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Immunology and Infection

ह्यूमन इम्यूनो वायरस की प्रतिकृति स्वास्थ्य निर्धारण के लिए जोड़ो में ग्रोथ प्रतियोगिता परख

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52610
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2
1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

Introduction

वायरल प्रतिकृति फिटनेस एक दिया पर्यावरण 1 में संक्रामक संतान का उत्पादन करने के लिए एक वायरस की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है और समय पर 2 जनसंख्या के स्तर पर एक वायरस संस्करण की व्यापकता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण योगदान कारक है। इन विवो के रूप में फिटनेस पढ़ाई ऐसे एचआईवी -1 के रूप में रोगजनक मानव वायरस, विभिन्न इन विट्रो में और साथ संभव नहीं हैं पूर्व vivo प्रतिकृति फिटनेस assays के दवा प्रतिरोध और प्रतिरक्षा बच म्यूटेशन, एपिस्टासिस और विकास से उत्पन्न होने वाले फिटनेस पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है के वायरल आबादी 3-6। अलग फिटनेस assays के अलावा, विकास प्रतियोगिता assays के विवो 1,7,8 में होता है के रूप में दो या दो से अधिक वायरल वेरिएंट, ठीक उसी पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत एक ही सेल की आबादी के लिए प्रतिस्पर्धा के रूप में, फिटनेस मतभेदों के अधिक संवेदनशील और वैध उपायों उपज के लिए पहचाने जाते हैं। विकास प्रतियोगिता प्रयोगों शुरू, कई variab पहलेलेस संक्रमण के विभिन्न multiplicities (MOI), वायरल इनपुट अनुपात, और विश्लेषण के लिए नमूने के समय के उपयोग सहित निर्धारित करने की आवश्यकता है। हम वायरल विकास कैनेटीक्स पर और प्रतियोगिता के प्रयोगों के परिणाम पर इन मानकों के प्रभाव का अध्ययन किया है, और सेल संस्कृति 9 में एचआईवी -1 फिटनेस के मजबूत मापन के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कारकों की पहचान की है।

परख चर के अलावा, विकास प्रतियोगिता प्रयोगों में वायरल वेरिएंट quantitating लिए तरीकों की एक किस्म है। 10,11 थोक या प्रतिरूप अनुक्रमण 12,13 ब्याज की साइट (ओं) पर न्यूक्लियोटाइड आवृत्तियों के आधार पर प्रतिस्पर्धा वायरस के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सापेक्ष फिटनेस समय के साथ इस अनुपात में बदलाव से ली गई है। डीएनए अनुक्रमण सेवाओं को व्यापक रूप से उपलब्ध हैं के रूप में इस विधि सुविधाजनक है। समानांतर एलील विशिष्ट अनुक्रमण (पास) विधि कई स्थलों पर अनुक्रमण और रिकोम्बिनेंट्स 14 का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है 4,7,17,19 भेद या प्रतिलेखन मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को उल्टा करने के टैग के रूप में 15 या पर्याय म्यूटेशन 4,16-18 का उपयोग की परवाह किए बिना अनुक्रम समानता के तनाव प्रतिस्पर्धा अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो सभी के लिए (आर टी-qPCR) 15,16,18,20,। एक अतिरिक्त कदम वायरल जीनोम में टैग को पेश करने की जरूरत है और आर टी-qPCR परख भी विशिष्ट अभिकर्मकों और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है। हमने पाया है कि थोक सेंगर अनुक्रमण पैदावार तुलनीय परिणाम 9।

विकास प्रतियोगिता के बाद, वायरल प्रतिकृति फिटनेस रिश्तेदार रखरखाव, या टी के बीच एक फिटनेस अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता हैवायरल वेरिएंट wo। एक वायरस के रिश्तेदार फिटनेस inoculum में अपनी प्रारंभिक अनुपात द्वारा या दो प्रतिस्पर्धा वायरस के बीच शुद्ध वृद्धि दर अंतर के रूप में सामान्यीकृत एक वायरल संस्करण के अंतिम अनुपात के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। हम बाद विधि, केवल घातीय वृद्धि चरण के भीतर अनुदैर्ध्य डेटा बिंदुओं का उपयोग करते हुए, सबसे मजबूत परिणाम 9,20 उत्पादन किया है कि पाया।

इन विट्रो में फिटनेस assays के जैविक क्लोन 6-8 और एचआईवी -1 के संक्रामक आणविक क्लोन अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं। उत्तरार्द्ध, आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी जा रहा है, अक्सर विशेष म्यूटेशन या ब्याज 3-5,21,22 के विशिष्ट दृश्यों से फिटनेस पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल वायरल विकास कैनेटीक्स, एक दृश्य टैग युक्त एचआईवी -1 वैक्टर का उपयोग नए पूर्ण लंबाई संक्रामक एचआईवी -1 आणविक क्लोन के निर्माण के हित के म्यूटेशन को शुरू करने, वायरल शेयरों बनाने और स्थापित करने की बात से एक कार्यप्रवाह का वर्णनरिश्तेदार फिटनेस विकास प्रतियोगिता परख प्रदर्शन और गणना करने के लिए (चित्रा 1)।

हमारे अनुकूलित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम तीन पुनः संयोजक एचआईवी -1 म्यूटेंट बनाया है और उनकी प्रतिकृति फिटनेस निर्धारित की। पुनः संयोजक आणविक क्लोन पहले एक कृत्रिम COTB (केंद्र के- साथ, pNL4-3, एचआईवी -1 प्रयोगशाला तनाव NL4-3 की एक पूरी लंबाई की संक्रामक जीनोम युक्त प्लाज्मिड की एचआईवी -1 ढकोसला-पी 24 जीन क्षेत्र की जगह से निर्माण किया गया था ट्री, उप-प्रकार बी) ढकोसला-पी 24 अनुक्रम 23 प्रोटोटाइप तनाव पैदा करने के लिए। एकल एमिनो परिवर्तन (T186M, T242N, और I256V) तो तीन उत्परिवर्ती क्लोन बनाने के लिए शुरू किए गए थे। प्रत्येक उत्परिवर्ती दिया आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रत्येक उत्परिवर्तन की फिटनेस प्रभाव का निरीक्षण करने के प्रोटोटाइप वायरस के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की गई थी। तीन म्यूटेंट प्रोटोटाइप वायरस की तुलना में मामूली काफी कम से प्रतिकृति fsitness का स्तर अलग प्रदर्शन किया। T242N उत्परिवर्तन पहले से एक उदारवादी fitne होने की भी सूचनाएसएस इस अध्ययन में दिखाया गया है परिणाम के समान 24-26, लागत। अन्य दो म्यूटेशन की फिटनेस लागत पहले से नहीं बताया गया था।

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल, नीचे वर्णित के रूप में, किसी भी मरीज से पहचान योग्य जानकारी शामिल नहीं है और इस प्रकार वाशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा मानव विषयों रिसर्च या मानव विषयों डिवीजन नहीं माना जाता है।

Chimeric एचआईवी -1 NL4-3 आण्विक क्लोन 1. निर्माण

1.1) बढ़ाना डालें डीएनए टुकड़ा

  1. काइमेरिक प्राइमरों डिजाइन। 5 'दोनों के हिस्सों आगे और रिवर्स प्राइमरों टुकड़ा डाला जाएगा, जिस पर एक एचआईवी -1 वेक्टर अनुक्रम, होते हैं। प्राइमरों के 3 'आधा डालने अनुक्रम (चित्रा 2) के अंत होना चाहिए। काइमेरिक प्राइमर अनुक्रम मूल खुला पढ़ने फ्रेम को बरकरार रखे हुए है कि सुनिश्चित करें।
    1. से अधिक या 60 डिग्री सेल्सियस के बराबर तापमान के पिघलने, ~ 50% जीसी सामग्री, और प्राइमर dimers, heterodimers और / या बाल के लिये कांटा संरचनाओं फार्म के लिए एक कम प्रवृत्ति के साथ, लंबाई में प्राइमरों कम से कम 20 ठिकानों का प्रयोग करें। इन गुणों का आकलनOligoAnalyzer वेब उपकरण का उपयोग ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ )।
  2. इस्तेमाल की पीसीआर 27 और काइमेरिक प्राइमरों डालने के डीएनए (चित्रा 2) बढ़ाना। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 1X उच्च निष्ठा बफर, 0.2 मिमी dNTPs, उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 1 यू, आगे काइमेरिक प्राइमर का 0.5 माइक्रोन, रिवर्स काइमेरिक प्राइमर का 0.5 माइक्रोन, और डालने क्षेत्र को ले जाने के डीएनए नमूने का 1 pg0 एनजी का उपयोग करें। 50 μl के अंतिम मात्रा हे DH 2 जोड़ें।
  3. इस प्रकार के रूप थर्मल साइकिल कदम सेट: 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक डीएनए विकृतीकरण कदम प्रदर्शन करते हैं। 20 सेकंड के लिए दो प्राइमरों का सबसे कम तापमान के पिघलने से ऊपर 3 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड और डीएनए annealing के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए विकृतीकरण के 30 चक्र के साथ बढ़ाना। 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार प्रदर्शन करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर पीसीआर उत्पादों।
  4. से पीसीआर उत्पादों के 5 μl ले लोपिछले चरण और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन 28 चलाते हैं।
    1. डीएनए आकार मार्कर के रूप में एक 0.7% agarose जेल, 1x TAE बफर (40 मिमी Tris-एसीटेट, 1 मिमी EDTA), 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (EtBr) अंतिम एकाग्रता और 1 केबी सीढ़ी का प्रयोग करें। इलेक्ट्रोड के बीच 5 वी / सेमी की दूरी के सेट शक्ति के स्रोत वोल्टेज। लोड हो रहा है डाई के बारे में 2/3 जेल लंबाई के माध्यम से migrates जब वैद्युतकणसंचलन बंद करो। एक जेल प्रलेखन प्रणाली 28 का उपयोग कर जेल कल्पना।
      नोट: EtBr एक संदिग्ध कैसरजन है और ठीक से संस्था के नियमों के अनुसार, का निपटारा किया जाना चाहिए। EtBr युक्त जैल जब से निपटने के दस्ताने हमेशा पहना जाना चाहिए। सामग्री युक्त खत्म हैंडलिंग EtBr के बाद नए दस्ताने और पार प्रदूषण को रोकने के लिए अन्य सामग्री या उपकरण को संभालने से पहले बदलें।
  5. वांछित पीसीआर उत्पाद के लिए इसी आकार के साथ केवल एक ही डीएनए बैंड का पता लगाया जाता है, तो इस तरह के QIAquick पीसीआर शोधन किट समझौते के रूप में एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद के बाकी को शुद्धनिर्माता के प्रोटोकॉल के लिए आईएनजी।
    1. अन्य, गैर विशिष्ट बैंड भी मौजूद हैं, तो प्रारंभिक जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने के लिए पीसीआर उत्पाद के बाकी का उपयोग करें। कदम 1.1.4 में निर्दिष्ट एक ही मापदंड और शर्तों का उपयोग करें। जेल में अच्छी तरह से ~ पीसीआर उत्पादों के 45 μl लोड करने के लिए काफी बड़ी है कि सुनिश्चित करें। ब्याज की बैंड बाहर कट और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार QIAquick जेल निकालना किट का उपयोग कर जेल से डीएनए निकाल सकते हैं।

1.2)) (पूर्ण लंबाई संक्रामक एचआईवी -1 उपप्रकार बी वेक्टर में pNL4-3 डालें अंश का परिचय

  1. पीसीआर प्राइमरों के रूप में कदम 1.1.5 से शुद्ध पीसीआर उत्पादों का प्रयोग करें। एक पीसीआर प्रतिक्रिया में टेम्पलेट डीएनए के रूप में pNL4-3VifA 20 उपयोग और अन्य प्रतिक्रिया (चित्रा 2) में टेम्पलेट के रूप में pNL4-3VifB 20 का उपयोग करें। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 1x उच्च निष्ठा बफर का उपयोग, 0.2 मिमी dNTPs, उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ की 2 यू, प्राइमर डीएनए के 500 एनजी और एक अंतिम वॉल्यूम में टेम्पलेट डीएनए के 50 एनजी50 μl की Ume। 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा किया 10 सेकंड, 1 मिनट और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस 35 चक्रों: थर्मल साइकिल चालन के मापदंडों सेट करें।
  2. पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 यू DPN की मैं करने के लिए 50 μl जोड़ें और टेम्पलेट डीएनए को पचाने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्लास्मिड डीएनए एक मिथाइलेशन सक्षम बैक्टीरियल तनाव, उदा से अलग है कि सुनिश्चित करें।, Top10 रासायनिक सक्षम Escherichia कोलाई।
  3. का प्रयोग करें DPN मैं सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं को बदलने के लिए उत्पाद पच। Top10 रासायनिक सक्षम ई के साथ गर्मी के झटके परिवर्तन का उपयोग कोलाई, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार। पुनः संयोजक प्लाज्मिड युक्त बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए, 100 मिलीग्राम / एल कार्बेनिसिलिन युक्त Luria शोरबा (पौंड) संस्कृति प्लेटों का उपयोग करें।
    1. ~ 10 अच्छी तरह से अलग हो कालोनियों उठाओ और 100 मिलीग्राम / एल कार्बेनिसिलिन युक्त 3 मिलीलीटर लेग तरल माध्यम में प्रत्येक को अलग हो जाना और एक में 30 डिग्री सेल्सियस पर सेतेप्रकार के बरतन हे / एन।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, बैक्टीरियल तरल संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए को अलग करने के QIAprep स्पिन Miniprep किट का प्रयोग करें।
  4. प्लास्मिड डीएनए उचित डालने होता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए डबल प्रतिबंध पाचन 29 का प्रयोग करें। प्रतिबंध साइटों में से एक ही डालने के क्षेत्र के भीतर मौजूद है और अन्य प्रतिबंध साइट डालने के क्षेत्र के बाहर, एचआईवी -1 वेक्टर में केवल एक बार ही मौजूद है कि सुनिश्चित करें।
    1. एक 10 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में प्लास्मिड डीएनए की डाइजेस्ट कम से कम 300 एनजी। चयनित प्रतिबंध एंजाइमों के निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार चयन प्रतिबंध बफ़र्स, ऊष्मायन तापमान और गर्मी का समय है। कदम 1.1.4 में वर्णित के रूप में पचा डीएनए और रन जेल वैद्युतकणसंचलन के 9 μl ले लो। भविष्यवाणी आकार के डीएनए बैंड है कि पुनः संयोजक प्लास्मिड का चयन करें।
  5. सेंगर अनुक्रमण द्वारा पुनः संयोजक plasmids के अनुक्रम अखंडता की पुष्टि करें। दुर्लभ, अवांछित जबकिउत्परिवर्तन (एस) पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दौरान पेश किया जा सकता है।
    1. अनुक्रम प्लास्मिड डीएनए के दोनों किस्में। अनुक्रमण प्राइमरों डिजाइन करने के लिए कदम 1.1.1.1 में निर्देशों का पालन करें। इसके अलावा, कि आगे सुनिश्चित करने और क्रमशः, पुनः संयोजक प्लाज्मिड में नदी के ऊपर और डालने क्षेत्र के बहाव अनुक्रमण प्राइमरों पानी रखना कम से कम 50 बीपी रिवर्स।
    2. एक वाणिज्यिक डीएनए अनुक्रमण सेवा प्रदाता के लिए प्लास्मिड डीएनए और अनुक्रमण प्राइमरों सबमिट करें। सेवा प्रदाता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में डीएनए नमूने और प्राइमरों तैयार करें।
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए किट का उपयोग कर उत्परिवर्तित प्लास्मिड डीएनए के एक endotoxin मुक्त शेयर करें। निम्न चरण में अभिकर्मक के लिए endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए के कम से कम 1 माइक्रोग्राम तैयार करें।

1.3) परिचय छोटे पैमाने पर उत्परिवर्तनों वाया उत्परिवर्तजनन साइट निर्देशित

  1. आगे ओवरलैपिंग के साथ mutagenic प्राइमरों डिजाइन और इच्छित mutat युक्त प्राइमरों रिवर्सआयन (एस)। बेस (एस), एवजी डाला, या 10-15 मुताबिक़ ठिकानों से घिरे प्राइमरों के बीच में नष्ट होने की स्थिति। कदम 1.1.1.1 में निर्देशों का पालन करें।
  2. उत्परिवर्ती प्लास्मिड के संश्लेषण के लिए पीसीआर का प्रयोग करें। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 1x उच्च निष्ठा बफर का उपयोग, 10 मिमी dNTPs, उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ की 2 यू, आगे mutagenic प्राइमर का 0.5 माइक्रोन, रिवर्स mutagenic प्राइमर का 0.5 माइक्रोन और काइमेरिक pNL4-3VifB के 50 एनजी, कदम 1.2.6 से 50 μl के अंतिम मात्रा में। 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा किया 10 सेकंड, 1 मिनट और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस 25 चक्रों: थर्मल साइकिल चालन के मापदंडों सेट करें।
  3. दोहराएँ चरण 1.2.6 के लिए 1.2.2।

वायरल शेयर 2. पीढ़ी अभिकर्मक का प्रयोग

  1. आवश्यक वायरल शेयर वांछित और प्लास्मिड डीएनए की राशि की गणना। 10 4 आइयू, / मिलीलीटर या अधिक की एक वायरल अनुमापांक के साथ वायरल स्टॉक के 1.8 मिलीलीटर विकास प्रतियोगिता ASSA के दो सेट के लिए पर्याप्त हैवाईएस, monoinfections सहित प्रत्येक तीन प्रतियों में किया। 6 अच्छी तरह से थाली में किया एक अभिकर्मक के लिए, के बारे में 1.8 मिलीलीटर सतह पर तैरनेवाला प्रति अच्छी तरह से काटा जाता है। प्लास्मिड डीएनए से एक माइक्रोग्राम 6 अच्छी तरह से थाली में किया प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक है।
  2. 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, अभिकर्मक मिश्रण है, जैसे की 100 μl तैयार करते हैं।, प्लास्मिड डीएनए और सीरम मुक्त DMEM के 1 माइक्रोग्राम, 1 μl एक्स-tremeGENE 9 अभिकर्मक अभिकर्मक (या तुलनीय उत्पाद) से मिलकर।
    1. अच्छी तरह से प्रति 1 माइक्रोग्राम प्लास्मिड डीएनए का उपयोग कर की जरूरत प्लास्मिड डीएनए की मात्रा का निर्धारण करते हैं। प्लास्मिड डीएनए के अंतिम एकाग्रता कम से कम 50 एनजी / μl है कि सुनिश्चित करें।
    2. सीरम मुक्त मध्यम (DMEM) अच्छी तरह सूत्र का उपयोग प्रति की जरूरत है निर्धारित कितना: μl = 100 μl में DMEM के कुल मात्रा - μl में डीएनए की मात्रा।
  3. 6 अच्छी तरह से थाली में 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) कोशिकाओं / अच्छी तरह से में प्रचार मध्यम (DMEM + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते5% सीओ 2 माहौल। जरूरत के रूप में (2.1 कदम में निर्धारित) के रूप में कई कुओं बीज।
  4. , अभिकर्मक मिश्रण तैयार एक 1.8 मिलीलीटर polypropylene microcentrifuge ट्यूब में, ऊपर की गणना के रूप में, सीरम मुक्त DMEM की उचित मात्रा विभाज्य है, और फिर अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ने के लिए।
    1. पिपेट अभिकर्मक सीधे मीडिया समाधान में, microcentrifuge ट्यूब की प्लास्टिक की सतह के लिए यह जोड़ नहीं है। पिछले प्लास्मिड डीएनए जोड़ें। Pipet और नीचे धीरे समाधान मिश्रण करने के लिए। अभिकर्मक परिसरों के गठन की अनुमति के लिए आरटी पर 15 मिनट (25 डिग्री सेल्सियस से 15 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेते हैं।
    2. 6 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को एक बूंद-वार ढंग से मिश्रण जोड़ें। धीरे से मिलाने या अभिकर्मक परिसरों का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए कुओं ज़ुल्फ़।
    3. प्लास्टिक की चादर के साथ सील प्लेटें।
  5. 48 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं।
  6. ध्यान से इकट्ठा करने और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब throu के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें0.22 माइक्रोन फिल्टर शीर्ष gh।
  7. पलकों में रबर gaskets के साथ 1.8 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के लिए फ़िल्टर किया सतह पर तैरनेवाला के 250 μl या अधिक हस्तांतरण करने के लिए पिपेट का प्रयोग करें।
  8. दुकान का उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर supernatants फ़िल्टर किया।

3. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear पर वायरल स्टॉक्स के संक्रामक टिटर (PBMCs) का निर्धारण

  1. Phytohemagglutinin (पीएचए) के साथ PBMCs उत्तेजित। एक वायरल शेयर, बीज पूरा Iscove संशोधित है Dulbecco मध्यम में 2 एक्स 10 6 PBMCs (प्रति cIMDM; मानव इंटरल्यूकिन -2 के 20 यू / एमएल के साथ पूरक IMDM (एचआइएल-2), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) पूरक पीएचए (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ। 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर बीज PBMCs। 72 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर PBMCs सेते हैं।
  2. हार्वेस्ट पीएचए PBMCs को प्रेरित किया। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब गैर पक्षपाती पीएचए PBMCs स्थानांतरण। 10 मिनट के लिए 228 XG पर ट्यूब स्पिन। ध्यान से disruptin बिना सतह पर तैरनेवाला हटानेजी सेल गोली। CIMDM में 2 एक्स 10 5 PBMCs / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल गोली फिर से निलंबित।
  3. बीज 2 एक्स 10 4 पीएचए एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में PBMCs / अच्छी तरह से में 100 μl / अच्छी तरह से cIMDM को प्रेरित किया।
  4. वायरल शेयर की एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाओ। पहले, फिर पतला स्टॉक से, एक 96 अच्छी तरह से मास्टर थाली में बारह 3 गुना धारावाहिक dilutions बनाते हैं। इस कमजोर पड़ने योजना मिलीलीटर प्रति अप्रैल 10 - जून 10 संक्रामक इकाई (आइयू) की रेंज में वायरल titers का पता लगाने के लिए सिफारिश की है।
    1. उदाहरण के लिए, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 180 μl मीडिया के लिए वायरस शेयर के 20 μl जोड़ें। ध्यान से pipetting द्वारा कमजोर पड़ने से मिलाएं। तो पहले अच्छी तरह से 180 μl मीडिया में पतला शेयर के 90 μl हस्तांतरण और pipetting द्वारा अच्छी तरह मिला लें।
    2. अगले कुएं में 180 μl मीडिया के लिए वर्तमान में अच्छी तरह से ग्यारह गुना अधिक 90 μl स्थानांतरित द्वारा कमजोर पड़ने श्रृंखला जारी रखें। बढ़ाएँ या प्रारंभिक कमजोर पड़ने कमी अगर 10 6 आइयू / एमएल से अधिक titersया कम से कम 10 4 आइयू / एमएल, क्रमशः उम्मीद कर रहे हैं।
  5. चार प्रतियों में (3.3 कदम से) वरीयता प्राप्त PBMCs थाली करने के लिए मास्टर कमजोर पड़ने की थाली से क्रमानुसार पतला वायरल शेयर के 40 μl जोड़ें। 16-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  6. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 100 μl हटाने, और अच्छी तरह / 200 μl की कुल मात्रा के लिए ताजा cIMDM के 160 μl के साथ बदलें। सीओ 2 माहौल 5% (1 दिन) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  7. दिन 4, 7, 10 और 13 हस्तांतरण प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl व्यवधान बफर (पीबीएस में 2% TritonX-100) से सतह पर तैरनेवाला के 100 μl, और ताजा cIMDM के 100 μl के साथ की जगह पर। -20 डिग्री सेल्सियस पर supernatants स्टोर।
    1. नमूने और अनुमापांक स्थिर जब तक हर तीन दिन ताजा cIMDM जोड़कर रखना।
  8. 7 दिन और 1 का उपयोग कर पी 24 एलिसा द्वारा वायरल शेयर का 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (TCID 50) का निर्धारण3 नमूने के रूप में चरण 4 में वर्णित है।
    1. 13 दिन से प्राप्त TCID 50 दिन 7 से अनुमापांक की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक है, तो वायरस शेयर विस्तार करने के लिए एक लंबे समय की जरूरत हो सकती है। दो नमूने समय बिंदुओं से संक्रामक titers स्थिर (या कमी) हो जाते हैं जब तक बाद में नमूने का उपयोग कर पी 24 एलिसा दोहराएँ। उच्चतम titers के साथ नमूनों से चुनिंदा शेयरों।

4. एलिसा वायरल संक्रामक टिटर निर्धारण के लिए एचआईवी -1 पी 24 के जांच (Immunoabsorbant परख एंजाइम से जुड़ी)

नोट: निम्न प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में 30 में तैयार पी 24 प्रतिजन कब्जा प्लेट का उपयोग कर विकसित किया गया था। वाणिज्यिक एचआईवी -1 पी 24 एलिसा थाली / किट भी निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. नमूनों के साथ काम करने से पहले, काम शेयरों प्राथमिक एंटीबॉडी की (खरगोश विरोधी एचआईवी -1 SF2 पी 24 सीरमरोधी) तैयार करते हैं।
    1. आरटी पर पिघलना पी 24 सीरमरोधी।
    2. Phosphat में 10% FBS की 2 मिलीलीटर के साथ ग्लिसरॉल के 2.5 मिलीलीटर मिक्सई बफर खारा (पीबीएस)।
    3. सीरमरोधी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण।
    4. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के 1 मिलीलीटर।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कदम 3.7 से पिघलना नमूने हैं।
  3. पी 24 कब्जा प्लेट (0.05% के बीच-20 के साथ 1x पीबीएस) धोने बफर के साथ 5 बार धोएं।
  4. 50 μl / अच्छी तरह का नमूना मंदक (1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 0.2% बीच 20 RPMI-1640 में), तो उचित कुओं के लिए नमूने के 50 μl जोड़ें। केवल नकली / नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नमूना मंदक के साथ कम से कम तीन कुओं को शामिल करें। 4 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस या हे / एन पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. उपयोग करने से पहले ताजा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। प्राथमिक एंटीबॉडी मंदक (RPMI-1640 में 12% FBS) का उपयोग करने के शेयरों में काम कर रहे प्राथमिक एंटीबॉडी के 2,000 गुना कमजोर पड़ने: एक 1 बनाओ। एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने / नियंत्रण प्रति 100 μl समाधान के उपयोग के लिए पर्याप्त तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. उदाहरण के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी में काम कर रहे के 5 μl जोड़ने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त समाधान बनाने के लिए10 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मंदक के शेयरों एनजी।
  6. धोने बफर के साथ कब्जा थाली 5 बार धोएं।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ें। एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  8. उपयोग करने से पहले ताजा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। माध्यमिक एंटीबॉडी मंदक (7% FBS, RPMI-1640 में 0.01% बीच 20) का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर बकरी विरोधी खरगोश एचआरपी) के 14,400 गुना कमजोर पड़ने: एक 1 बनाओ। Pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए, एक दो कदम धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने / नियंत्रण प्रति 100 μl समाधान के उपयोग के लिए पर्याप्त तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. उदाहरण के लिए, पहली माध्यमिक एंटीबॉडी मंदक के 99 μl के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 μl जोड़ने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त समाधान बनाने के लिए। फिर 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मंदक के लिए सबसे पहले कमजोर पड़ने के 70 μl जोड़ें।
  9. धो कब्जा थाली 5 टिमधोने बफर के साथ ते।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ें। एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  11. धो प्लेट धोने बफर के साथ 5 बार।
  12. आर टी TMB सब्सट्रेट के 100 μl जोड़ें। प्रकाश से बचाने के लिए एक बंद कंटेनर में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  13. आर टी स्थान पर समाधान (1 एनएच 2 अतः 4) के 100 μl जोड़ें।
  14. प्रत्येक अच्छी तरह से एक microplate रीडर का उपयोग करने में 450-650 एनएम पर absorbance पढ़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से संक्रमित या असंक्रमित स्कोर करने के लिए absorbance के मूल्य का प्रयोग करें। Absorbance के मूल्य नकारात्मक / नकली नियंत्रण कुओं से पढ़ने के मूल्य की तुलना में कम से कम तीन गुना अधिक है अगर संक्रामक वायरस को रोकने के लिए एक अच्छी तरह से विचार करें। रीड-Meunch विधि 31 का उपयोग कर वायरल शेयर की TCID 50 की गणना।

5. वायरल विकास काइनेटिक्स की स्थापना

5.1) Monoinfection

  1. बीज 3 एक्स 10 5 पीएचए उत्तेजित PBMC / अच्छी तरह से 48 अच्छी तरह से थाली में/ अच्छी तरह से 500 μl की कुल मात्रा में है। टीका जब तक एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों रखें।
  2. प्रत्येक वायरस के लिए, cIMDM के 2 मिलीलीटर में 6,000 आइयू युक्त एक inoculum तैयार करते हैं।
  3. वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को inoculum (1500 आइयू) के 500 μl जोड़कर तीन प्रतियों में कुओं टीका लगाना। संक्रमित कोशिका संवर्धन के अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से 1 मिलीग्राम / है और MOI के 0,005 है।
  4. विभाज्य एक बैकअप के रूप में सहेजा गया है, जिनमें से एक शाही सेना के अलगाव के लिए दो 96 अच्छी तरह प्लेटें, में से प्रत्येक के शेष inoculum के 200 μl।
  5. 16-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं।
  6. धो संस्कृतियों टीका के बाद 16-24 घंटा।
    1. निकालें और संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 750 μl त्यागें।
    2. ताजा cIMDM के 750 μl जोड़ें। 300 x जी पर 10 मिनट के लिए प्लास्टिक की चादर और स्पिन में प्लेटें लपेटें। निकालें और 750 μl सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. ताजा cIMDM के 750 μl जोड़ें। एक 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेmosphere दिन (1)।
  7. दैनिक दिन 2 से 7 दिन के लिए नमूना संस्कृतियों।
    1. एक 1.8 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 500 μl स्थानांतरण। 3,000 x जी पर 1 मिनट के लिए स्पिन।
    2. ट्रांसफर आरएनए अलगाव के लिए दो 96 अच्छी तरह से नमूना प्लेटों के लिए सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला के 200 μl, फिर बैकअप के रूप में एक थाली की बचत। शाही सेना अलगाव जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर supernatants।
    3. प्रत्येक संस्कृति के लिए 500 μl ताजा cIMDM जोड़ें। एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. प्रयोग के अंत में Wescodyne में संस्कृतियों त्यागें।
    5. निर्माता की मानक प्रोटोकॉल के बाद सतह पर तैरनेवाला के 200 μl (जैसे QIAamp वायरल शाही सेना मिनी किट के रूप में उपयोग वाणिज्यिक किट) से शाही सेना को अलग। नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए, क्विएज़न QIAxtractor का उपयोग करें।
    6. सीडीएनए संश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शाही सेना के नमूने।

5.2) सीडीएनए संश्लेषण (रिवर्स प्रतिलेखन)

  1. प्रत्येक शाही सेना के लिएपर्याप्त, वायरल शाही सेना के 10 μl करने के लिए (7995 के लिए 5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC -3 ', HXB2 न्यूक्लियोटाइड 7968) dNTP के 1.2 nmol और सीडीएनए संश्लेषण प्राइमर का 1.2 pmol, जोड़ें। 14 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें। मिश्रण और ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में स्पिन करने के लिए ट्यूब झटका।
  2. मास्टर मिश्रण तैयार किया जाता है तब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़, 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
  3. 5x पहले कतरा बफर (250 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.3, 375 मिमी KCl, 15 मिमी 2 MgCl), 5 मिमी डीटीटी, 120 SuperScriptIII के यू और 240 यू RNase के अवरोध करनेवाला का उपयोग करते हुए मास्टर मिश्रण तैयार करें। 10 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें।
  4. मिश्रण और इकट्ठा करने के लिए स्पिन करने के लिए शाही सेना मिश्रण, झटका करने के लिए मास्टर मिश्रण के 10 μl जोड़ें।
  5. सीडीएनए के संश्लेषण अनुमति देने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। जरूरत के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  6. मिश्रण करने के लिए RNase एच, चलचित्र के 2 यू जोड़ें, और फिर इकट्ठा करने के लिए स्पिन।
  7. 20 मिनट सेते37 डिग्री सेल्सियस पर। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सीडीएनए।

5.3) सीडीएनए Quantitation qPCR प्रणाली का प्रयोग

  1. एक मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें। / 3 एक्स 10 6 प्रतियों से, धारावाहिक कमजोर पड़ने 10 गुना pNL4-3VifA की 30 प्रतियां / μl, करने के लिए नीचे μl करो। Dilutions के लिए आसुत जल का प्रयोग करें। उपयोग करने से पहले ताजा मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें या छोटे समूहों के लिए तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। मत मानकों से अधिक तीन बार फ्रीज पिघलना।
  2. एक 96 अच्छी तरह से qPCR प्रतिक्रिया थाली सेट करें। प्रत्येक थाली में कम से कम प्रत्येक सीडीएनए नमूना का डुप्लिकेट नकारात्मक नियंत्रण के कम से कम एक अच्छी तरह से, मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला के तीन प्रतियों में शामिल है, और यह सुनिश्चित करें कि।
  3. प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए, qPCR के मास्टर मिश्रण के 12.5 μl, 0.2 माइक्रोन जांच, आगे और रिवर्स प्राइमरों के 0.8 माइक्रोन प्रत्येक और सीडीएनए का 1 μl या (अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण के लिए) मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला या पानी / बफर का उपयोग करें। 25 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें। qPCR जांच प्रकाश सेन हैsitive। बंद कंटेनर में रखें।
    1. VifAB आगे प्राइमर (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VifA रिवर्स प्राइमर (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT -3 ') और VifAB जांच (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3: pNL4-3VifA आधारित आणविक क्लोन से व्युत्पन्न सीडीएनए का पता लगाने के लिए, VifA प्राइमर-जांच का उपयोग '-MGBNFQ)। VifAB आगे प्राइमर, VifAB जांच और VifB रिवर्स प्राइमर (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT -3 '): pNL4-3VifB आधारित क्लोन से व्युत्पन्न सीडीएनए के लिए, VifB प्राइमर जांच का उपयोग करें।
  4. 2 मिनट, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और 15 सेकंड और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के लिए पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों सेट करें। QPCR मशीन के संचालन के लिए निर्माता की समर्थन दस्तावेज से परामर्श करें।
  5. तीन प्रतियों मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला से डेटा का उपयोग एक मानक वक्र की गणना। नकल संख्या निर्धारित करने के लिए मानक वक्र करने के लिए सीडीएनए नमूना के प्रवर्धन डेटा की तुलना करें। दा के लिए निर्माता के समर्थन दस्तावेज से परामर्श करेंप्रादेशिक सेना प्रसंस्करण।

5.4) वायरल घातीय वृद्धि चरण का निर्धारण करते हैं

  1. एक्स अक्ष और वाई अक्ष के साथ सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या के साथ नमूना दिन के साथ वायरल विकास कैनेटीक्स साजिश और वायरल घातीय वृद्धि चरण की पहचान अर्थात्।, वायरल सीडीएनए एक घातीय प्रगति में इस संख्या में वृद्धि को कॉपी करते हैं।
  2. जी आर सी वेब उपकरण (प्रयोग http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ वायरल विकास दर (G) की गणना करने के लिए)। इस आवेदन में, जी आर सी उपकरण सीडीएनए निवेश के रूप में कम से कम दो बार के अंक से नंबर की प्रतिलिपि स्वीकार करता है, और वायरल विकास दर (G) outputs। सही विकास दर प्राप्त करने के लिए (ऊपर कदम 5.4.1 देखें) घातीय वृद्धि चरण के भीतर ही समय बिंदु डेटा का उपयोग करें। जी आर सी वेब उपकरण में इस्तेमाल किया गणितीय मॉडल की एक विस्तृत विवरण के लिए 20 से देखते हैं।

6. ग्रोथ प्रतियोगिता परख

  1. बीज 3 एक्स 10 5 </ Sup> पीएचए उत्तेजित PBMCs (या 1 एक्स 10 5 CEMx174 कोशिकाओं) एक 48 अच्छी तरह से फ्लैट तली थाली में अच्छी तरह से प्रति 500 μl कुल मात्रा में।
  2. टीका जब तक एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस में थाली रखें।
  3. प्रत्येक वायरस के लिए, 6,000 आइयू युक्त inoculum के 3 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
  4. दोहरे संक्रमण inoculum बनाने के लिए एक बाँझ ट्यूब करने के लिए प्रत्येक वायरल inoculum के 1.5 मिलीलीटर स्थानांतरण। एक 48 अच्छी तरह से थाली में 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं को दोहरी inoculum (1500 आइयू) के 500 μl जोड़ें। अंतिम संस्कृति मात्रा में अच्छी तरह से / 1 मिलीलीटर है। विभाज्य शाही सेना के अलगाव के लिए दो 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए inoculum के 200 μl; एक पीठ के रूप में एक थाली बचाने के लिए।
  5. 16-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. धो संस्कृतियों टीका के बाद 16-24 घंटा।
    1. निकालें और संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 750 μl त्यागें।
    2. ताजा cIMDM के 750 μl जोड़ें। 300 x जी पर 10 मिनट के लिए प्लास्टिक की चादर और स्पिन में प्लेटें लपेटें। निकालें और 750 त्यागने81, एल सतह पर तैरनेवाला।
    3. ताजा cIMDM के 750 μl जोड़ें। एक 5% सीओ 2 के वातावरण (1 दिन) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. का चयन नमूना बार कदम 5.4.1 में मनाया घातीय वृद्धि चरण के भीतर कम से कम 3 समय बिंदुओं को शामिल करने के लिए।
    1. प्रत्येक नमूना लेने के लिए, कदम 5.1.7 का पालन करें।
  8. खंड 5.2 में वर्णित के रूप में सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
  9. QPCR का उपयोग कर वायरल संस्करण अनुपात निर्धारित करते हैं।
    1. 3 एक्स 10 6 प्रतियों से प्रत्येक चरण में 10 गुना गिराए, तीन प्रतियों में एक मानक धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार / 30 प्रतियां / pNL4-3VifA की μl को μl।
    2. एक 96 अच्छी तरह से qPCR प्रतिक्रिया थाली सेट करें। प्रत्येक थाली में कम से कम एक नकारात्मक नियंत्रण, तीन प्रतियों में मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला है, और प्रत्येक सीडीएनए नमूना के डुप्लिकेट होता है कि सुनिश्चित करें।
    3. प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए, qPCR के मास्टर मिक्स के 12.5 μl, 0.2 माइक्रोन जांच, 0.8 आगे की माइक्रोन प्रत्येक और प्राइमरों रिवर्स और सीडीएनए का 1 μl या मानक डी का उपयोग ilution श्रृंखला या (नकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए) पानी / बफर। 25 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें। qPCR जांच बंद कंटेनर में रखने के लिए, प्रकाश के प्रति संवेदनशील है।
      1. नकारात्मक नियंत्रण और मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला में और सीडीएनए नमूना से एक डुप्लिकेट के साथ संकेतों का पता लगाने के लिए VifA प्राइमर जांच का प्रयोग करें। सीडीएनए नमूना के अन्य दो प्रतियों के साथ VifB प्राइमर जांच का प्रयोग करें।
    4. 15 सेकंड और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों 10 मिनट के लिए, फिर 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस से 95 डिग्री सेल्सियस पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों सेट, और। QPCR मशीन के संचालन के लिए निर्माता की समर्थन दस्तावेज से परामर्श करें।
    5. मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला से प्रवर्धन डेटा का उपयोग कर मानक वक्र की गणना। नकल संख्या निर्धारित करने के लिए मानक वक्र करने के लिए सीडीएनए नमूनों की प्रवर्धन डेटा की तुलना करें। डाटा प्रोसेसिंग के लिए निर्माता के समर्थन दस्तावेज से परामर्श करें।
    6. (जी आर सी वेब उपकरण का उपयोग करेंol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) सापेक्ष वायरल उपचार (डी) की गणना करने के लिए।
      नोट: जी आर सी उपकरण सीडीएनए निवेश के रूप में कम से कम दो बार के अंक से नंबर या वर्णलेख शिखर ऊंचाइयों को कॉपी स्वीकार करता है, और दो ​​वायरस के बीच शुद्ध वृद्धि दर का अंतर (डी) outputs। उपकरण दो बार बिंदु डेटा से शुद्ध वृद्धि दर की गणना कर सकते हैं, यह दृढ़ता से तीन या उससे अधिक समय बिंदुओं से इनपुट डेटा के लिए सिफारिश की है। घातीय वृद्धि चरण के भीतर समय बिंदुओं से प्राप्त केवल डेटा का उपयोग सही विकास दर प्राप्त करने के लिए (कदम 5.4 देखें)। जी आर सी वेब उपकरण में इस्तेमाल किया गणितीय मॉडल की एक विस्तृत विवरण के लिए 20 से देखते हैं।
  10. वर्णलेख शिखर-ऊंचाइयों का उपयोग कर वायरल अनुपात का निर्धारण करते हैं
    1. पीसीआर एचआईवी -1 VifFwd का उपयोग कर VifAB अनुक्रम टैग युक्त VIF टुकड़े बढ़ाना (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG -3 '; HXB2 5266-5291 पदों) और VifRev प्राइमरों (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC -3 '; HXB2 पदों 5579-5553)।
      1. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, सीडीएनए का 1 μl, 1x एनएच 4 बफर, प्रत्येक प्राइमर के 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी dNTP, यू Taq पोलीमरेज़ का 2.5, और 0.45 माइक्रोन का उपयोग करें। 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें।
      2. 30 सेकंड के लिए, 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 34 चक्रों के बाद 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 3 चक्र के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों सेट, और फिर 70 डिग्री 1 मिनट के लिए सी, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार QIAquick पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों शुद्ध।
    3. सेंगर अनुक्रमण के लिए एक डीएनए अनुक्रमण सेवा प्रदाता के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पादों को जमा करें।
    4. अनुक्रमण सेवा द्वारा प्रदान की जानी चाहिए जो औसत पढ़ें गुणवत्ता स्कोर की जाँच करें। औसत आधार कॉल सटीकता कम से कम 85% है, तो 6.10.3 करने के लिए कदम 6.10.1 फिर से करना
    5. (ChromatQuan वेब उपकरण का उपयोग करेंf="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) हर समय बिंदु पर वायरल अनुपात की गणना करने के लिए। उपकरण अनुक्रम ट्रेस फ़ाइल (* .ab1) और ब्याज के न्यूक्लियोटाइड साइट के अनुक्रम 5 'की आवश्यकता है। उपकरण निर्दिष्ट स्थल पर शिखर तीव्रता को मापता है। शिखर तीव्रता के अनुपात दो वायरस (चित्रा 4 बी) के राशन से मेल खाती है।
    6. जी आर सी वेब उपकरण (प्रयोग http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ वायरल रिश्तेदार फिटनेस (डी) की गणना करने के लिए निवेश के रूप में) और दर्ज शिखर तीव्रता। कदम 6.10.6 देखें। 20

Representative Results

एचआईवी -1 चुप-पी 24 में एकल एमिनो एसिड में परिवर्तन की फिटनेस प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम एचआईवी -1 COTB-पी 24 जीन 23,32,33 युक्त pNL4-3 प्लाज्मिड में म्यूटेशन शुरू करने की oligonucleotide निर्देशित mutagenesis इस्तेमाल किया। वायरल शेयरों 293T कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा उत्पन्न और 48 घंटे के बाद काटा गया। हम रीड-MUENCH विधि 31 से प्रत्येक वायरल शेयर का 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (TCID 50) का अनुमान है। प्रोटोटाइप का TCID 50 और उत्परिवर्ती वायरस 10 4 से 10 5 आइयू / एमएल (चित्रा 3) को लेकर।

पुनः संयोजक वायरस के विकास कैनेटीक्स 0,005 के MOI में एक एकल दाता से PBMCs में स्थापित किए गए थे। आर टी-qPCR के छह दिनों के लिए दैनिक वायरल सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सभी उत्परिवर्ती और प्रोटोटाइप वायरस <वायरल शाही सेना प्रतिलिपि संख्या में वृद्धि की एक कम ढलान (द्वारा संकेत के रूप में वायरल विकास धीमा है, जो दिन में 2 और 4 दिन, निम्नलिखित के बीच तेजी से बढ़ीमजबूत> 3B चित्रा)। सीडीएनए में कमी (inoculum के लिए इसी) 0 दिन और दिन 2 के बीच संख्या कोशिकाओं को वायरस के अवशोषण और 1 दिन धोने (कदम 5.1.6) द्वारा अनबाउंड virions की हटाने की वजह से है की नकल। घातीय विकास के चरण में, सभी तीन म्यूटेंट प्रोटोटाइप वायरस (चित्रा -3 सी) की तुलना में धीमी विकास दर (G) था।

सभी तीन म्यूटेंट 0,005 की कुल MOI में वृद्धि प्रतियोगिता assays में प्रोटोटाइप वायरस के खिलाफ हिस्सा थे। Dually संक्रमित संस्कृतियों में वायरल विकास कैनेटीक्स monoinfection के समान थे; वायरल घातीय वृद्धि चरण दिन 2 और 4 के बीच था, और वायरल वृद्धि दिन 5 (चित्रा -4 ए) के चारों ओर एक पठार पर पहुंच गया।

वायरल विकास दर मतभेद समय के साथ वायरल अनुपात में परिवर्तन से प्राप्त किए गए। वायरल अनुपात सीडीएनए प्रतिलिपि संदर्भ की संख्या और आरटी-qPCR, का उपयोग कर उत्परिवर्ती वायरस पर और तुलना शिखर ऊंचाइयों द्वारा आधारित गणना की गईइस क्रम में दो वायरस (चित्रा 4 बी) भेद न्यूक्लियोटाइड स्थलों पर chromatograms। चोटी ऊंचाई और वायरल शाही सेना प्रतिलिपि संख्या तरीकों का उपयोग निर्धारित विकास दर मतभेद इसी तरह के परिणाम (चित्रा 4C) मिले। सभी तीन म्यूटेंट सबसे कम फिटनेस (चित्रा 4C) होने के उत्परिवर्ती I256V के साथ प्रोटोटाइप वायरस की तुलना में कम प्रतिकृति फिटनेस था।

चित्र 1
चित्रा 1: इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रवाह आरेख वायरल शेयरों के वायरस तैयारी प्रोटोकॉल चिंता एचआईवी -1 पुनः संयोजक क्लोन के निर्माण और पीढ़ी।। स्वास्थ्य Assays के प्रोटोकॉल वायरल विकास कैनेटीक्स की स्थापना और रिश्तेदार वायरल फिटनेस का निर्धारण करने के लिए कर रहे हैं। धराशायी लाइनों के प्रोटोकॉल के लिए वैकल्पिक प्रवाहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। उदाहरण के लिए, एक उत्परिवर्तन एचआईवी -1 NL4-3 में सीधे पेश किया जा सकताएक पुनः संयोजक क्लोन पैदा करने के बिना आणविक क्लोन।

चित्र 2
चित्रा 2:। ओवरलैप विस्तार पीसीआर (ए) का उपयोग एचआईवी -1 NL4-3 COTB चुप-पी 24 पुनः संयोजक आणविक क्लोन के निर्माण काइमेरिक प्राइमरों डिजाइन। 5 'प्राइमरों के हिस्सों NL4-3 वेक्टर अनुक्रम होते हैं और' 3 हिस्सों डालने के अनुक्रम की छोर होते हैं। (बी) chimeric प्राइमरों डालने टुकड़ा, COTB चुप-पी 24 बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है। (सी) डालने के टुकड़े एक नया पुनः संयोजक प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए एक दूसरे की पीसीआर के लिए प्राइमरों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3:। PBMCs में वायरल विकास विशेषताओं (ए) के 10 TCID 50 (बी) के MOI = 0.005 पर शुरू कर दिया monoinfections में वायरल विकास कैनेटीक्स। पैनल (बी) से ली गई घातीय वृद्धि चरण (दिनों 2-4) सहित छह दिनों से अधिक (सी) वायरल वृद्धि दर। दिखाया मूल्यों एक प्रयोग से तीन प्रतिकृति का औसत प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4: वायरल विकास और रिश्तेदार फिटनेस निर्धारण (ए) dually संक्रमित PBMC संस्कृतियों में वायरल विकास।। T242N और प्रोटोटाइप वायरस (बी) अनुपात आर टी-qPCR या अनुक्रमण चोटी ऊंचाई पद्धति का उपयोग करके निर्धारित की। (ए) के रूप में दिखाया गया (सी) उत्परिवर्ती और dually संक्रमित संस्कृतियों में प्रोटोटाइप वायरस के बीच नेट वायरल विकास दर मतभेद (डी),। डी मूल्यों च गणना की गई(बी) में दिखाया गया है वायरल अनुपात डेटा रोम। दिखाया मूल्यों एक प्रयोग से तीन प्रतिकृति का औसत प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

पुनः संयोजक एचआईवी -1 आणविक क्लोन और विकास प्रतियोगिता assays के निर्माण: प्रस्तुत प्रोटोकॉल दो मुख्य भागों शामिल थे। एक dually संक्रमित कोशिका संस्कृति में दो वायरस भेद करने के लिए आदेश में यह प्रतिस्पर्धा आणविक क्लोन एक आर टी-qPCR प्राइमर जांच परख द्वारा या सेंगर अनुक्रमण से पता लगाया जा सकता है जो अनुक्रम टैग, कि रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल एचआईवी -1 NL4-3 VIF के एक ही क्षेत्र पर कब्जा है और एक ही अमीनो एसिड अनुक्रम सांकेतिक शब्दों में बदलना, लेकिन छह पर्याय म्यूटेशन से भिन्न होते हैं जो VifA और VifB टैग, का उपयोग करता है। ये परिवर्तन को प्रभावित नहीं दिखाया गया वायरल प्रतिकृति फिटनेस 20। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल पीसीआर आधारित क्लोनिंग विधि प्रतिबंध साइट आधारित क्लोनिंग की तुलना में, क्लोनिंग साइटों के चयन में और अधिक लचीलापन प्रदान करता है। हालांकि, पीसीआर क्लोनिंग की दक्षता में डालने का आकार बढ़ता है के रूप में कम हो जाती है। डालने के आकार की वर्तमान सीमा ~ 5 KB 34 है। पीसीआर आधारित क्लोनिंग और साइट का निर्देश mutagenesi के लिएएस, एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के अतिरिक्त परिवर्तन की संभावना को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। उत्पादों की पर्याप्त मात्रा में उपज के लिए आवश्यक पीसीआर चक्र की न्यूनतम संख्या का उपयोग भी सिफारिश की है। हमारे अनुभव में, हम यहाँ वर्णित पीसीआर आधारित क्लोनिंग और साइट निर्देशित mutagenesis के कदम के बाद किसी भी अतिरिक्त म्यूटेशन का पता नहीं चला। फिर भी पीसीआर उत्पादों को किसी भी अवांछित परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए अनुक्रम किया जाना चाहिए। आदर्श रूप में, पूरे एचआईवी कोडिंग क्षेत्र resequenced किया जाना चाहिए।

कम से कम तीन नमूने समय अंक घातीय वृद्धि चरण 9 के भीतर जांच की जानी चाहिए। वायरल विकास कैनेटीक्स पहले विकास प्रतियोगिता के लिए उपयुक्त संस्कृति अवधि और नमूने समय अंक निर्धारित करने के लिए दैनिक नमूने का उपयोग कर स्थापित किया जाना चाहिए। वायरल विकास कैनेटीक्स को प्रभावित करता है एक पहलू है कि संक्रमण (MOI) की बहुलता है। इसे और अधिक भूमिका की उपज के लिए दिखाया गया था के रूप में यह प्रोटोकॉल, monoinfection और विकास प्रतियोगिता दोनों के लिए 0,005 की कुल MOI का उपयोग करता हैकम MOIS 9 से प्रतिमा का परिणाम है। बहरहाल, कम MOIS यदि आवश्यक हो तो एक लंबी घातीय वृद्धि चरण प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन परिणाम स्थिरता की कीमत पर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के वायरस की फिटनेस मतभेद पहले से आम तौर पर अज्ञात हैं यह सोचते हैं कि 50:50 के एक प्रारंभिक संक्रमण अनुपात से पता चलता है। वायरल प्रतिकृति कैनेटीक्स में महत्वपूर्ण मतभेद का सुझाव प्रारंभिक आंकड़ों है जब वहाँ हालांकि, असमान इनपुट अनुपात के उपयोग के लिए उपयुक्त हैं। इन मामलों में, 70:30 के एक संक्रमण अनुपात कम फिट वायरस अतिरिक्त 9 में रखा गया है, जहां एक बड़ी फिटनेस अंतर का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए सिफारिश की है।

वायरल विकास कैनेटीक्स, और एचआईवी -1 उप-प्रकार बी का उपयोग कर प्रतियोगिता assays के अनुकूलित किया गया विकास का प्रदर्शन करने के लिए TCID 50 का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल, जिसका PBMC एक एकल दाता से NL4-3 COTB-पी 24, और PBMCs एचआईवी के लिए लगातार संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है इन विट्रो में 1 संक्रमण। संस्कृति अवधिऔर इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत नमूने समय अंक मानव PBMCs में एचआईवी -1 ग्रुप एम वायरस के अध्ययन के लिए उपयुक्त होने की संभावना है। एक ही स्रोत से PBMCs का प्रयोग अत्यधिक वायरल प्रतिकृति अलग दाता कोशिकाओं 35 में अलग-अलग हो सकता है के रूप में अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है। एक प्रतिस्थापन एक ही पूल सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है कि प्रदान के रूप में कम वांछनीय हालांकि, कई दाताओं से जमा PBMCs इस्तेमाल किया जा सकता है। एक अन्य विकल्प सेल लाइनों का उपयोग है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल टी सेल लाइन CEMx174 23,36 के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, यह वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या फिर से अनुकूलित लगातार सेल के विकास को प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। यह वृद्धि प्रतियोगिता चरणों में उपयुक्त नमूने समय अंक निर्धारित करने के लिए, विभिन्न सेल लाइनों में भिन्नता होने की संभावना है के रूप में वायरल विकास कैनेटीक्स भी, फिर से स्थापित किया जाना चाहिए।

फिटनेस की गणना के लिए वायरल अनुपात निर्धारित करने के लिए दो अलग अलग तरीकों protoc में शामिल किए गए हैंराजभाषा। पहले प्रत्येक नमूने समय बिंदु पर वायरल सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या को मापने के लिए आर टी-qPCR का उपयोग करता है। वायरल प्रतिकृति फिटनेस तो सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या के आधार पर, वायरल अनुपात से गणना की गई। वैकल्पिक रूप से, वायरल अनुपात VifAB टैग स्थलों पर वर्णलेख शिखर ऊंचाई के अनुपात के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। दो तरीकों तुलनीय परिणाम (चित्रा 4) मिले। वर्णलेख शिखर ऊंचाई विधि एक इंजीनियर अनुक्रम टैग के बिना अन्य एचआईवी -1 उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है। आर टी-qPCR, वायरल वेरिएंट भेद करने के लिए प्राइमरों या जांच के उपयोग के पहले सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए के लिए (20 देखें)। फिर भी, आर टी-qPCR के इस तरह के घातीय वृद्धि चरण के भीतर पहली बार बात से उन के रूप में वायरल शाही सेना की एक छोटी राशि के साथ नमूने के लिए बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है। वायरल सीडीएनए के प्रत्यक्ष माप भी शाही सेना निकासी और सीडीएनए संश्लेषण से उत्पन्न हो सकती है कि तकनीकी समस्याओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। अनुक्रम टैग के साथ आणविक क्लोन का उपयोग करते हुए एक लागत प्रभावी समाधान टी प्रदान करता हैआर टी-qPCR के तरीकों के ओ, के रूप में प्राइमरों और जांच के केवल दो जोड़े कई वायरस का अध्ययन करने की जरूरत है। यह रणनीति भी अनुक्रमण अध्ययन में सभी वायरस को भर में एक ही साइट पर किया जाता है के रूप में अनुक्रम में चोटी ऊंचाई बदलाव की समस्या, पड़ोसी ठिकानों 37 की वजह से chromatograms से बचा जाता है। आर टी-qPCR और सेंगर अनुक्रमण के लिए उत्पादित पीसीआर उत्पादों को भी अन्य तरीकों के साथ उपयोग के लिए ऐसे व्यक्ति क्लोन 12,13 के थोक अनुक्रमण, एचटीए 4,7,17,19, या oligonucleotide बंधाव परख (ओला) 38 के रूप में वायरल अनुपात निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा। राय व्यक्त की साथ साथ लेखक के हैं और सरकारी या अमेरिका के रक्षा विभाग या सेना विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व के रूप में नहीं लगाया जाना चाहिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers IDT Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F-549S
High-fidelity buffer Thermo Scientific F-549S
dNTP Bioline Bio-39026
Thermal cycler Life Technologies Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye Thermo Scientific R0631
1 kb Plus DNA ladder Invitrogen 10787-018
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
DpnI enzyme New England Biolabs R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli Invitrogen C4040-10
Luria Broth base powder Invitrogen 12795-084
Carbenicillin Research Products International C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit  Qiagen 27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 6365787001
HEK 293T-17 ATCC CRL-11268 http://www.atcc.org/
0.22 μm filter top tube VWR International 89220-716 
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) Life Technologies 31980-030
RPMI-1640 media Life Technologies 61870-036
Phytohemagglutinin (PHA) Thermo Scientific R30852801
Human Interleukin-2 Roche 11147528001
Fetal bovine serum JR Scientific 43640
Penicillin and Streptomycin Corning Cellgro 30-001-CI
6 well plate VWR Scientific 73520-906
48 well plate VWR Scientific 62407-338
96 well flat-bottomed plate ISC Bioexpress T-3015-4
96 well round-bottomed plate BD Falcon 353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube Mt. Baker Bio MBD-1500
1.5 ml tubes w/ O-ring VWR Scientific 89004-290
50 ml conical tube ISC Bioexpress C-3317-6
ELISA
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Phosphate buffer saline (PBS) Invitrogen 14190-250
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
glycerol Sigma-Aldrich G5516
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum NIH AIDS Reagent Program 4250
Goat anti-rabbit HRP KPL 474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-01
H2SO4 Fisher Scientific A300-500 Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 min.
HIV p24 standard AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader Molecular Devices VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
dNTP Bioline Bio-39026
SuperscriptIII Invitrogen 18080-085
First-strand buffer  Invitrogen 18080-085
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 18080-085
Rnase inhibitor Roche 3335402001
RnaseH Invitrogen 18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine Life Technologies Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Forward, reverse primer IDT Custom order
Probe Life Technologies Custom order
optical 96 well reaction plate Life Technologies I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase) Bioline Bio-21043
NH4 buffer  Bioline Bio-21043
MgCl2 Bioline Bio-21043
Sequencing primer IDT Custom order
QIAxcel Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider http://www.htseq.org/
GRC web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi

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References

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