Protocol
Alla mus experiment gjordes i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer (IACUC) i LSU School of Medicine. Alla instrument måste autoklaveras före dissekering.
1. Framställning av primära celler från mus brösttumörer
- Använd en musmodell som genetiskt var konstruerad med musbrösttumörvirus Polyoma USA T-antigen (MMTV-pymt-transgen mus), som spontant utvecklar tumörer som tidigare beskrivits 6.
- Offra möss med isofluran (99,9%) och spraya 75% etanol för att säkerställa en steril miljö (Figur 1A).
- Öppna huden från det område av urinrörsöppningen till halsen med en sax. Nåla huden ner för att möjliggöra enkel tillgång till organ (Figur 1B).
- Isolera bröstbrösttumör och tvätta med kall steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4) (Figur 1C).
- Överför tumören steril 10cm vävnadsodlingsplatta och hacka den med en steril rakblad och saxar till cirka 1 mm 3 stycken. Efterföljande steg bör utföras i en steril laminärt flöde.
- Inkubera den hackade tumörvävnad med kollagenas upplöst i serumfritt DMEM-medium vid en slutkoncentration av 1 mg / ml på en rocker under 2 h vid 37 ° C. Centrifugera tumörvävnad suspensionen under 3 min vid 200 x g.
OBS: Kollagenas inkubationen är väsentlig för enzymatisk dissociation av vävnaden. - Kasta bort supernatanten och tvätta fällningen tre gånger med PBS (pH 7,4) genom centrifugering under 3 minuter vid 200 x g. Efter den slutliga tvätten, dekantera supernatanten.
- Resuspendera vävnaden med 2 ml trypsin-EDTA för 5 minuter vid 37 ° C under det nuterande. Centrifugera suspensionen under 3 minuter vid 200 x g och upprepa tvättarna.
- Resuspendera vävnaden pelleten i normalt tillväxtmedium (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) på en 10 cm platta. Bytamedia varje dag för de kommande 3 dagar. Kultur celler tills önskad cellantal uppnås.
OBS: Cirka 1x10 7 celler kommer att isoleras från detta förfarande. Andra mus bröst tumorigenes modeller, såsom MMTV-Neu, ge lägre utbyte av celler jämfört med MMTV-pymt. Vid användning av modeller som ger en lägre avkastning, är det fördelaktigt att börja med en större tumör och kulturceller längre.
2. Mus Lung Extraction att Visualisera lungmetastas
- Före lung extraktion, avlägsnande av levern och membranet. Rubba revbenen utan att störa lungorna.
- Med en fin sax, öppnar den övre delen av luftstrupen som är närmare halsvenen.
- Med användning av en kateter, injicera ett medel såsom en ml Z-fix eller tusch genom luftstrupen för att fylla lungorna (Figur 2A). Bädda in Z-fix Lungorna i paraffin.
- De-färga lungorna injicerats med tusch i Fekete lösning(100 ml 70% alkohol, 10 ml 10% buffrad formalin och 5 ml isättika) under 5 minuter. Definiera tumörnoduli på sekundära platser med en ≥ 0,5 mm i diameter, bestämma knölar som metastaser.
OBS: På grund av luftrören och bronchiole blockering av tumören, kan tumörnoduli inte absorberar 15% tusch, och därmed normal lungvävnad kommer att vara i svart, och tumörnoduli kommer att vara i vit färg 7. Detta kommer att tillåta visualisering av individuella tumör noduler (figur 2b).
3. Förbereda Mouse Embryonala fibroblasts (MEF) från musembryon
- Offra dräktiga möss med isofluran (99,9%) och spraya 75% etanol för att säkerställa en steril miljö.
- Öppna huden från det område av urinrörsöppningen till halsen med sax och isolera embryon från livmodern.
- Var noga med att inte störa embryona när du öppnar huden.
- Ta bort livmodern hornen och skölj dem i kallt sterile PBS (pH 7,4).
- Separera embryot från dess moderkakan mycket noggrant och placera embryon i en 10 cm platta innehållande iskall PBS (pH 7,4).
- Avlägsna huvudet, lever och tarm från embryot och placera den återstående delen i en 12 brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande PBS (pH 7,4).
- Överför embryot kroppen till en annan 12 brunnar innehåller trypsin EDTA och skär i små bitar (~ 1 mm 3) med hjälp av en steril rakblad och saxar. Inkubera det hackade materialet med 5 ml trypsin EDTA under 5 minuter vid 37 ° C.
- Inaktivera trypsin genom tillsats av 1 ml fetalt bovint serum (FBS) till den hackade embryon. Centrifugera suspensionen vid 200 xg hastighet under 10 minuter, försiktigt bort supernatanten, suspendera pelleten med 1 ml varmt DMEM-medium och överföra allt innehåll till en 10cm skål innehållande 10 ml DMEM (med 20% FBS och 2X penicillin / streptomycin ).
- Ändra mediet varje dag under två dagar. Kultur cellerna tills önskad cellantalet uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tumörprogression skede för att offra djuret beror på den särskilda studier och IACUC riktlinjer. I Figur 1A, 100 dagar gammal C57BL / 6 mus med musbrösttumörvirus Polyoma USA T-antigen (MMTV-pymt) offrades på tre månader. Huden öppnades från området för urinrörets mynning till halsen med saxen och huden var nålas ner att ge enkel tillgång till organ som visas i figur 1B. Detta tillät enkel åtkomst till den tumör som erhölls i Figur 1C. De primära celler erhållna från tumörerna visualiseras i Figur 1D. Eftersom många gener förmedla bröstcancer metastaser till lungorna 1, vi extraherade lungorna (Figur 2A) för att studera metastaserande process. Lungan blåstes upp med Z-fix och färgades med tusch (Figur 2B) för att visualisera tumörnoduler. Figur 3 visar mus embryonala FIBR Oblasterna isoleras från FVB-stammen musembryon.
Figur 1. Beredning av galvaniska element från brösttumörer. (A) En 100 dagar gammal kvinnlig mus med Polyoma USA T-antigen (pymt) offrades. (B) Huden nålas ner att ge enkel tillgång till brösttumör. (C) Den brösttumör skars från djuret . (D) De isolerade primära celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och antibiotika (skalfältet: 100 | iM). Bilderna visar cellerna vid dag 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
upload / 52.609 / 52609fig2.jpg "/>
Figur 2. muslunga extraktion för att visualisera lungmetastas. (A) Lung blåstes upp med Z-fix och (B) färgades med tusch att visualisera tumörnoduli (skala bar: 500 M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3. Förbereda mus Embryonala fibroblasts (MEF) från musembryon MEF celler utvinns ur en FVB musembryo (skala bar: 100 M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är för att isolera primära celler från en frisk mus tumör. Lysat som framställts från detta förfarande är användbara för protein, DNA och RNA-analys. Cancerösa celler från den primära brösttumör metastaserar ofta till hjärnan, lungorna och ben 1. Inkluderat är en teknik för att extrahera lungan för detektering av metastaser. Färgning lungan med ett bläck fläck kommer att möjliggöra visualisering av tumörnoduli såsom framgår av fig 2B. Fastställande lungorna i Z-fix-lösning gör det möjligt för oss att göra delar av lungorna, och fläckar med antikroppar som är lämpliga att studera metastaserande mekanismer. Dessutom ingår ett protokoll för isolering av mus embryonala fibroblaster. Detta är användbart för jämförelse av genuttryck av de primära tumörcellerna med den embryonala fibroblaster i samma djur typ.
Vid framställning av galvaniska element och MEF, är det mest kritiska steget malningen av materialet. Utan ordentlig uppdelning, low mobilnummer kommer att uppnås. Om en låg cellräkning uppnås, kan protokollet fortfarande följas, men cellerna måste odlas under en längre tid .. I lungan utvinning, är väsentligt korrekt färgning och avfärgning för att möjliggöra för tumör knuta visualisering. För att extrahera RNA / protein från lungorna, kommer det vara bra att använda lungor som är ofärgade och ofixerade. Emellertid kan RNA extraheras från fasta vävnader samt 8.
Eftersom metastaserad stadium av bröstcancer utgör det största hotet mot den drabbade individen 2, är det viktigt att synliggöra alla komponenter i brösttumörbildning. En stor utmaning i att förstå mekanismerna bakom bröstcancer progression är tillgången på modeller som rekapitulera utvecklingen av sjukdomen 9. Klarläggande av de molekylära mekanismerna för brösttumörbildning och metastas uppnås genom att använda djurmodeller, såsom möss 9, 10. De vanligaste sätten att inducera mouse brösttumörer är genetiskt ingenjör mössen med predisponerande mutationer av onkogener eller tumörsuppressorer, införa cancerframkallande, och injicera mycket invasiva cancerceller 10-12. Erhållna tumörer kan sedan analyseras ytterligare för genexpression. För bröstcancerforskning, är genuttryck profilering viktigt eftersom det förutsäger kliniska resultatet av patienten 13.
Vissa begränsningar finns med musmodell för att studera brösttumörbildning. Även möss dela molekylära och fysiologiska likheter med människor de inte alltid sammanfatta alla aspekter av mänskliga sjukdomar 5. Detta bör beaktas vid användning av vissa genetiskt modifierade möss. Sammantaget musmodeller ger ett mer realistiskt sätt att analysera musbröst tumorgenes över andra nuvarande modeller såsom vävnadsodling och isolerade humana tumörer. Sammantaget gör det möjligt att ytterligare utredning av olika aspekter detta protokollbrösttumörbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
