Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52610
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2
1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

Introduction

يتم تعريف الفيروسية اللياقة البدنية التكرار بوصفه قدرة الفيروس على إنتاج ذرية المعدية في بيئة معينة 1 و هو عامل مساهم مهم في تحديد مدى انتشار فيروس متغير على مستوى السكان على مر الزمن 2. كما هو الحال في الدراسات المجراة اللياقة البدنية ليست مجدية مع الفيروسات المسببة للأمراض البشرية، مثل HIV-1، ومختلف في المختبر، وبحكم فيفو تكرار فحوصات اللياقة البدنية وضعت لدراسة الآثار المترتبة على اللياقة البدنية الناشئة عن مقاومة المخدرات والطفرات الهروب المناعة، قشوة والتطور السكان الفيروسي 3-6. بين فحوصات اللياقة البدنية المختلفة، يتم التعرف على المقايسات المنافسة النمو لانتاج تدابير أكثر حساسية وصالحة للاختلافات اللياقة البدنية، واثنين أو أكثر من المتغيرات الفيروسية تتنافس على السكان الخلية نفسه ضمن نفس الظروف البيئية ذاتها، كما يحدث في الجسم الحي 1،7،8. قبل بدء النمو التجارب المنافسة، والعديد من variabليه بحاجة إلى أن تحدد، بما في ذلك استخدام مولتيبليكيتييس مختلفة من العدوى (وزارة الداخلية)، ونسبة المدخلات الفيروسية، وتوقيت أخذ العينات لتحليلها. درسنا آثار هذه المعايير على حركية النمو الفيروسية وعلى نتائج التجارب المنافسة، وحددت العوامل الأساسية اللازمة لقياس قوة من HIV-1 للياقة البدنية في الثقافة خلية 9.

بالإضافة إلى المتغيرات الفحص، وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لquantitating المتغيرات الفيروسية في التجارب المنافسة النمو. وقد استخدم الجزء الأكبر 10،11 أو 12،13 نسيلي التسلسل لتحديد نسبة الفيروسات المتنافسة على أساس ترددات النوكليوتيدات في موقع (ق) من الفائدة. ويستمد اللياقة البدنية النسبية من التغيرات في هذه النسبة مع مرور الوقت. هذه الطريقة مريحة كما هي خدمات تسلسل الحمض النووي على نطاق واسع. أليل محددة مواز التسلسل (PASS) طريقة يمكن التسلسل في مواقع متعددة والكشف عن recombinants 14 15 أو مرادف الطفرات 4،16-18 كعلامات لتمييز الفيروسات المتنافسة بواسطة التسلسل، المقايسات تتبع مضاعف متغاير (HTA) 4،7،17،19 أو عكس في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل-النسخ الكمي (RT-QPCR) 15،16،18،20، وكلها يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لدراسة السلالات المنافسة بغض النظر عن تشابه تسلسل. مطلوب خطوة إضافية لإدخال العلامات إلى الجينومات الفيروسية ويتطلب فحص RT-QPCR أيضا الكواشف والأجهزة محددة. لقد وجدنا أن معظم سانجر عوائد التسلسل نتائج مماثلة 9.

بعد منافسة النمو، ويقدم الفيروسية اللياقة البدنية التكرار بوصفه اللياقة البدنية النسبية، أو نسبة اللياقة البدنية بين رالتعليم الجامعي المتغيرات الفيروسية. لياقة النسبية للفيروس يمكن تعريفها بأنها نسبة النهائية لنسخة الفيروسي تطبيع من قبل نسبة الأولية في اللقاح أو بالفرق صافي معدل نمو بين اثنين من الفيروسات المتنافسة. وجدنا أن الأسلوب الأخير، وذلك باستخدام نقاط البيانات الطولية فقط في مرحلة النمو الأسي، أنتج نتائج أقوى 9،20.

في المختبر يتم استخدام فحوصات اللياقة البدنية في المقام الأول لدراسة استنساخ البيولوجية 6-8 واستنساخ الجزيئية المعدية من HIV-1. هذا الأخير، ويجري قابلة للتلاعب الجيني، وغالبا ما تستخدم لدراسة تأثير على اللياقة البدنية من الطفرات معينة أو متواليات محددة من الفائدة 3-5،21،22. البروتوكولات التالية تصف سير العمل من وجهة بناء جديد كامل طول-1 فيروس نقص المناعة البشرية استنساخ الجزيئية المعدية باستخدام HIV-1 ناقلات تحتوي على علامة تسلسل، وإدخال طفرات من الفائدة، مما أسهم الفيروسية وإقامة حركية النمو الفيروسي، لأداء الفحص المنافسة النمو وحساب لياقة بدنية النسبية (الشكل 1).

باستخدام إجراءاتنا الأمثل، أنشأنا ثلاثة المؤتلف HIV-1 المسوخ وتحديد اللياقة البدنية تكرارها. شيد استنساخ الجزيئي المؤتلف أولا عن طريق استبدال هفوة-P24 منطقة الجين HIV-1 من pNL4-3، البلازميد التي تحتوي على طول الجينوم المعدية الكامل HIV-1 سلالة مختبر NL4-3، مع COTB الاصطناعية (مركز-وغالبا شجرة، سلالة B) تسلسل هفوة-P24 23 لإنشاء سلالة النموذج. تغييرات الأمينية واحدة (T186M، T242N، وI256V) ثم تم عرض لإنشاء ثلاثة استنساخ متحولة. وقد تنافس كل متحولة من فيروس النموذج الأولي لمراقبة تأثير اللياقة البدنية من كل طفرة في الخلفية الوراثية معين. المسوخ ثلاثة مستويات كما يتجلى ذلك من تكرار fsitness متفاوتة من خفيف إلى أقل بكثير من فيروس النموذج. وأفادت التقارير طفرة T242N سابقا أن يكون fitne المعتدلتكلف SS 24-26، على غرار النتيجة المعروضة في هذه الدراسة. لم يتم الإبلاغ عن تكلفة اللياقة البدنية الأخريين الطفرات سابقا.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول، كما هو موضح أدناه، لا يتضمن أي معلومات تعريفية المريض وبالتالي لا تعتبر أبحاث تجرى على البشر من قبل لجنة المراجعة المؤسساتية جامعة واشنطن أو شعبة المواد البشرية.

1. بناء همي HIV-1 NL4-3 النسخ الجزيئي

1.1) أسهب إدراج جزء DNA

  1. تصميم الاشعال خيالية. نصفين 5 'على حد سواء إلى الأمام وعكس الاشعال تحتوي على تسلسل ناقلات HIV-1، الذي سيتم إدراج جزء. يجب أن تحتوي على "نصف 3 من الاشعال نهاية تسلسل إدراج (الشكل 2). تأكد من أن تسلسل التمهيدي خيالية يحتفظ الإطارات الأصلية القراءة المفتوحة.
    1. استخدام الاشعال لا يقل عن 20 قواعد في الطول، مع درجة حرارة انصهار أكبر من أو تساوي 60 ° C، ~ 50٪ محتوى GC، والميل منخفضة لتشكيل dimers التمهيدي، heterodimers و / أو هياكل القاسي. تقييم هذه الخصائصباستخدام أداة على شبكة الإنترنت OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
  2. استخدام PCR 27 و الاشعال خيالية لتضخيم DNA إدراج (الشكل 2). لكل رد فعل PCR، استخدم 1X العازلة عالية الدقة، 0.2 ملي dNTPs، 1 U عالية الدقة DNA البلمرة، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي خيالية إلى الأمام، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي خيالية العكسي، و1 pg0 نانوغرام من عينة DNA تحمل المنطقة إدراج. إضافة درهم 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
  3. وضع خطوات الدراجات الحرارية على النحو التالي: إجراء خطوة تمسخ DNA الأولية في 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية. تضخيم مع 30 دورات تمسخ الحمض النووي في 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية وDNA الصلب في 3 ° C فوق أدنى درجة حرارة انصهار الاشعال اثنين لمدة 20 ثانية. إجراء التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. متجر المنتجات PCR في 4 درجات مئوية.
  4. خذ 5 ميكرولتر من المنتجات PCR منالخطوة السابقة وتشغيل agarose هلام الكهربائي 28.
    1. استخدام هلام 0.7٪ الاغاروز، 1X TAE العازلة (40 ملي تريس، خلات، 1 ملم EDTA)، و 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (EtBr) التركيز النهائي و1 كيلو بايت سلم كحجم DNA علامة. مجموعة الجهد مصدر الطاقة إلى 5 V / سم المسافة بين الأقطاب الكهربائية. وقف الكهربائي عندما يهاجر الصبغة التحميل من خلال حوالي 2/3 من طول هلام. تصور الجل باستخدام نظام توثيق هلام 28.
      ملاحظة: EtBr هو مادة مسرطنة مشتبه بهم ويجب التخلص منها بطريقة صحيحة، في لوائح المؤسسة. وينبغي دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على EtBr. تغيير القفازات جديدة بعد الانتهاء من معالجة EtBr التي تحتوي على مواد وقبل التعامل مع مواد أو معدات أخرى لمنع التلوث المتبادل.
  5. إذا تم الكشف عن واحد فقط الفرقة DNA مع حجم الموافق المنتج PCR المطلوب، وتنقية بقية المنتجات PCR باستخدام طقم التجارية مثل QIAquick PCR اتفاق تنقية كيتجي لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    1. إذا أخرى العصابات، غير محددة موجودة أيضا، استخدام ما تبقى من المنتج PCR لتشغيل إعدادي الكهربائي للهلام. استخدام نفس المعايير والشروط المحددة في الخطوة 1.1.4. تأكد من أن البئر هلام كبيرة بما فيه الكفاية لتحميل ~ 45 ميكرولتر من المنتجات PCR. قطع الفرقة المصالح واستخراج الحمض النووي من الجل باستخدام QIAquick عدة استخراج الهلام وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

1.2) اعتماد إدراج جزء في كامل طول المعدية HIV-1 النوع الفرعي B المتجهات (pNL4-3)

  1. استخدام منتجات PCR المنقى من الخطوة 1.1.5 كما الاشعال PCR. استخدام pNL4-3VifA 20 كما DNA القالب في رد فعل واحد PCR واستخدام pNL4-3VifB 20 كقالب في رد فعل الآخرين (الشكل 2). لكل رد فعل PCR، استخدم 1X العازلة عالية الدقة، 0.2 ملي dNTPs، 2 U عالية الدقة DNA البلمرة، 500 نانوغرام من الحمض النووي التمهيدي و 50 نانوغرام من الحمض النووي القالب في المجلد النهائيأوميا من 50 ميكرولتر. تعيين المعلمات الدراجات الحرارية ل: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 35 دورة في 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 48 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  2. إضافة 10 U من DPN الأول إلى 50 ميكرولتر من رد فعل PCR واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لهضم الحمض النووي القالب. تأكد من أن DNA البلازميد ما تكون معزولة عن مثيلة سلالة بكتيرية المختصة، على سبيل المثال، TOP10 الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا.
  3. استخدام DPN I هضم المنتج لتحويل الخلايا البكتيرية المختصة. استخدام تحول حرارة الصدمة مع TOP10 المختصة كيميائيا E. القولونية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لتحديد الخلايا البكتيرية التي تحتوي على البلازميد المؤتلف، استخدم لوريا مرق (LB) لوحات الثقافة التي تحتوي على 100 ملغ / L كربنيسيلين.
    1. اختيار ~ 10 المستعمرات فصل جيدا وينمو كل على حدة في 3 مل LB المتوسطة السائل تحتوي على 100 ملغ / L كربنيسيلين واحتضان عند 30 درجة مئوية فيشاكر O / N.
    2. استخدام QIAprep سبين Miniprep عدة لعزل DNA البلازميد من ثقافة السائل البكتيرية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. استخدام قيود مزدوجة الهضم 29 لتحديد ما إذا كان DNA البلازميد يحتوي على إدراج السليم. تأكد من أن أحد المواقع تقييد موجود فقط داخل المنطقة إدراج وموقع قيود أخرى موجودة مرة واحدة فقط في ناقلات HIV-1، خارج المنطقة إدراج.
    1. ملخص لا يقل عن 300 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في 10 ميكرولتر حجم رد الفعل النهائي. اختر مخازن قيود، درجة حرارة التحضين وفترة حضانة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للأنزيمات التقييد المحدد. تأخذ 9 ميكرولتر من هضم الحمض النووي وهلام المدى الكهربائي كما هو موضح في الخطوة 1.1.4. حدد البلازميدات المؤتلف التي لديها العصابات DNA من الأحجام المتوقعة.
  5. تأكيد سلامة تسلسل البلازميدات المؤتلف من قبل سانجر التسلسل. بينما نادرة، غير مرغوب فيهويمكن إدخال طفرة (الصورة) خلال ردود الفعل PCR.
    1. تسلسل كلا خيوط من الحمض النووي البلازميد. اتبع الإرشادات في الخطوة 1.1.1.1 لتصميم الاشعال التسلسل. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من وإلى الأمام وعكس الاشعال التسلسل يصلب لا يقل عن 50 سنة مضت المنبع والمصب في المنطقة إدراج في البلازميد المؤتلف، على التوالي.
    2. إرسال DNA البلازميد والاشعال التسلسل إلى موفر خدمة تسلسل الحمض النووي التجاري. تحضير عينة DNA والاشعال على النحو المحدد من قبل مزود الخدمة.
  6. جعل الأوراق المالية خالية من الذيفان الداخلي من DNA البلازميد تحور باستخدام عدة DNA البلازميد مجانا الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إعداد لا يقل عن 1 ميكروغرام من الذيفان الداخلي خالية DNA البلازميد لترنسفكأيشن في الخطوة التالية.

1.3) وضع على نطاق صغير الطفرات عن طريق الموقع الموجه الطفرات

  1. تصميم الاشعال مطفرة مع متداخلة إلى الأمام والاشعال تحتوي على mutat المطلوب عكسايون (ق). وضع قاعدة (ق) لتكون بديلا، وإدراجها، أو حذفها في منتصف الاشعال، ويحيط بها 10-15 قواعد متماثلة. اتبع الإرشادات في الخطوة 1.1.1.1.
  2. استخدام PCR لتجميع البلازميدات متحولة. لكل رد فعل PCR، استخدم 1X العازلة عالية الدقة، 10 ملي dNTPs، 2 U عالية الدقة DNA البلمرة، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي للطفرات إلى الأمام، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي للطفرات العكسي و 50 نانوغرام من pNL4-3VifB خيالية، من الخطوة 1.2.6 ، في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. تعيين المعلمات الدراجات الحرارية ل: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 25 دورة في 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 48 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. كرر الخطوة 1.2.2 إلى 1.2.6.

2. الجيل الفيروسية سهم عن طريق ترنسفكأيشن

  1. حساب كمية الفيروسي الأسهم المطلوب والبلازميد الحمض النووي المطلوبة. مع عيار الفيروسية من 10 4 وحدة دولية / مل أو أكثر، 1.8 مل من الأسهم فيروسية غير كافية لمجموعتين من أسا المنافسة النمويس، بما في ذلك monoinfections، وفعلت كل في ثلاث نسخ. لترنسفكأيشن القيام به في لوحة 6 جيدا، وتحصد حوالي 1.8 مل طاف لكل بئر. وهناك حاجة واحدة ميكروغرام من DNA البلازميد لكل ترنسفكأيشن القيام به في لوحة 6 جيدا.
  2. لكل بئر من لوحة 6 جيدا، وإعداد 100 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن، على سبيل المثال، يتألف من 1 ميكرولتر X-tremeGENE 9 كاشف ترنسفكأيشن (أو منتج مماثل)، 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد والمصل خالية DMEM.
    1. تحديد حجم DNA البلازميد اللازمة، وذلك باستخدام 1 ميكروغرام DNA البلازميد لكل بئر. تأكد من أن تركيز النهائي من الحمض النووي البلازميد هو لا يقل عن 50 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. تحديد مقدار الحاجة المصل خالية المتوسطة (DMEM) لكل بئر باستخدام الصيغة: الحجم الإجمالي من DMEM في ميكرولتر = 100 ميكرولتر - حجم DNA في ميكرولتر.
  3. إضافة 10 6 كلوة 293T-17 (آي تي سي سي) خلية / جيدا في 2 مل من انتشار المتوسطة (DMEM + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)) في لوحة 6 جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في5٪ CO 2 الغلاف الجوي. البذور العديد من الآبار حسب الحاجة (تم تحديدها في الخطوة 2.1).
  4. لتحضير خليط ترنسفكأيشن، قسامة حجم مناسب من المصل خالية DMEM، كما يحسب أعلاه، في أنبوب microcentrifuge 1.8 مل البولي بروبلين، ثم قم بإضافة كاشف ترنسفكأيشن.
    1. ماصة كاشف مباشرة في حل وسائل الإعلام، لا إضافته إلى سطح البلاستيك من أنبوب microcentrifuge. إضافة DNA البلازميد الماضي. الماصة صعودا وهبوطا بلطف لمزج الحل. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT (15 ° C إلى 25 ° C) للسماح للتشكيل المجمعات ترنسفكأيشن.
    2. يضاف خليط بطريقة الإفلات من الحكمة أن الخلايا المزروعة في لوحة 6 جيدا. بلطف يهز أو دوامة الآبار لضمان التوزيع حتى المجمعات ترنسفكأيشن.
    3. ختم لوحات مع غلاف بلاستيكي.
  5. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 48 ساعة.
  6. استخدام ماصة لجمع ونقل بعناية طاف لأنبوب 15 مل throuGH أعلى 0.22 ميكرون التصفية.
  7. استخدام ماصة لنقل 250 ميكرولتر أو أكثر من طاف تصفيتها إلى 1.8 مل أنابيب microfuge مع مقاطع المطاط في الجفن.
  8. متجر supernatants تصفيتها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. تحديد المعدية عيار الأسهم الفيروسية على خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

  1. تحفيز PBMCs مع راصة دموية نباتية (PHA). في المخزون الفيروسي واحد، والبذور 2 × 10 6 PBMCs في التعديل المتوسطة كاملة Iscove في Dulbecco و(cIMDM؛ IMDM تستكمل مع 20 U / مل من انترلوكين الإنسان 2 (HIL-2)، و 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) تكميل مع PHA (1.5 ميكروغرام / مل). PBMCs البذور في 2 × 10 6 خلية / مل. احتضان PBMCs عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 72 ساعة.
  2. حصاد PHA تحفيز PBMCs. نقل غير ملتصقة فا PBMCs إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تدور الأنبوب في 228 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف بعناية دون disruptinز بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه خلية إلى تركيز النهائي من 2 × 10 5 PBMCs / مل في cIMDM.
  3. البذور 2 × 10 4 PHA تحفيز PBMCs / جيد في 100 ميكرولتر / جيد cIMDM في الجولة أسفل لوحة 96-جيدا.
  4. جعل 01:10 التخفيف من المخزون الفيروسي. ثم، من أول سهم المخفف، وجعل اثني عشر التخفيفات المتسلسلة 3 أضعاف في لوحة رئيسية 96-جيدا. ويوصى هذا المخطط تمييع للكشف عن التتر الفيروسية في مجموعة من 10 أبريل - 10 يونيو حدة المعدية (IU) لكل مل.
    1. على سبيل المثال، إضافة 20 ميكرولتر من الأسهم الفيروس الى وسائل الاعلام 180 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل. مزيج التخفيف من قبل pipetting بعناية. ثم نقل 90 ميكرولتر من الأسهم المخفف إلى 180 وسائل الاعلام ميكرولتر من أول بئر وتخلط جيدا من قبل pipetting.
    2. مواصلة سلسلة التخفيف عن طريق نقل 90 ميكرولتر من البئر الحالي إلى 180 وسائل الاعلام ميكرولتر في البئر المقبل إحدى عشرة مرة أكثر. زيادة أو نقصان في التخفيف الأولي إذا التتر أعلى من 10 6 وحدة دولية / ملأو من المتوقع أقل من 10 4 وحدة دولية / مل على التوالي.
  5. إضافة 40 ميكرولتر من الأسهم الفيروسية تخفيفه بشكل متسلسل من لوحة تخفيف الرئيسي إلى لوحة PBMCs المصنفة (من الخطوة 3.3) في quadruplicate. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لل16-24 ساعة.
  6. إزالة بعناية 100 ميكرولتر من طاف من كل بئر، واستبدالها مع 160 ميكرولتر من cIMDM جديدة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 200 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي (اليوم 1).
  7. في أيام 4 و 7 و 10 و 13 نقل 100 ميكرولتر من طاف من كل بئر إلى 100 العازلة تعطل ميكرولتر (2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني)، واستبدالها مع 100 ميكرولتر من cIMDM الطازجة. تخزين supernatants في -20 ° C.
    1. الحفاظ أخذ العينات وإضافة cIMDM جديدة كل ثلاثة أيام حتى تستقر عيار.
  8. تحديد 50٪ زراعة الأنسجة الجرعة المعدية (TCID 50) من الأسهم الفيروسية التي كتبها P24 ELISA باستخدام اليوم 7 و 13 عينات كما هو موضح في الخطوة 4.
    1. إذا كان TCID 50 تم الحصول عليها من يوم 13 هو أعلى بشكل واضح من عيار من يوم 7، والأوراق المالية الفيروس قد تحتاج وقتا أطول في التوسع. تكرار P24 ELISA باستخدام عينات لاحقة حتى التتر المعدية من نقطتين الوقت أخذ العينات تصبح مستقرة (أو نقصان). أسهم مختارة من عينات وفقا لأعلى التتر.

4. ELISA (انزيم مرتبط Immunoabsorbant الفحص) الكشف عن HIV-1 P24 لتحديد الفيروسية المعدية العيار الحجمي

ملاحظة: تم وضع بروتوكول التالية باستخدام لوحات P24 التقاط مستضد أعد في مختبرنا 30. P24 ELISA لوحة / مجموعات يمكن أن تستخدم أيضا بعد بروتوكول الشركة المصنعة التجارية 1 فيروس نقص المناعة البشرية.

  1. قبل العمل مع العينات، وإعداد مخزون عمل الأجسام المضادة الأولية (أرنب مكافحة HIV-1 SF2 P24 مصل).
    1. ذوبان الجليد مصل P24 في RT.
    2. خلط 2.5 مل من الجلسرين مع 2 مل 10٪ FBS في الفوسفاطالمالحة عازلة ه (PBS).
    3. إضافة 0.5 مل من مصل وتخلط.
    4. مخزن 1 مل من aliquots في -20 ° C.
  2. عينات ذوبان الجليد من الخطوة 3.7 في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  3. غسل القبض على لوحة P24 5 مرات مع غسل العازلة (1X PBS مع 0.05٪ توين-20).
  4. إضافة 50 ميكرولتر / بئر مخفف عينة (1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.2٪ توين-20 في RPMI-1640)، ثم إضافة 50 ميكرولتر من عينة إلى الآبار المناسبة. تشمل على الأقل ثلاثة آبار مع عينة مخفف فقط كما وهمية / ضوابط السلبية. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية أو O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية الطازجة قبل استخدامها. جعل 1: 2000 تخفيف أضعاف من الأجسام المضادة الأولية الأسهم العمل باستخدام مخفف الأجسام المضادة الأولية (12٪ FBS في RPMI-1640). ضمان لإعداد ما يكفي لاستخدام 100 ميكرولتر حل لكل عينة / التحكم بشكل جيد في لوحة 96-جيدا.
    1. على سبيل المثال، لجعل حل ما يكفي لأحد وحة 96-جيدا، إضافة 5 ميكرولتر من worki الأجسام المضادة الأوليةنانوغرام الأسهم إلى مخفف الأجسام المضادة الأولية عن الحجم النهائي من 10 مل.
  6. غسل القبض على لوحة 5 مرات مع غسل العازلة.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  8. إعداد الحل الضد الثانوية الطازجة قبل استخدامها. جعل 1: 14400 التخفيف أضعاف من الأجسام المضادة الثانوية (1 ملغ / مل الماعز المضادة للأرنب HRP) باستخدام مخفف الضد الثانوية (7٪ FBS، 0.01٪ توين 20 في RPMI-1640). للحد من الأخطاء pipetting ل، نفذ مسلسل التخفيف من خطوتين. ضمان لإعداد ما يكفي لاستخدام 100 ميكرولتر حل لكل عينة / التحكم بشكل جيد في لوحة 96-جيدا.
    1. على سبيل المثال، لجعل حل ما يكفي لأحد وحة 96-جيدا، أولا إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى 99 ميكرولتر من مخفف الضد الثانوية. ثم إضافة 70 ميكرولتر من التخفيف الأول إلى مخفف الضد الثانوية عن الحجم النهائي من 10 مل.
  9. غسل القبض على لوحة 5 تيموفاق مع غسل العازلة.
  10. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  11. غسل لوحة 5 مرات مع غسل العازلة.
  12. إضافة 100 ميكرولتر من RT TMB الركيزة. احتضان 30 دقيقة في RT في حاوية مغلقة للحماية من الضوء.
  13. إضافة 100 ميكرولتر من RT توقف الحل (1 NH 2 SO 4).
  14. قراءة الامتصاصية في 450-650 نانومتر في كل بئر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. استخدام قيمة الامتصاصية ليسجل كل جانب المصابين أو غير مصاب. النظر في بئر لاحتواء الفيروس المعدي إذا كانت قيمة الامتصاصية أعلى ثلاث مرات على الأقل من القيمة القراءة من آبار المراقبة وهمية / سلبي. حساب TCID 50 من الأسهم الفيروسية باستخدام طريقة ريد Meunch 31.

5. إنشاء حركية النمو الفيروسي

5.1) عدوى أحادية

  1. البذور 3 × 10 5 حفز PHA PBMC / جيد في 48-جيدا لوحةالصورة في الحجم الكلي 500 ميكرولتر / جيد. الحفاظ على لوحات ثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي حتى التلقيح.
  2. لكل فيروس، إعداد اللقاح يحتوي على 6000 وحدة دولية في 2 مل من cIMDM.
  3. تطعيم الآبار في ثلاث نسخ عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من اللقاح (1500 وحدة دولية) إلى خلايا المصنف. الحجم النهائي للثقافة الخلية المصابة هو 1 مل / بئر وزارة الداخلية هو 0.005.
  4. قسامة 200 ميكرولتر من اللقاح المتبقية إلى كل من لوحين 96-جيدا لعزل الحمض النووي الريبي، واحدة من التي يتم حفظها على سبيل الاحتياط.
  5. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لل16-24 ساعة.
  6. ثقافات غسل 16-24 ساعة بعد التطعيم.
    1. إزالة والتخلص 750 ميكرولتر من ثقافة طاف.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من cIMDM الطازجة. التفاف لوحات في غلاف بلاستيكي وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. إزالة وتجاهل طاف 750 ميكرولتر.
    3. إضافة 750 ميكرولتر من cIMDM الطازجة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 فيmosphere (يوم 1).
  7. عينة الثقافات يوميا من يوم 2 ليوم 7.
    1. نقل 500 ميكرولتر من ثقافة طاف لأنبوب 1.8 مل الطرد المركزي. تدور لمدة 1 دقيقة في 3000 ز س.
    2. نقل 200 ميكرولتر من طاف خالية من الخلايا لمدة 96-جيدا لوحات عينة لعزل الحمض النووي الريبي، ومرة ​​أخرى إنقاذ لوحة واحدة كما النسخ الاحتياطي. متجر supernatants في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي.
    3. إضافة cIMDM 500 ميكرولتر الطازجة إلى كل ثقافة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
    4. تجاهل الثقافات في Wescodyne في نهاية التجربة.
    5. عزل الحمض النووي الريبي من 200 ميكرولتر من طاف (مجموعات تجارية استخدام مثل كيت QIAamp الفيروسي RNA البسيطة) بعد بروتوكول الشركة المصنعة القياسية. بالنسبة لعدد كبير من العينات، استخدم QIAGEN QIAxtractor.
    6. عينات الحمض النووي الريبي في تخزين -80 ° C إلى التوليف [كدنا].

5.2) كدنا] التجميعي (عكس النسخ)

  1. لكل ق RNAوافرة، إضافة 1.2 نانومول من dNTP و 1.2 بمول التوليف [كدنا التمهيدي، (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 "، HXB2 النوكليوتيدات 7968-7995) إلى 10 ميكرولتر من RNA الفيروسي. يضاف الماء إلى الحجم النهائي من 14 ميكرولتر. نفض الغبار أنبوب لخلط وتدور لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، ثم اضغط على 4 درجات مئوية حتى يتم إعداد مزيج الرئيسي.
  3. تحضير مزيج الرئيسي باستخدام 5X الأولى الجديلة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.3، 375 ملي بوكل، 15 ملي MgCl 2)، 5 ملي DTT و 120 U من SuperScriptIII و 240 U من ريبونوكلياز المانع. يضاف الماء إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لخليط RNA، ونفض الغبار إلى المزيج وتدور لجمع.
  5. احتضان الخليط لمدة 90 دقيقة عند 50 درجة مئوية للسماح توليف [كدنا]. احتضان لمدة 15 دقيقة في 70 ° C إلى تعطيل الناسخ العكسي. عقد في 4 ° C حسب الحاجة.
  6. إضافة 2 U من ريبونوكلياز H، ونفض الغبار إلى المزيج، ثم تدور لجمع.
  7. احتضان 20 دقيقةفي 37 ° C. متجر كدنا] في -20 ° C.

5.3) [كدنا الكميات باستخدام نظام QPCR

  1. إعداد سلسلة التخفيف القياسية. هل 10 أضعاف التخفيف المتسلسل، من 3 × 10 6 نسخ / ميكرولتر وصولا الى 30 نسخة / ميكرولتر من pNL4-3VifA. استخدام الماء المقطر لمدة التخفيفات. إعداد سلسلة تخفيف معيار الطازجة قبل استخدامها أو إعداد دفعات صغيرة والحفاظ على -20 ° C. لا تجميد ذوبان الجليد المعايير أكثر من ثلاث مرات.
  2. انشاء 96-جيدا QPCR لوحة رد فعل. تأكد من أن كل لوحة تحتوي على بئر واحدة على الأقل من ضوابط السلبية، وثلاث نسخ من سلسلة تخفيف القياسية، وعلى الأقل نسخة مكررة من كل عينة [كدنا].
  3. لكل رد فعل QPCR، استخدم 12.5 ميكرولتر من QPCR مزيج الرئيسي، 0.2 ميكرومتر التحقيق، 0.8 ميكرومتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس و1 ميكرولتر من [كدنا أو سلسلة تخفيف معيار أو ماء / العازلة (من أجل السيطرة السلبية بشكل جيد). يضاف الماء إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر. التحقيق QPCR هو ضوء صنsitive. يبقيه في حاوية مغلقة.
    1. للكشف عن كدنا] المستمدة من استنساخ الجزيئي pNL4-3VifA القائمة على استخدام VIFA التمهيدي مسبار: VifAB التمهيدي إلى الأمام (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT)، VIFA التمهيدي العكسي (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') وVifAB التحقيق (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). لكدنا] المستمدة من استنساخ pNL4-3VifB القائمة على استخدام VifB التمهيدي مسبار: VifAB التمهيدي إلى الأمام، VifAB التحقيق وVifB التمهيدي العكسي (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3).
  4. تعيين المعلمات PCR ركوب الدراجات إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. الاطلاع على وثيقة دعم الشركة المصنعة لتشغيل آلة QPCR.
  5. حساب منحنى قياسي باستخدام البيانات من سلسلة تخفيف معيار ثلاث نسخ. مقارنة البيانات التضخيم من عينة [كدنا إلى منحنى القياسية لتحديد عدد النسخ. الاطلاع على وثيقة دعم الشركة المصنعة لداتجهيز تا.

5.4) تحديد الفيروسية الأسي مرحلة النمو

  1. رسم حركية النمو الفيروسية مع اليوم أخذ العينات على طول المحور السيني وعدد النسخ كدنا] على طول محور Y وتحديد مرحلة النمو الأسي الفيروسية، أي، عندما نسخ كدنا] الفيروسية الأرقام زيادة في تطور المتسارع.
  2. استخدام شبكة الإنترنت أداة GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) لحساب معدل النمو الفيروسي (ز). في هذا التطبيق، تقبل أداة GRC كدنا] نسخ الأرقام من نقطتين على الأقل مرة كمدخل، وإخراج معدل النمو الفيروسي (ز). استخدام بيانات نقطة زمنية الوحيدة في مرحلة النمو الأسي (راجع الخطوة 5.4.1 أعلاه) للحصول على معدلات نمو دقيقة. للحصول على وصف مفصل للنموذج رياضي المستخدمة في شبكة الإنترنت أداة GRC، انظر 20.

6. النمو مسابقة الفحص

  1. البذور 3 × 10 5 </ سوب> PBMCs حفز فا (أو 1 × 10 5 CEMx174 الخلايا) في 500 ميكرولتر اجمالى حجم لكل بئر في 48 لوحة مسطحة القاع جيدا.
  2. الحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي حتى التلقيح.
  3. لكل فيروس، وإعداد 3 مل من اللقاح يحتوي على 6000 وحدة دولية.
  4. نقل 1.5 مل من كل اللقاح الفيروسي لأنبوب معقم لإنشاء اللقاح الإصابة المزدوجة. إضافة 500 ميكرولتر من اللقاح الثنائي (1500 وحدة دولية) إلى 3 × 10 5 خلايا في طبق من ذهب 48-جيدا. حجم الثقافة النهائي هو 1 مل / جيد. قسامة 200 ميكرولتر من اللقاح لاثنين من لوحات 96-جيدا لعزل الحمض النووي الريبي. حفظ لوحة واحدة كما احتياطية.
  5. احتضان خلايا الملقحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لل16-24 ساعة.
  6. ثقافات غسل 16-24 ساعة بعد التطعيم.
    1. إزالة والتخلص 750 ميكرولتر من ثقافة طاف.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من cIMDM الطازجة. التفاف لوحات في غلاف بلاستيكي وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. إزالة والتخلص 75081؛ ل طاف.
    3. إضافة 750 ميكرولتر من cIMDM الطازجة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي (اليوم 1).
  7. اختر أوقات لأخذ العينات لتشمل 3 نقاط على الأقل مرة في مرحلة النمو الأسي لوحظ في خطوة 5.4.1.
    1. لكل أخذ العينات، واتبع الخطوة 5.1.7.
  8. أداء كدنا] التوليف كما هو موضح في القسم 5.2.
  9. تحديد نسبة البديل الفيروسية باستخدام QPCR.
    1. إعداد سلسلة تخفيف معيار المسلسل في ثلاث نسخ، تمييع 10 أضعاف في كل خطوة من 3 × 10 6 نسخ / ميكرولتر إلى 30 نسخة / ميكرولتر من pNL4-3VifA.
    2. انشاء 96-جيدا QPCR لوحة رد فعل. تأكد من أن كل لوحة تحتوي على عنصر تحكم واحد على الأقل السلبية، وسلسلة التخفيف القياسية في ثلاث نسخ، ونسخ من كل عينة [كدنا].
    3. لكل رد فعل QPCR، استخدم 12.5 ميكرولتر من QPCR ميكس ماجستير، 0.2 ميكرومتر التحقيق، 0.8 ميكرومتر كل من الأمام والاشعال عكس و 1 ميكرولتر من [كدنا أو د القياسية سلسلة ilution أو الماء / العازلة (لآبار المراقبة السلبية). يضاف الماء إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر. التحقيق QPCR خفيف حساسة، ويبقيه في حاوية مغلقة.
      1. استخدام VIFA التمهيدي مسبار للكشف عن الإشارات في ضوابط السلبية وسلسلة التخفيف القياسية ومع نسختين واحدة من العينة كدنا]. استخدام VifB التمهيدي مسبار مع أخرى مكررة من العينة كدنا].
    4. تعيين المعلمات PCR ركوب الدراجات إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. الاطلاع على وثيقة دعم الشركة المصنعة لتشغيل آلة QPCR.
    5. حساب منحنى قياسي باستخدام البيانات التضخيم من سلسلة تخفيف القياسية. مقارنة البيانات التضخيم من العينات [كدنا إلى منحنى القياسية لتحديد عدد النسخ. الاطلاع على وثيقة دعم الشركة المصنعة لمعالجة البيانات.
    6. استخدام شبكة الإنترنت أداة GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) لحساب اللياقة البدنية الفيروسية النسبية (د).
      ملاحظة: تقبل أداة GRC كدنا] نسخ أرقام أو مرتفعات اللوني الذروة من نقطتين على الأقل مرة كإدخال، وإخراج الفرق معدل النمو الصافي (د) بين الفيروسين. في حين يمكن للأداة حساب معدل النمو الصافي من اثنين بيانات نقطة زمنية، فمن المستحسن لإدخال البيانات من ثلاثة أو أكثر من النقاط الزمنية. استخدام البيانات الوحيدة التي تم الحصول عليها من نقطة زمنية في مرحلة النمو الأسي (راجع الخطوة 5.4) للحصول على معدلات نمو دقيقة. للحصول على وصف مفصل للنموذج رياضي المستخدمة في شبكة الإنترنت أداة GRC، انظر 20.
  10. تحديد نسب الفيروسية باستخدام اللوني الذروة المرتفعات
    1. PCR تضخيم HIV-1 VIF شظايا تحتوي على العلامة تسلسل VifAB باستخدام VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '؛ HXB2 المواقف 5266-5291) وVifRev الاشعال (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3؛ مواقف HXB2 5579-5553).
      1. لكل رد فعل PCR، استخدم 1 ميكرولتر من [كدنا، 1X NH 4 العازلة، 1.5 ملي MgCl 2، 0.2 ملي dNTP، و 2.5 U طق البلمرة، و 0.45 ميكرومتر لكل التمهيدي. يضاف الماء إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
      2. تعيين المعلمات PCR ركوب الدراجات إلى 3 دورات في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 ° C لمدة 1 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 34 دورات في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم اضغط على 4 درجات مئوية.
    2. تنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنقية QIAquick PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. تقديم منتجات PCR المنقى إلى DNA التسلسل مزود الخدمة للحصول سانجر التسلسل.
    4. تحقق متوسط ​​درجة جودة القراءة، والتي ينبغي أن توفرها خدمة التسلسل. إذا كان متوسط ​​دقة دعوة القاعدة هي أقل من 85٪، يعيد خطوة 6.10.1 إلى 6.10.3
    5. استخدام شبكة الإنترنت أداة ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) لحساب نسبة الفيروسية في كل نقطة زمنية. الأداة يتطلب ملف التتبع تسلسل (* .ab1) وتسلسل 5 'إلى الموقع النوكليوتيدات من الفائدة. الأداة يقيس كثافة الذروة في الموقع المحدد. نسبة كثافة الذروة يناظر التموينية من الفيروسين (الشكل 4B).
    6. استخدام أداة GRC على شبكة الإنترنت ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) وشدة الذروة المسجلة كإدخال لحساب اللياقة البدنية النسبية الفيروسية (د). راجع الخطوة 6.10.6 20

Representative Results

لدراسة تأثير اللياقة البدنية من واحد التغييرات الأحماض الأمينية في HIV-1 الكمامة-P24، كنا النوكليوتيد الموجهة الطفرات لإدخال طفرات في البلازميد pNL4-3 تحتوي على HIV-1 COTB-P24 23،32،33 الجينات. تم إنشاء مخزون الفيروسية التي ترنسفكأيشن من خلايا 293T وتحصد بعد 48 ساعة. قدرنا 50٪ زراعة الأنسجة الجرعة المعدية (TCID 50) لكل سهم الفيروسي من خلال طريقة ريد مونش 31. وTCID 50 من النموذج وفيروسات متحولة تراوحت من 10 أبريل - 10 مايو IU / مل (الشكل 3A).

تم إنشاء حركية نمو الفيروسات المؤتلف في PBMCs من متبرع واحد في وزارة الداخلية من 0.005. وقد استخدم RT-QPCR لقياس الفيروسي في عدد النسخ [كدنا يوميا لمدة ستة أيام. نمت كل متحولة والنموذج الفيروسات بشكل كبير بين يوم 2 و 4 يوم، وبعد ذلك تباطأ النمو الفيروسي، كما يتبين من منحدر انخفضت الزيادة في عدد النسخ RNA الفيروسي (<قوي> الشكل 3B). انخفاض كدنا] نسخ هو رقم بين يوم 0 (المقابلة لقيحة)، ويوم 2 يرجع ذلك إلى امتصاص الفيروس إلى الخلايا وإزالة virions غير منضم يوما بعد يوم 1 غسل (الخطوة 5.1.6). في مرحلة النمو الأسي، كان كل المسوخ ثلاثة معدل نمو أبطأ (ز) من الفيروس النموذج (الشكل 3C).

وقد تنافس كل المسوخ ثلاثة ضد الفيروس النموذج في المقايسات المنافسة النمو في وزارة الداخلية إجمالية قدرها 0.005. كانت حركية النمو الفيروسي في الثقافات المصابة بشكل ثنائي مماثلة لتلك التي من عدوى أحادية. كانت مرحلة النمو الأسي الفيروسية بين أيام 2 و 4، وبلغ معدل النمو الفيروسي هضبة اليوم حوالي 5 (الشكل 4A).

وقد استمدت الخلافات الفيروسية معدل النمو من التغير في نسبة الفيروسية مع مرور الوقت. تم احتساب نسبة الفيروسية على أساس كدنا] عدد نسخة من المرجعية والفيروسات متحولة باستخدام RT-QPCR، وبمقارنة مستويات الذروةفي تسلسل الاستشرابية في مواقع النوكليوتيدات التمييز بين الفيروسين (الشكل 4B). الاختلافات معدل النمو تحديدها باستخدام ذروة الارتفاع ونسخة RNA طرق عدد الفيروسية أسفرت عن نتائج مماثلة (الشكل 4C). كان كل المسوخ الثلاث السفلى اللياقة البدنية النسخ من الفيروسات النموذج مع I256V متحولة وجود أدنى اللياقة البدنية (الشكل 4C).

الشكل 1
الشكل 1: مخطط التدفق من البروتوكولات المعروضة في هذه الورقة فيروس بروتوكولات إعداد القلق بناء HIV-1 استنساخ المؤتلف وجيل من الأسهم الفيروسية. بروتوكولات اللياقة البدنية فحوصات هي لإنشاء حركية النمو الفيروسية وتحديد اللياقة البدنية الفيروسية النسبية. الخطوط المتقطعة تمثل تدفقات بديلة للالبروتوكولات. على سبيل المثال، يمكن إدخال طفرة مباشرة إلى HIV-1 NL4-3استنساخ الجزيئي دون توليد استنساخ المؤتلف.

الرقم 2
الشكل 2: بناء HIV-1 NL4-3 COTB الكمامة-P24 استنساخ الجزيئية المؤتلف باستخدام تمديد تداخل PCR (A) تصميم الاشعال خيالية. 5 'نصفي الاشعال تحتوي على تسلسل ناقلات NL4-3 و3' نصفين تحتوي على نهايات تسلسل إدراج. وتستخدم (B) الاشعال خيالية لتضخيم جزء إدراج، COTB الكمامة-P24. وتستخدم (C) وشظايا إدراج كما الاشعال لPCR الثاني لتوليد البلازميد المؤتلف الجديد.

الشكل (3)
الرقم 3: خصائص النمو الفيروسي في PBMCs (A) سجل 10 TCID 50 (B) حركية النمو الفيروسي في monoinfections بدأت في وزارة الداخلية = 0.005. (C) معدلات النمو الفيروسي أكثر من ستة أيام، بما في ذلك مرحلة النمو الأسي (2-4 أيام) مشتقة من لوحة (B). القيم المبينة تمثل بمعدل ثلاثة مكررات من تجربة واحدة. تمثل أشرطة الخطأ فترات الثقة 95٪.

الرقم 4
الرقم 4: النمو الفيروسي واللياقة البدنية النسبية قرارات (A) النمو الفيروسي في الثقافات PBMC المصابة بشكل مزدوج. (B) نسب T242N والنموذج الفيروسات مصممة باستخدام RT-QPCR أو طريقة التسلسل ذروة الارتفاع. (C) صافي الاختلافات معدل النمو الفيروسي (د) بين متحولة والفيروسات النموذج في الثقافات المصابة بشكل ثنائي، كما هو مبين في الفقرة (أ). تم حساب القيم د وROM البيانات نسبة الفيروسية هو مبين في (B). القيم المبينة تمثل بمعدل ثلاثة مكررات من تجربة واحدة. تمثل أشرطة الخطأ فترات الثقة 95٪.

Discussion

البروتوكولات قدم تتكون من جزئين رئيسيين: بناء المؤتلف HIV-1 استنساخ الجزيئية وفحوصات المنافسة النمو. من أجل التمييز بين نوعين من الفيروسات في زراعة الخلايا المصابة بشكل مزدوج، فمن المهم أن استنساخ الجزيئية المتنافسة تحتوي على علامات تسلسل، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة RT-QPCR التمهيدي مسبار الفحص أو عن طريق سانجر التسلسل. هذا البروتوكول يجعل من استخدام VIFA وVifB العلامات، والتي تحتل نفس المنطقة من HIV-1 NL4-3 VIF وترميز نفس تسلسل الأحماض الأمينية ولكنها تختلف من ست طفرات مرادفة. وقد أظهرت هذه الطفرات لا تؤثر تكاثر الفيروس لياقة بدنية (20). طريقة استنساخ PCR القائم المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر المزيد من المرونة في اختيار مواقع الاستنساخ، بالمقارنة مع موقع تقييد الاستنساخ القائمة. ومع ذلك، فإن كفاءة PCR الاستنساخ عكسيا مع زيادة حجم إدراج. الحد الحالي من حجم إدراج هو ~ 5 كيلو بايت 34. لاستنساخ PCR القائم والموقع موجه mutagenesiالصورة، استخدام الحمض النووي بوليميريز عالية الدقة أمر حاسم للحد من احتمالات حدوث طفرات إضافية. ويوصى أيضا استخدام أقل عدد ممكن من دورات PCR اللازمة لانتاج كميات كافية من المنتجات. في تجربتنا، ونحن لم يكشف عن أي طفرات إضافية بعد الاستنساخ وموقع الموجه الخطوات الطفرات PCR القائم هو موضح هنا. مع ذلك يجب أن تكون متسلسلة منتجات PCR للتحقق من أي طفرات غير مرغوب فيها. من الناحية المثالية، ينبغي resequenced المنطقة بأسرها الترميز فيروس نقص المناعة البشرية.

يجب فحص ثلاث نقاط على الأقل وقت أخذ العينات في مرحلة النمو الأسي 9. لا بد أولا أن تنشأ حركية النمو الفيروسية باستخدام أخذ العينات اليومية لتحديد الفترة الثقافة ووقت أخذ العينات النقاط المناسبة للمنافسة النمو. أحد العوامل التي تؤثر على حركية النمو الفيروسي هو وافر من العدوى (وزارة الداخلية). يستخدم هذا البروتوكول في وزارة الداخلية إجمالية قدرها 0.005 لكل من عدوى أحادية والمنافسة النمو، كما تبين أن تسفر عن مزيد من ريال عمانيالنتائج تمثال نصفي من أقل موييس 9. ومع ذلك، يمكن استخدام موييس أقل للحصول على مرحلة النمو يعد الأسي إذا لزم الأمر، ولكن على حساب نتيجة الاتساق. يوحي هذا البروتوكول نسبة الإصابة الأولية من 50:50، على افتراض أن الاختلافات اللياقة البدنية للفيروسات غير معروفة عموما مسبقا. ومع ذلك، فإن استخدام نسب مدخلات غير متكافئة ومناسبة عندما يكون هناك بيانات أولية تشير إلى اختلافات كبيرة في حركية تكاثر الفيروس. في هذه الحالات، لذا ينصح باستخدام أي نسبة إصابة 70:30 للسماح للكشف عن فارق اللياقة البدنية كبير حيث يتم وضع الفيروس أقل مناسبا تتجاوز 9.

بروتوكول لتحديد TCID 50، حركية النمو الفيروسي، وأداء النمو وتحسين المقايسات المنافسة باستخدام HIV-1 سلالة B، وقد أثبتت NL4-3 COTB-P24، وPBMCs من متبرع واحد الذي PBMC قابلية متسقة لبفيروس نقص المناعة البشرية إصابة 1 في المختبر. الفترة الثقافةونقاط الوقت أخذ العينات الواردة في هذا البروتوكول من المرجح أن تكون مناسبة لدراسة HIV-1 مجموعة الفيروسات M في PBMCs الإنسان. ينصح بشدة باستخدام PBMCs من مصدر واحد للحصول على نتائج متسقة كما تكاثر الفيروس يمكن أن تختلف في خلايا مختلفة المانحة 35. على الرغم من أن أقل من المرغوب فيه، PBMCs مجمعة من جهات مانحة متعددة يمكن استخدامها على النحو المنصوص إجراء تبديل أن هذا المجمع نفسه يستخدم في جميع التجارب. بديل آخر هو استخدام خطوط الخلايا. تم استخدام بروتوكول المعروضة هنا بنجاح مع خط T-خلية CEMx174 23،36. ومع ذلك، فمن المهم أن أعداد الخلايا المزروعة هي تحقيق نمو الخلايا ثابت الأمثل إعادة. حركية النمو الفيروسية كما يجب إعادة تأسيس، كما أنه من المرجح أن تختلف في خطوط مختلفة من الخلايا، لتحديد نقاط الوقت أخذ العينات المناسبة في الخطوات المنافسة النمو.

وشملت اثنين من أساليب مختلفة لتحديد نسبة الفيروسية لحساب اللياقة البدنية في protocرأ. أول يستخدم RT-QPCR لقياس الفيروسي في عدد النسخ [كدنا في كل نقطة زمنية أخذ العينات. ثم تم حساب الفيروسية اللياقة البدنية النسخ المتماثل من نسبة الفيروسية، استنادا إلى عدد كدنا] نسخة. بدلا من ذلك، يمكن تحديد نسبة الفيروسية على أساس نسبة ارتفاع اللوني الذروة في مواقع العلامة VifAB. طريقتين تعطي نتائج متشابهة (الشكل 4). طريقة ذروة الذروة اللوني يمكن تطبيقها على غيرها من HIV-1 سلالات دون علامة تسلسل هندسيا. لRT-QPCR، واستخدام البادئات أو تحقيقات لتمييز المتغيرات الفيروسية يجب أولا أن تقيم بعناية (انظر 20). ومع ذلك، يوفر RT-QPCR حساسية أفضل للعينات مع كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي الفيروسي، مثل تلك التي من وجهة أول مرة في مرحلة النمو الأسي. القياس المباشر للكدنا] الفيروسية كما يتيح الكشف عن المشاكل الفنية التي قد تنشأ عن استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا] التوليف. استخدام الحيوانات المستنسخة الجزيئية مع به تسلسل يوفر فعالة من حيث التكلفة حل رس الطرق RT-QPCR، وهناك حاجة فقط اثنين من أزواج من الاشعال وتحقيقات لدراسة الفيروسات متعددة. يتجنب هذه الاستراتيجية أيضا مشكلة تباين ذروة الارتفاع في تسلسل الاستشرابية بسبب القواعد المجاورة 37، كما هو الحال التسلسل في نفس الموقع في جميع الفيروسات في الدراسة. المنتجات PCR المنتجة للRT-QPCR وسانجر تسلسل ويمكن أيضا أن يكون استخدام مع أساليب أخرى لتحديد نسبة الفيروسية مثل التسلسل الجزء الأكبر من الحيوانات المستنسخة الفردية 12،13، HTA 4،7،17،19، أو قليل النوكليوتيد ربط الفحص (OLA) 38 .

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. إن الآراء الواردة في هذه الوثيقة هي آراء المؤلفين، وينبغي ألا يفسر على أنه مسؤول أو تمثل وجهة نظر وزارة الدفاع الأمريكية أو وزارة الجيش.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers IDT Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F-549S
High-fidelity buffer Thermo Scientific F-549S
dNTP Bioline Bio-39026
Thermal cycler Life Technologies Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye Thermo Scientific R0631
1 kb Plus DNA ladder Invitrogen 10787-018
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
DpnI enzyme New England Biolabs R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli Invitrogen C4040-10
Luria Broth base powder Invitrogen 12795-084
Carbenicillin Research Products International C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit  Qiagen 27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 6365787001
HEK 293T-17 ATCC CRL-11268 http://www.atcc.org/
0.22 μm filter top tube VWR International 89220-716 
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) Life Technologies 31980-030
RPMI-1640 media Life Technologies 61870-036
Phytohemagglutinin (PHA) Thermo Scientific R30852801
Human Interleukin-2 Roche 11147528001
Fetal bovine serum JR Scientific 43640
Penicillin and Streptomycin Corning Cellgro 30-001-CI
6 well plate VWR Scientific 73520-906
48 well plate VWR Scientific 62407-338
96 well flat-bottomed plate ISC Bioexpress T-3015-4
96 well round-bottomed plate BD Falcon 353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube Mt. Baker Bio MBD-1500
1.5 ml tubes w/ O-ring VWR Scientific 89004-290
50 ml conical tube ISC Bioexpress C-3317-6
ELISA
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Phosphate buffer saline (PBS) Invitrogen 14190-250
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
glycerol Sigma-Aldrich G5516
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum NIH AIDS Reagent Program 4250
Goat anti-rabbit HRP KPL 474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-01
H2SO4 Fisher Scientific A300-500 Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 min.
HIV p24 standard AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader Molecular Devices VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
dNTP Bioline Bio-39026
SuperscriptIII Invitrogen 18080-085
First-strand buffer  Invitrogen 18080-085
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 18080-085
Rnase inhibitor Roche 3335402001
RnaseH Invitrogen 18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine Life Technologies Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Forward, reverse primer IDT Custom order
Probe Life Technologies Custom order
optical 96 well reaction plate Life Technologies I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase) Bioline Bio-21043
NH4 buffer  Bioline Bio-21043
MgCl2 Bioline Bio-21043
Sequencing primer IDT Custom order
QIAxcel Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider http://www.htseq.org/
GRC web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Domingo, E., Holland, J. J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).
  2. Domingo, E. Mechanisms of viral emergence. Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).
  3. Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo. Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).
  4. Troyer, R. M. Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).
  5. Rolland, M. Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics. PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).
  6. Abraha, A. CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic. J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).
  7. Quinones-Mateu, M. E. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).
  8. Ball, S. C. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes. B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).
  9. Lanxon-Cookson, E. C. Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses. J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).
  10. Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine. J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).
  11. Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation. J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).
  12. Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).
  13. Wang, J. The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency. Virology. 348 (2), 462-474 (2006).
  14. Song, H. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome. Retrovirology. 9 (89), (2012).
  15. Ali, A., Yang, O. A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay. Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).
  16. Maarseveen, N. M. A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants. J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).
  17. Liu, Y. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape. J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).
  18. Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).
  19. Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness. Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).
  20. Liu, Y. A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture. J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).
  21. Brumme, Z. L. Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers. J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).
  22. Nomura, S. Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in. Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).
  23. Rolland, M. HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity. J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).
  24. Martinez-Picado, J. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).
  25. Brockman, M. A. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).
  26. Miura, T. HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).
  27. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction (2014).
  28. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).
  29. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests (2014).
  30. McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density. J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).
  31. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimatingfifty percent endpoints. Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).
  32. Nickle, D. C. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).
  33. Rolland, M. Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).
  34. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  35. Spira, A. I., Ho, D. D. Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro. J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).
  36. Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface. PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).
  37. Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing. Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).
  38. Lalonde, M. S. Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies. J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).

Tags

علم المناعة، العدد 99، HIV-1، المؤتلف، الطفرات، الفيروسية اللياقة البدنية تكرارها، والمنافسة النمو، وحساب للياقة البدنية
زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E.… More

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E. C., Liu, Y., Swain, J. V., McClure, J., Rao, U., Maust, B., Deng, W., Sunshine, J. E., Kim, M., Rolland, M., Mullins, J. I. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (99), e52610, doi:10.3791/52610 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter