Protocol
Все эксперименты были мыши осуществляется в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональные животных уходу и использованию комитетов (IACUC) в ЛГУ в Школе медицины. Все инструменты должны быть в автоклаве до вскрытия.
1. Подготовка первичных клеток из опухоли молочной железы мыши
- Используйте модель мыши, которая была генной инженерии с помощью мыши опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT-трансгенной мыши), которые самопроизвольно развития опухоли, как описано ранее 6.
- Жертвовать мышей Isoflurane (99,9%) и спрей 75% этанола, чтобы обеспечить стерильную среду (фиг.1А).
- Открытие кожу от области отверстия мочеиспускательного канала к шее с помощью ножниц. Pin кожу, чтобы позволить легкий доступ к органам (рис 1б).
- Изолировать опухоли молочной груди и промыть холодной стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7,4) (рис 1С).
- Передача опухолистерильный 10 см культуре ткани пластины и нарезать его стерильным лезвием и ножницами, чтобы примерно 1 мм 3 штук. Последующие шаги должны быть выполнены в стерильном ламинарном боксе.
- Инкубируйте нарезанный опухолевой ткани коллагеназой, растворенного в бессывороточной DMEM среде при конечной концентрации 1 мг / мл на качалке в течение 2 часов при 37 ° С. Центрифуга опухолевой ткани суспензии в течение 3 мин при 200 х г.
Примечание: коллагеназы инкубации необходима для ферментативной диссоциации ткани. - Жидкость над осадком сливают и промывают осадок 3 раза PBS (рН 7,4) центрифугированием в течение 3 мин при 200 х г. После последней промывки, декантируют надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют ткани с 2 мл трипсина ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С, а нутационное. Центрифуга суспензии в течение 3 мин при 200g и повторить мытье.
- Ресуспендируют ткани пеллет в нормальной среде для роста (DMEM, 10% FBS, 2X ручка / стрептококк) на 10 см пластины. ИзменениеСМИ каждый день в течение следующих 3 дней. Культуры клеток до желаемого количества клеток получают.
Примечание: Приблизительно 1x10 7 клеток будут изолированы от этой процедуры. Другие модели онкогенеза молочной железы мыши, такие как MMTV-Neu, дать более низкий выход клеток по сравнению с MMTV-PyMT. При использовании модели, которые производят более низкий выход, это выгодно, чтобы начать с большим опухолевых клеток культуры и более.
2. Мышь легких Добыча визуализировать метастазов в легких
- До экстракции легких, печени удалить и диафрагму. Выбить ребра, не нарушая легкие.
- С тонкой ножницами, открыть верхнюю часть трахеи, которая ближе к яремной вены.
- Использование катетера, вводят агент, такой как 1 мл Z-исправления или тушью через трахею, чтобы заполнить легкие (фиг.2А). Вставить Z-Fix Легкие в парафин.
- Де-пятно легкие инъекционные тушью в растворе Фекете(100 мл 70% спирта, 10 мл 10% забуференном формалине и 5 мл ледяной уксусной кислоты) в течение 5 мин. Определить опухолевые узелки в средних сайтов с ≥ 0,5 мм в диаметре, определить узелки как метастаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за бронхов и бронхиол закупорки опухолью, опухолевые узлы не могут поглощать 15% тушь, и, таким образом, нормально легочной ткани будет в черном, и опухолевые узелки будет в белом цвете 7. Это позволит визуализации отдельных узелков опухоли (фиг.2В).
3. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) из эмбрионов мыши
- Жертвовать беременных мышей изофлураном (99,9%) и спрей 75% этанола, чтобы обеспечить стерильную среду.
- Открытие кожу от области отверстия мочеиспускательного канала к шее с помощью ножниц и изолировать эмбрионов из матки.
- Будьте осторожны, чтобы не беспокоить эмбрионов при открытии кожу.
- Снимите рога матки и промойте их в холодной стераздражать PBS (рН 7,4).
- Отделите эмбрион от ее плаценты очень тщательно и место эмбрионов в 10 см пластины, содержащей ледяной PBS (рН 7,4).
- Удалить голову, печень и кишечник от эмбриона и помещают оставшуюся часть в культуре ткани пластины 12 также, содержащей PBS (рН 7,4).
- Перевести тело эмбриона другой 12-луночный планшет, содержащий трипсин ЭДТА и нарезать небольшими кусочками (~ 1 мм 3) с использованием стерильного лезвия бритвы и ножницы. Инкубируйте нарезанный материал с 5 мл трипсина ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С.
- Деактивировать трипсина путем добавления 1 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) с нарезанной эмбрионов. Центрифуга суспензии при скорости 200 мкг в течение 10 мин, осторожно удалить супернатант, ресуспендируют осадок в 1 мл теплой среды DMEM и передавать все содержимое в 10 см чашку, содержащую 10 мл среды DMEM (20% FBS и 2X пенициллин / стрептомицин ).
- Изменить среды каждый день в течение двух дней. Культуры клеток до нужной ячейкедостигается число.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этап опухолевой прогрессии, при котором в жертву животное, зависит от конкретного исследования и принципов IACUC. На рисунке 1А, 100-дневного возраста C57BL / 6 мыши с мышь опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT) был принесен в жертву на три месяца. Кожа была открыта из области отверстия мочеиспускательного канала к шее с ножницами и кожа была прижата для обеспечения легкого доступа к органам, как показано на рисунке 1В. Это позволило легкий доступ к опухоли, которая была получена на рисунке 1C. Первичные клетки, полученные из опухолей визуализируются на рисунке 1D. Поскольку многие гены посредником метастазирования рака молочной железы в легкие 1, мы извлекли легкие (рис 2а) для изучения метастатического процесса. Легких была завышенной с Z-исправления и окрашивали тушью (рис 2B), чтобы визуализировать опухолевые узелки. Рисунок 3 показывает мышиных эмбриональных ФиБр областях при изолированы от FVB эмбрионов штамма мыши.
Рисунок 1. Подготовка первичных клеток из опухоли молочной железы. () 100 день назад женщина мыши с полиома Ближнем Т-антиген (PyMT) был принесен в жертву. (Б) кожи была прижата для обеспечения легкого доступа к опухоли молочной железы. (С) опухоли молочной железы был вырезан из животного . (D) Выделенные первичные клетки культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (масштабной линейки: 100 мкМ). Изображения отображаются клетки на 3-й день Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
загрузить / 52609 / 52609fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Добыча легких мышь, чтобы визуализировать легких метастазы. () Легких была завышенной с Z-исправления и (B), окрашенных тушью для визуализации опухоли узелков (масштабную линейку: 500 мкМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
. Рисунок 3. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) из эмбрионов мыши MEF клетки были извлечены из эмбриона мыши FvB (масштаб бар: 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол для выделения первичных клеток из свежей опухоли мыши. Лизаты получают из этого метода могут быть использованы для белка, ДНК и РНК анализа. Раковые клетки опухоли молочной железы первичной часто метастазируют в мозг, легкие и кости 1. В комплекте есть метод для извлечения легких для выявления метастазов. Окрашивание легких с чернилами пятна позволит визуализации опухолевых узелков, как показано на рисунке 2В. Крепление легкие в Z-Fix решения позволит нам сделать разделы легких, и пятно с антителами, которые подходят для изучения механизмов метастатических. Также включен протокол для выделения мышиных эмбриональных фибробластов. Это полезно для сравнения экспрессии генов из первичных опухолевых клеток с эмбрионального фибробласта в тот же тип животных.
При подготовке первичных элементов и MEFs, наиболее важным шагом является мясорубки материала. Без надлежащего пробоя, вотВт Количество клеток будет достигнута. Если низкое количество клеток достигается, протокол еще может следовать, но клетки должны быть культивировали в течение более длительного периода времени .. При экстракции легких, собственно, и окрашивание Обесцвечивание необходимо обеспечить опухоли узелков визуализации. Чтобы извлечь РНК / белок от легких, это будет хорошо, чтобы использовать легкие, которые чисто и нефиксированной. Тем не менее, РНК можно экстрагировать из фиксированных тканей, а 8.
Так метастатическим этап рака молочной железы представляет наибольшую угрозу для пострадавшего индивидуального 2, важно, чтобы визуализировать все компоненты молочной онкогенеза. Основная задача в понимании механизмов прогрессирования рака молочной железы является наличие моделей, которые воспроизводят прогрессирование заболевания 9. Выяснение молекулярных механизмов онкогенеза груди и метастазов достигается с помощью животных моделей, таких как мыши 9, 10. Наиболее распространенные способы, чтобы побудить МОВе опухоли молочной железы генетически инженер мышей с предрасполагающие мутации онкогенов или опухолевых супрессоров, представляя канцерогены, и потребителей инъекционных высоко инвазивных раковых клеток 10-12. Полученные опухоли затем может быть дополнительно проанализированы на экспрессию генов. Для исследования рака молочной железы, экспрессия генов профилирование является важным, поскольку она предсказывает клинический исход пациента 13.
Существуют некоторые ограничения с мышиной модели изучения опухолей молочной железы. Хотя мыши поделиться молекулярные и физиологические сходства с людьми, они не всегда воспроизводят все аспекты болезней человека 5. Это должно быть принято во внимание при использовании определенных генетически мышей. В целом, мышиные модели обеспечивают более реалистичный способ проанализировать мыши опухолей молочной железы по сравнению с другими настоящими моделями, такими как культура тканей и изолированных человеческих опухолей. Взятые вместе, этот протокол позволяет для дальнейшего исследования различных аспектовмолочной онкогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют раскрытия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
