الماوس fibr الجنينية أقاليم معزولة عن FVB أجنة سلالة الماوس.
الشكل 1. إعداد الخلايا الأولية من أورام الثدي. (A) فأر الإناث البالغ 100 يوم مع تورام الأوسط T-مستضد (PyMT) وضحى (B) والجلد وتمركزها للسماح سهولة الوصول إلى الورم الثديية. (C) وقطع ورم الثدي من الحيوان (D) وكانت الخلايا الأولية المعزولة المستزرعة في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية (شريط مقياس: 100 ميكرون). الصور تعرض الخلايا في اليوم 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 52609 / 52609fig2.jpg "/>
الشكل 2. استخراج الرئة ماوس لتصور الانبثاث الرئة. (A) وتضخم الرئة مع Z-الإصلاح و(B) ملطخة الهند الحبر لتصور العقيدات الورم (شريط مقياس: 500 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخراج الرقم 3. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) من أجنة الفئران MEF خلايا من جنين فأر FVB (شريط مقياس: 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول هو لعزل الخلايا الأولية من ورم الماوس الطازجة. لست] أعدت من هذه الطريقة مفيدة للبروتين، وتحليل الحمض النووي RNA. الخلايا السرطانية من الورم الثدي الرئيسي في كثير من الأحيان metastasize إلى الدماغ والرئة والعظام 1. وشملت هو تقنية لاستخراج الرئة للكشف عن ورم خبيث. وتلطيخ الرئة مع الحبر وصمة عار السماح لتصور العقيدات الورم كما رأينا في الشكل 2B. وتحديد الرئتين في حل Z-الإصلاح تسمح لنا لجعل أجزاء من الرئتين، وصمة عار مع الأجسام المضادة التي تكون مناسبة لدراسة آليات النقيلي. وشملت أيضا هو بروتوكول لعزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وهذا مفيد لمقارنة التعبير الجيني للخلايا السرطانية الأولية مع الخلايا الليفية الجنينية في نوع الحيوان نفسه.
في إعداد الخلايا الأولية وMEFS، الخطوة الأكثر أهمية هي تنميق للمادة. دون انهيار الصحيح، لووسيتم تحقيق عدد الخلايا ث. إذا تم التوصل إلى عدد خلايا منخفض، والبروتوكول لا يزال من الممكن اتباعها، ولكن سوف تحتاج الخلايا إلى أن تربيتها لفترة أطول من الزمن .. في استخراج الرئة، وتلطيخ السليم وdestaining أمر ضروري للسماح للورم العقيدات التصور. لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين من الرئتين، وسوف تكون جيدة لاستخدام الرئتين التي هي غير ملوثين وغير المثبتة. ومع ذلك، RNA يمكن استخلاصها من الأنسجة الثابتة فضلا 8.
منذ مرحلة النقيلي سرطان الثدي يشكل أكبر تهديد للفرد 2 المتضررين، من المهم أن تصور كل مكونات تكون الأورام الثدي. ويتمثل التحدي الرئيسي في فهم آليات تطور سرطان الثدي هو توافر النماذج التي تلخص تطور المرض 9. وتتحقق توضيح الآليات الجزيئية لتكون الأورام الثدي والانبثاث باستخدام نماذج حيوانية، مثل الفئران 9، 10. وأكثر الطرق شيوعا للحث على مذكرات التفاهمالبريد الأورام الثديية والمهندس وراثيا لفئران مصابة طفرات الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم والحيلولة دون و، وإدخال المواد المسببة للسرطان، وحقن الخلايا السرطانية الغازية غاية 10-12. ويمكن بعد ذلك الأورام التي تم الحصول عليها أن تحلل أيضا عن التعبير الجيني. لأبحاث سرطان الثدي، والتنميط التعبير الجيني مهم لأنه يتوقع نتائج السريرية للمريض 13.
توجد بعض القيود مع نموذج الفأر لدراسة تكون الأورام الثديية. على الرغم من أن الفئران تشترك التشابه الجزيئية والفيزيولوجية مع البشر، فإنها لا ألخص دائما كل جوانب الأمراض التي تصيب الإنسان 5. يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند استخدام بعض الفئران المعدلة وراثيا. عموما، نماذج الماوس توفر وسيلة أكثر واقعية لتحليل الماوس الثدي تكون الأورام على النماذج الحالية أخرى مثل زراعة الأنسجة والأورام البشرية معزولة. معا، هذا البروتوكول يسمح لمزيد من التحقيقات من جوانب مختلفةمن تكون الأورام الثدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم الإفصاحات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
