Protocol
모든 마우스 실험은 의학의 LSU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 악기는 해부하기 전에 멸균해야합니다.
마우스 유방 종양에서 일차 전지 1. 준비
- 유전자 이전 6 설명한 바와 같이 자발적 종양을 개발하는 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT 유전자 변형 마우스)로 설계 한 마우스 모델을 사용합니다.
- 아이소 플루 란 (99.9 %)와 쥐를 희생하고 무균 환경 (그림 1A)을 보장하기 위해 75 %의 에탄올을 스프레이.
- 가위로 목 요도 구멍의 영역으로부터 피부를 엽니 다. 기관 (도 1b)에 쉽게 접근 할 수 있도록 피부 아래에 핀.
- 유방 유방 종양을 분리하고 차가운 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) (PH 7.4) (그림 1C)로 씻는다.
- 에 종양 이동멸균 10cm 조직 배양 판은 약 1mm 3 개에 멸균 면도날과 가위로 잘라합니다. 후속 단계는 무균 층류 후드에서 수행되어야한다.
- 37 ° C에서 2 시간 동안 로커에서 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도에서 무 혈청 DMEM 배지에 용해 된 콜라게나 다진 종양 조직을 인큐베이션. g X 200에서 3 분 동안 종양 조직 현탁액을 원심 분리기.
참고 : 콜라게나 배양은 조직의 효소 분해에 필수적이다. - 뜨는을 취소하고 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 PBS (PH 7.4)와 침전물을 3 회 반복한다. 최종 세척 후, 상층 액을 가만히 따르다.
- 하면서 하향 경사 37 ° C에서 5 분 동안 트립신 EDTA 2 ㎖와 조직을 재현 탁. 200 XG에 3 분 동안 현탁액을 원심 분리기 및 세척을 반복합니다.
- 10cm 접시에 정상적인 성장 배지 (DMEM, 10 % FBS, 배 펜 / 연쇄상 구균)에서 조직 펠렛을 재현 탁. 변화미디어 다음 3 일 동안 매일. 목적하는 세포 수까지 배양 세포가 얻어진다.
참고 : 약 1 × 7 세포는이 절차에서 격리됩니다. MMTV-PyMT 비교할 때 이러한 MMTV-노이 같은 다른 마우스 유방 종양 모델은, 세포의 낮은 수율을 제공한다. 낮은 수율을 생성 모델을 사용하면, 더 이상 큰 종양 세포 배양으로 시작하는 것이 유리하다.
2. 마우스 폐 추출 폐 전이를 시각화
- 폐 추출에 앞서, 간 및 진동판을 제거한다. 폐를 방해하지 않고 갈비뼈을 제거.
- 위의 미세 쌍, 경정맥에 가까운 기관의 상부를 연다.
- 카테터를 사용하여, 폐 (도 2A)를 채우기 위해 기관을 통해 Z-수정 또는 인도 잉크 등의 1 ml의 에이전트를 주입. 포함 파라핀에 폐를 Z-해결.
- Fekete의 솔루션에 인도 잉크를 주입 폐를 드 얼룩(100 mL의 70 % 알코올, 10 % 포르말린 10 ml의 빙초산을 5 ml), 5 분. 직경 ≥ 0.5 mm의 보조 사이트에서 종양 결절을 정의 전이로 결절을 결정합니다.
주 : 종양에 의한 기관지 및 세기관지 막힘, 종양 결절이 15 % 먹물을 흡수 할 수없고, 따라서 정상적인 폐 조직이 검게 될 것이고, 종양 결절이 백색 7 인해 것이다. 이것은 개인의 종양 결절 (그림 2B)의 시각화 수 있습니다.
마우스 배아에서 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에를) 준비 (3)
- 아이소 플루 란 (99.9 %)이 임신 한 쥐를 희생하고 무균 환경을 보장하기 위해 75 %의 에탄올을 스프레이.
- 가위로 목 요도 구멍의 영역에서 피부를 열고 자궁에서 배아를 분리.
- 피부를 열 때 배아를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 자궁 뿔을 제거하고 차가운 인트에서 그들을 씻어PBS (PH 7.4)를 화나게.
- 얼음 차가운 PBS (PH 7.4)를 포함하는 10cm 접시에 매우 신중 태반과 장소 배아에서 배아를 분리합니다.
- 배아로부터 헤드, 간, 창자를 제거하고 PBS (PH 7.4)를 함유하는 12 웰 조직 배양 플레이트의 나머지 부분을 배치했다.
- 또 다른 12 웰 플레이트 포함 트립신 EDTA에 배아 체를 전송하고 멸균 면도날과 가위를 사용하여 작은 조각 (~ 1mm 3)로 절단. 37 ℃에서 5 분 동안 트립신 EDTA 5 ㎖와 다진 재료를 품어.
- 다진 배아 1 ml의 우 태아 혈청 (FBS)을 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 원심 분리기를 10 분 동안 200 XG 속도 현탁액을 조심스럽게 상층 액을 제거 따뜻한 DMEM 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 10 DMEM의 ㎖ (20 %의 FBS와 2X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유 10cm 접시에 모든 내용을 전송 ).
- 이틀 동안 매체 매일을 변경합니다. 문화 원하는 셀 때까지 세포수는 달성된다.
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Representative Results
동물을 희생에서 종양의 진행 단계는 특정 연구 및 IACUC 지침에 따라 달라집니다. 그림 1A, 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT)와 100 일된 C57BL / 6 마우스의 세 개월에 희생되었다. 피부 위 목 요도 오리피스의 영역으로부터 개방하고 피부는도 1b에 나타낸 바와 같이 기관에 쉽게 액세스 할 수 있도록 아래로 고정 하였다. 이는도 1C에서 얻어진 종양에 쉽게 접근 할 수 있었다. 종양에서 얻은 일차 전지는 그림 1D으로 시각화된다. 많은 유전자가 폐 한 유방암의 전이를 매개하기 때문에, 우리는 전이 과정을 연구하기 위해 폐 (도 2A)을 추출 하였다. 폐는 Z-수정과 팽창 종양 결절을 시각화하는 인도 잉크 (그림 2B)로 염색 하였다. 그림 3은 마우스 배아 FIBR를 보여줍니다 FVB 변형 마우스 배아에서 분리 oblasts.
유방 종양에서 일차 전지 1. 준비 그림. (A) 폴리오 중간 T 항원 (PyMT)와 100 일된 암컷 마우스를 희생시켰다. (B) 피부 유방 종양에 쉽게 액세스 할 수 있도록 아래로 고정 하였다. (C) 유방 종양 동물로부터 잘라 내고 . (100 μM 스케일 바) (D) 절연 일차 세포는 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청 및 항생제가 보충 된 (DMEM)에서 배양 하였다. 이미지는 하루에 3에서 셀을 표시 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 마우스 폐 추출 폐 전이를 시각화합니다. (스케일 바 : 500 μm의) (A) 폐는 Z-수정 및 종양 결절을 시각화하기 위해 인도 잉크로 염색 (B)로 팽창했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 마우스 배아에서 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) 준비 그림 3. MEF 세포 FVB 마우스 배아 (스케일 바 : 100 μm의)에서 추출 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 신선한 마우스의 종양에서 일차 전지를 분리입니다. 이 방법에서 준비 해물 단백질, DNA와 RNA를 분석하는 데 유용합니다. 기본 유방 종양에서 암 세포들은 뇌, 폐, 뼈 1로 전이. 포함 된 전이의 검출을위한 폐를 추출하는 기술이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이 잉크 얼룩 폐 염색하여 종양 결절의 시각화를 허용한다. Z-수정 용액에 폐를 고정하는 것은 우리가 폐의 섹션을 확인하고 전이 메커니즘을 연구에 적합한 항체로 염색 할 수 있습니다. 또한 마우스 배아 섬유 아 세포의 분리를위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이것은 동일한 종류의 동물의 배아 섬유 아세포와 일차 종양 세포의 유전자 발현을 비교하는 데 유용하다.
일차 전지와 MEFs에의 제조에서, 가장 중요한 단계는 재료의 닦지이다. 보라, 적절한 고장없이w 세포 수를 달성 할 것이다. 낮은 세포 카운트가 달성되는 경우, 프로토콜은 여전히 따라야 할 수 있지만 세포 폐암을 추출에서 .. 장기간 배양 할 필요가있을 것이다, 적절한 염색 및 탈색 종양 결절 시각화를 허용하는 것이 필수적이다. 폐에서 RNA / 단백질을 추출하려면, 그것은 흠없는 및 고정되지 않은 있습니다 폐를 사용하는 것이 좋을 것이다. 그러나, RNA는 고정 조직뿐만 아니라 (8)로부터 추출 될 수있다.
유방암의 전이 단계가 영향을받는 개인이 가장 큰 위협이 때문에, 유방 종양의 모든 구성 요소를 가시화하는 것이 중요하다. 유방암 진행의 메커니즘을 이해하는데 중요한 문제는 질병의 진행 9 요점을 되풀이 모델의 유용성이다. 유방 종양 발생 및 전이의 분자 메커니즘의 해명은 생쥐 9, 10, 동물 모델을 이용하여 달성된다. 가장 일반적인 방법은 유도 MOUS전자 유방 종양 유전자, 암 유전자 또는 종양 억제의 돌연변이를 사전 배치 발암 물질을 도입, 매우 침습적 인 암 세포 10-12 주입으로 쥐을 설계하고 있습니다. 획득 후, 상기 종양 유전자 발현을 분석 할 수있다. 이 환자 (13)의 임상 적 결과를 예측 이후 유방암 연구를 위해, 유전자 발현 프로파일이 중요하다.
몇 가지 제한 사항이 유방 종양 연구의 마우스 모델로 존재한다. 마우스는 인간과 분자 및 생리 학적 유사성을 공유하지만, 그들은 항상 인간의 질병 (5)의 모든 측면을 요점을 되풀이하지 않습니다. 특정 유전자 변형 마우스를 사용할 때 고려해야한다. 전반적으로, 마우스 모델은 조직 문화와 고립 된 인간의 종양과 같은 다른 현재 모델에 비해 마우스 유방 종양을 분석하기보다 현실적인 방법을 제공합니다. 함께 찍은,이 프로토콜은 서로 다른 측면의 추가 조사를 위해 수 있습니다유방 종양의.
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Disclosures
저자는 더 공개가 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
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