Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52610
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2
1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

Introduction

Viral replikation kondition definieras som kapaciteten hos ett virus att producera infektiöst avkomma i en given miljö 1 och är en viktig bidragande faktor vid bestämning av förekomsten av en virusvariant på populationsnivå över tiden 2. Som in vivo-fitness studier inte genomförbart med patogena humana virus, såsom HIV-1, olika in vitro och ex vivo replika fitness analyser har utvecklats för att studera effekterna på lämplighet till följd av läkemedelsresistens och immunutrymnings mutationer, epistasis och utvecklingen på virala populationer 3-6. Bland olika fitness analyser, är tillväxt kompetitionsanalyser erkänt att ge mer känsliga och giltiga mått på fitness skillnader som två eller flera virusvarianter konkurrerar om samma cell befolkningen under exakt samma miljöförhållanden, som sker in vivo 1,7,8. Innan du börjar tillväxtkonkurrensexperiment, flera variables måste fastställas, bland annat användningen av olika multipliciteter infektions (MOI), viral ingångsförhållande, och tidpunkten för provtagning för analys. Vi har studerat effekterna av dessa parametrar på virala tillväxtkinetik och om resultatet av konkurrensexperiment, och har identifierat viktiga faktorer som är nödvändiga för robusta mätningar av HIV-1 fitness i cellkultur 9.

Förutom analysvariabler, det finns en mängd olika metoder för att kvantifiera virusvarianter i tillväxtkonkurrensexperiment. Bulk 10,11 eller klonal sekvenering 12,13 har använts för att bestämma förhållandet mellan de konkurrerande virus baserat på de nukleotid-frekvenserna på platsen (er) av intresse. Relativ fitness härrör från förändringar i detta förhållande över tiden. Denna metod är bekväm eftersom DNA-sekvense tjänster är allmänt tillgängliga. Den parallella allelspecifik sekvenseringsmetod (PASS) möjliggör sekvense på multipla ställen och detekteringen av rekombinanter 14 15 eller synonyma mutationer 4,16-18 som taggar för att skilja de konkurrerande virus genom sekvensering, heteroduplexspårningsanalyser (HTA) 4,7,17,19 eller omvänd transkription-kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) 15,16,18,20, som alla kan göras tillämpliga för att studera konkurrerande stammar oavsett sekvenslikhet. Ett ytterligare steg krävs för att införa taggar till virala genom och RT-qPCR analys kräver också specifika reagens och instrumentering. Vi har funnit att bulk Sanger sekvense ger jämförbara resultat 9.

Efter tillväxt konkurrens, är virusreplikation fitness presenteras som relativ kondition, eller fitness förhållandet mellan two virusvarianter. Den relativa lämpligheten hos en virus kan definieras som den slutliga andelen av en viral variant normaliseras genom dess ursprungliga andel i ympen eller som nettoskillnaden tillväxttakten mellan de två konkurrerande virus. Vi fann att den senare metoden, med hjälp av longitudinella datapunkter endast inom den exponentiella tillväxtfasen, producerade de mest robusta resultat 9,20.

In vitro-fitness analyser används främst för att studera biologiska kloner 6-8 och infektiösa molekylära kloner av HIV-1. Den senare, som är mottaglig för genetisk manipulation, används ofta för att studera effekten på fitness från specifika mutationer eller specifika sekvenser av intresse 3-5,21,22. Följande protokoll beskriver ett arbetsflöde från punkten för att konstruera nya fullängds infektiösa HIV-1 molekylära kloner med hjälp av HIV-1-vektorer innehållande en sekvens tagg, introducera mutationer av intresse, vilket gör virala stockar och upprättande virala tillväxtkinetik, Att utföra tillväxtkonkurrensanalys och beräkning av relativ fitness (Figur 1).

Använda våra optimerade procedurer, skapade vi tre rekombinanta HIV-1-mutanter och bestäms deras replikering fitness. Den rekombinanta molekylär klon konstruerades först genom att ersätta HIV-1-gag-p24-genen regionen av pNL4-3, en plasmid innehållande en fullängds infektiöst genomet av HIV-1 labb stam NL4-3, med ett syntetiskt COTB (Center-of- Träd, subtyp B) gag-p24-sekvensen 23 för att skapa prototypstammen. Enskilda aminosyror förändringar (T186M, T242N och I256V) infördes sedan för att skapa tre muterade kloner. Varje mutant tävlade mot prototypen viruset att observera fitness effekterna av varje mutation i den givna genetisk bakgrund. De tre mutanterna demonstrerade varierande nivåer av replikations fsitness från lätt till betydligt lägre än prototypvirus. Den T242N mutation tidigare rapporterats ha en måttlig fitnessanläggningss kosta 24-26, i likhet med det resultat som visas i denna studie. Den lämplighets kostnaden för de andra två mutationer hade inte tidigare rapporterats.

Protocol

OBS: Protokollet, som beskrivs nedan, inte innehåller någon patient identifierbar information och därför inte anses mänskliga ämnen forskning vid University of Washington Institutional Review Board eller mänskliga ämnen Division.

1. Konstruktion av chimär HIV-1 NL4-3 molekylära kloner

1,1) Amplify Infoga DNA-fragment

  1. Plan chimära primrar. Den 5 'halvorna av både framåt och bakåt primrar innehåller en HIV-1 vektorsekvens, vid vilken fragmentet kommer att infogas. Den 3 'hälften av primrarna måste innehålla änden av insättningen sekvensen (Figur 2). Se till att den chimära primersekvensen behåller de ursprungliga öppna läsramar.
    1. Använd primrar åtminstone 20 baser i längd, med en smälttemperatur som är större än eller lika med 60 ° C, ~ 50% GC-innehåll, och en låg tendens att bilda primer-dimerer, heterodimerer och / eller hårnålsstrukturer. Bedöm dessa egenskapermed hjälp av OligoAnalyzer webbverktyget ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
  2. Använd PCR 27 och de chimära primrarna för att amplifiera insatt DNA (figur 2). För varje PCR-reaktion, använd 1X high fidelity buffert, 0,2 mM dNTP, 1 U high fidelity DNA-polymeras, 0,5 iM framåt chimär primer, 0,5 iM av omvänd chimär primer och 1 pg0 ng DNA-prov som bär insatsområdet. Lägg dH 2 O till en slutlig volym av 50 | il.
  3. Ställ termocykelsteg enligt följande: Utför ett initialt DNA-denatureringssteg vid 98 ° C under 10 sek. Amplify med 30 cykler av DNA-denaturering vid 98 ° C under 10 sek och DNA-hybridisering vid 3 ° C över den lägsta smälttemperaturen för de två primrar för 20 sek. Utför en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 minuter. Store PCR-produkter vid 4 ° C.
  4. Ta 5 pl av PCR-produkterna frånföregående steg och köra agarosgelelektrofores 28.
    1. Använd en 0,7% agarosgel, 1 x TAE-buffert (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA), 0,5 ^ g / ml etidiumbromid (EtBr) slutlig koncentration och 1 kb-stege som DNA storleksmarkör. Ställ in matningsspänningen till 5 V / cm avstånd mellan elektroderna. Stoppa elektrofores när lastningen färgämnet migrerar genom cirka 2/3 av gelén längd. Visualisera gelén med användning av en gel dokumentationssystem 28.
      OBS: EtBr är en misstänkt cancerframkallande och måste kasseras, per institution regler. Handskar ska alltid användas vid hantering av geler innehållande EtBr. Byt till nya handskar efter målgång hantering EtBr innehållande material och innan du hanterar andra material eller utrustning för att förhindra korskontaminering.
  5. Om endast ett DNA-band med storlek motsvarande den önskade PCR-produkten detekteras, rena resten av PCR-produkten med användning av ett kommersiellt kit såsom QIAquick PCR Purification Kit according tillverkarens protokoll.
    1. Om andra, icke-specifika band är också närvarande, använda resten av PCR-produkten för att köra preparativ gelelektrofores. Använd samma parametrar och villkor som anges i steg 1.1.4. Se till att gelén väl är tillräckligt stor för att ladda ~ 45 | il av PCR-produkter. Klipp ut bandet av intresse och extrahera DNA från gelén med användning av QIAquick gelextraheringskit enligt tillverkarens protokoll.

1.2) införa den Fragment i full längd Infectious HIV-1 Undertyp B Vector (pNL4-3)

  1. Använd renade PCR-produkter från steg 1.1.5 som PCR-primers. Använd pNL4-3VifA 20 som templat-DNA i en PCR-reaktion och använd pNL4-3VifB 20 som templat i den andra reaktionen (fig 2). För varje PCR-reaktion, använd 1x high fidelity buffert, 0,2 mM dNTP, 2 U high fidelity DNA-polymeras, 500 ng primer DNA och 50 ng mall-DNA i en slutlig volymUME av 50 ul. Ställ de termiska cyklingsparametrar till: 98 ° C under 30 sek, 35 cykler vid 98 ° C under 10 sek, 48 ° C under 1 min och 72 ° C under 10 min, följt av 72 ° C under 10 minuter.
  2. Lägg 10 U av Dpn I till 50 | il av PCR-reaktionen och inkubera vid 37 ° C under 1 h för att smälta DNA-mallen. Kontrollera att plasmid-DNA isoleras från en metylering behörig bakteriestam, t.ex.., Top10 kemiskt kompetent Escherichia coli.
  3. Använd Dpnl diger produkt att transformera kompetenta bakterieceller. Använd värmechock transformation med Top10 kemiskt kompetenta E. coli, enligt tillverkarens protokoll. För att selektera för bakteriella celler som innehåller den rekombinanta plasmiden, använd Luria-buljong (LB) odlingsplattor innehållande 100 mg / l karbenicillin.
    1. Pick ~ 10 väl separerade kolonier och odla var och en separat i 3 ml LB-vätskemedium innehållande 100 mg / l karbenicillin och inkubera vid 30 ° C i enshaker O / N.
    2. Använda QIAprep Spin Miniprep-kit för att isolera plasmid-DNA från bakterievätskekultur, enligt tillverkarens protokoll.
  4. Använd dubbel restriktionsdigerering 29 för att bestämma huruvida den plasmid-DNA innehåller den korrekta insatsen. Säkerställa att en av de restriktionsställen existerar endast i insatsen regionen och den andra restriktionsstället existerar endast en gång i den HIV-1 vektor, utsidan av insatsområdet.
    1. Digest minst 300 ng plasmid-DNA i en 10 | al slutlig reaktionsvolym. Välj restriktionsbuffertar, inkubationstemperatur och inkubationstid enligt tillverkarens protokoll för de valda restriktionsenzymer. Ta 9 pl av det digererade DNA: t och kör gelelektrofores såsom beskrivs i steg 1.1.4. Välj rekombinanta plasmider som har DNA-band av de förutspådda storlekar.
  5. Bekräfta sekvensintegritet av de rekombinanta plasmiderna av Sånger-sekvensering. Även sällsynta, oönskademutation (er) kan införas under de PCR-reaktioner.
    1. Sekvens båda strängarna av plasmid-DNA. Följ instruktionerna i steg 1.1.1.1 att utforma sekvenseringsprimrar. Dessutom, se till att den framåtriktade och omvända sekvenseringsprimrar aducering minst 50 bp uppströms och nedströms av insatsen-regionen i den rekombinanta plasmiden, respektive.
    2. Submit plasmid-DNA och sekvenseringsprimrar till en kommersiell DNA-sekvense tjänsteleverantör. Förbered DNA-provet och primers som anges av tjänsteleverantören.
  6. Gör ett endotoxinfritt lager av den muterade plasmid-DNA med användning av ett endotoxin fritt plasmid-DNA-kit enligt tillverkarens protokoll. Bered minst en ^ g endotoxinfritt plasmid-DNA för transfektion i följande steg.

1,3) Införa Småskalig Mutationer Via Ställesriktad mutagenes

  1. Designa mutagena primers med överlappande framåt och bakåt primers innehållande den önskade Mutatjon (er). Placera basen (s) som ska ersättas, införas eller tas bort i mitten av primers, flankerad av 10-15 homologa baser. Följ instruktionerna i steg 1.1.1.1.
  2. Använd PCR för att syntetisera mutanta plasmider. För varje PCR-reaktion, använd 1x high fidelity-buffert, 10 mM dNTP, 2 U high fidelity DNA-polymeras, 0,5 iM framåt mutagen primer, 0,5 iM av omvänd mutagen primer och 50 ng av chimär pNL4-3VifB, från steg 1.2.6 , i en slutlig volym av 50 | il. Ställ de termiska cyklingsparametrar till: 98 ° C under 30 sek, 25 cykler vid 98 ° C under 10 sek, 48 ° C under 1 min och 72 ° C under 10 min, följt av 72 ° C under 10 minuter.
  3. Upprepa steg 1.2.2 till 1.2.6.

2. Generation av Viral Stock Använda transfektion

  1. Beräkna mängden viralt önskade lager och plasmid-DNA som krävs. Med en viral titer av 10 4 IU / ml eller högre, 1,8 ml viral lager räcker för två uppsättningar av tillväxtkonkurrens assays, inklusive monoinfections, vardera utförts tre gånger. För en transfektion sker i en 6-brunnsplatta, är ca 1,8 ml supematant skörd per brunn. Det behövs ett ^ g plasmid-DNA för varje transfektion sker i en 6-brunnsplatta.
  2. För varje brunn i en 6-brunnsplatta, förbereda 100 pl av transfektion blandningen, t ex., Som består av en il X-tremeGENE 9 transfektionsreagens (eller jämförbar produkt), ett ^ g av plasmid-DNA och serumfritt DMEM.
    1. Bestämma volymen av plasmid-DNA som krävs, med användning av ett ^ g plasmid-DNA per brunn. Säkerställa att den slutliga koncentrationen av plasmid-DNA: t är åtminstone 50 ng / ul.
    2. Bestäm hur mycket serumfritt medium (DMEM) behövs per brunn med användning av formeln: Total volym av DMEM i il = 100 ^ - DNA volym i il.
  3. Lägg 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) celler / brunn i 2 ml förökningsmedium (DMEM + 10% fetalt bovint serum (FBS)) i en 6-brunnsplatta. Inkubera i en timme vid 37 ° C i en5% CO 2 atmosfär. Seed så många brunnar som behövs (bestäms i steg 2,1).
  4. För att förbereda transfektion blandningen, Alikvotera lämplig volym av serumfritt DMEM, som beräknats ovan, i en 1,8 ml polypropylen mikrocentrifugrör, och sedan lägga till transfektionsreagens.
    1. Pipett reagens direkt i lösningen media, inte lägga till plastytan i mikrocentrifugrör. Lägg till plasmid-DNA sist. Pipet upp och ner försiktigt för att blanda lösningen. Inkubera i 15 min vid RT (15 ° C till 25 ° C) för att tillåta bildandet av transfektion komplex.
    2. Lägg blandningen i en droppvis sätt till celler sådda i 6-brunnsplatta. Försiktigt skaka eller snurra brunnarna för att säkerställa en jämn fördelning av transfektion komplex.
    3. Seal plattor med plastfolie.
  5. Inkubera kulturer vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär under 48 h.
  6. Använd en pipett för att noggrant samla in och överföra supernatanten till ett 15 ml rör through en 0,22 ^ m filtertopp.
  7. Använd pipetten för att överföra 250 pl eller mer av den filtrerade supernatanten till 1,8 ml mikrofugrör med gummipackningar i locken.
  8. Butiks filtrerades supernatanterna vid -80 ° C fram till användning.

3. Bestäm Infektiös titer av Viral Lager på perifera mononukleära blodceller (PBMC)

  1. Stimulera PBMC med fytohemagglutinin (PHA). Per en viralt lager, utsäde 2 x 10 6 PBMC i fullständigt Iscoves modifierade Dulbeccos medium (cIMDM; IMDM kompletterat med 20 U / ml av humant interleukin 2 (hIL-2), 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) kompletterat med PHA (1,5 pg / ml). Seed PBMC vid 2 x 10 6 celler / ml. Inkubera PBMC vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär under 72 h.
  2. Harvest PHA-stimulerade PBMC. Överför icke-vidhäftande PHA-PBMC till en 50 ml koniska rör. Spin röret vid 228 xg under 10 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten utan disrupting cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten till en slutlig koncentration av 2 x 10 5 PBMCs / ml i cIMDM.
  3. Seed 2 x 10 4 PHA-stimulerade PBMC / brunn i 100 | il / brunn cIMDM i en rundbottnad 96-brunnsplatta.
  4. Gör en 1:10 spädning av det virala lager. Därefter, från det första utspädda lager, göra tolv 3-faldiga serieutspädningar i en 96-brunnars huvudplatta. Denna spädningsschema rekommenderas för att detektera virala titrar i området av 10 april - 10 juni infektiös enhet (lU) per ml.
    1. Till exempel, tillsätt 20 pl virus lager till 180 pl medier i 1,5 ml rör. Blanda utspädningen genom att pipettera noggrant. Sedan överföra 90 pl av den utspädda lager i 180 pl media den första brunnen och blanda väl genom att pipettera.
    2. Fortsätt utspädningsserie genom att överföra 90 fil från nuvarande brunn till 180 pl medier i nästa brunn elva gånger. Öka eller minska den initiala utspädning om halter högre än 10 6 IU / mleller lägre än 10 4 IU / ml förväntas, respektive.
  5. Lägg 40 pl av serieutspädd virusstam från masterutspädningsplattan till den ympade PBMC plattan (från steg 3,3) i fyra exemplar. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär under 16-24 timmar.
  6. Ta försiktigt bort 100 | il av supernatanten från varje brunn, och ersätt med 160 pl av färsk cIMDM till en total volym av 200 | il / brunn. Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 atmosfär (dag 1).
  7. På dagarna 4, 7, 10 och 13 överföra 100 pl supernatant från varje brunn till 100 ^ störningar buffert (2% TritonX-100 i PBS), och ersätta med 100 pl av färskt cIMDM. Förvara supernatanterna vid -20 ° C.
    1. Håll provtagning och lägga till nytt cIMDM var tredje dag tills titer stabiliseras.
  8. Bestäm vävnadskultur infektiös dos 50% (TCID50) av det virala lager med p24-ELISA med användning av dag 7 och en3 prover som beskrivs i steg 4.
    1. Om TCID50 erhållits från dag 13 är klart högre än titer från dag 7, kan viruset lager behöver längre tid för att expandera. Upprepa p24 ELISA med användning senare prover tills smitt titer från två provtagnings tidpunkter blir stabil (eller minskning). Välj bestånd från prover med de högsta titrarna.

4. ELISA (enzymkopplad Immunoabsorbant Assay) Detektion av HIV-1 p24 för bestämning Viral Infektiös titer

OBSERVERA: Följande protokoll utvecklades med användning av p24-antigeninfångningsplattor framställda i vårt laboratorium 30. Kommersiell HIV-1 p24 ELISA-plattan / kit kan också användas, enligt tillverkarens protokoll.

  1. Innan arbeta med prover, förbereda arbets lagren av primär antikropp (kanin-anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum).
    1. Tö p24-antiserum vid RT.
    2. Blanda 2,5 ml glycerol med 2 ml av 10% FBS i Phosphate buffert koksaltlösning (PBS).
    3. Lägg 0,5 ml antiserum och blanda.
    4. Butiks 1 ml alikvoter vid -20 ° C.
  2. Tina prover från steg 3,7 i en 37 ° C inkubator.
  3. Tvätta p24 infångningsplattan 5 gånger med tvättbuffert (1 x PBS med 0,05% Tween-20).
  4. Lägg 50 | il / brunn av prov utspädningsmedel (1% bovint serumalbumin (BSA), 0,2% Tween-20 i RPMI-1640), tillsätt sedan 50 ^ il prov till lämpliga brunnar. Inkludera minst tre brunnar med provspädningsmedel endast som mock / negativa kontroller. Inkubera i 2 h vid 37 ° C eller O / N vid 4 ° C.
  5. Förbered primära antikroppen lösningen färsk före användning. Gör en 1: 2000-faldig utspädning av den primära antikroppen som arbetar lager användning av den primära antikroppen utspädningsmedel (12% FBS i RPMI-1640). Se till att förbereda tillräckligt för användning av 100 | il lösning per varje prov / kontroll brunn i en 96-brunnsplatta.
    1. Till exempel, för att göra tillräckligt med lösning för en 96-brunnar, tillsätt 5 | il av den primära antikroppen working lager till den primära antikroppen spädningsmedel för en slutlig volym av 10 ml.
  6. Tvätta infångningsplatta 5 gånger med tvättbuffert.
  7. Lägg 100 pl av primär antikroppslösning till varje brunn. Inkubera i en timme vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär.
  8. Förbered sekundär antikropp lösningen färsk före användning. Gör en 1: 14.400-faldig spädning av den sekundära antikroppen (1 mg / ml get-anti-kanin-HRP) med användning av sekundär antikropp utspädningsmedlet (7% FBS, 0,01% Tween-20 i RPMI-1640). För att minska pipetteringsfel, utföra en två-stegs seriespädning. Se till att förbereda tillräckligt för användning av 100 | il lösning per varje prov / kontroll brunn i en 96-brunnsplatta.
    1. Till exempel, för att göra tillräckligt med lösning för en 96-brunnsplatta, först lägga en il av den sekundära antikroppen till 99 | il av den sekundära antikroppen utspädningsmedel. Tillsätt sedan 70 | il av första spädning till den sekundära antikroppen spädningsmedel för en slutlig volym av 10 ml.
  9. Tvätta fånga plattan 5 times med tvättbuffert.
  10. Lägg 100 pl av den sekundära antikroppslösning till varje brunn. Inkubera i en timme vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär.
  11. Tvätta plattan 5 gånger med tvättbuffert.
  12. Lägg 100 ul av RT-TMB-substrat. Inkubera 30 minuter vid RT i en sluten behållare för att skydda mot ljus.
  13. Lägg 100 ul av RT-stopplösning (1 NH 2 SO 4).
  14. Läs absorbansen vid 450-650 nm i varje brunn med hjälp av en mikroplattläsare. Använd absorptionsvärdet att göra mål varje brunn som infekterade eller oinfekterade. Betrakta en brunn för att innehålla infektiöst virus om absorbansvärdet är åtminstone tre gånger högre än det värde som avlästs från sken / negativa kontrollbrunnar. Beräkna TCID50 av det virala lager med användning av Reed-Meunch metod 31.

5. Upprätta Viral tillväxtkinetik

5,1) Monoinfection

  1. Seed 3 x 10 5 PHA-stimulerade PBMC / brunn i 48-brunnars i en total volym av 500 | il / brunn. Hålla odlingsplattor vid 37 ° C i en 5% CO2-atmosfär tills inokulering.
  2. För varje virus, förbereda ett inokulum innehållande 6.000 IE i 2 ml cIMDM.
  3. Inokulera brunnar i tre exemplar genom att tillsätta 500 pl av ympen (1500 IE) till de sådda cellerna. Den slutliga volymen av den infekterade cellkulturen är en ml / brunn och MOI är 0,005.
  4. Alikvot 200 pl av den återstående inokulat till vardera av två 96-brunnsplattor för RNA-isolering, av vilka en är sparas som en backup.
  5. Inkubera kulturer vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär under 16-24 timmar.
  6. Tvätta kulturer 16-24 h efter ympning.
    1. Ta bort och kassera 750 pl kultursupernatant.
    2. Lägg 750 pl färsk cIMDM. Linda plattorna i plastfolie och snurra i 10 minuter vid 300 x g. Ta bort och kassera 750 pl supernatant.
    3. Lägg 750 pl färsk cIMDM. Inkubera vid 37 ° C med en 5% CO2 vidmosphere (dag 1).
  7. Exempel kulturer dagligen från dag 2 till dag 7.
    1. Överför 500 pl kultursupernatant till en 1,8 ml centrifugrör. Spin i 1 min vid 3000 x g.
    2. Överföring 200 pl av den cellfria supernatanten till de två provplattor 96 brunnar för RNA-isolering, återigen sparar en platta som backup. Förvara supernatanter vid -80 ° C tills RNA-isolering.
    3. Tillsätt 500 pl färsk cIMDM till varje kultur. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär.
    4. Kassera kulturer in Wescodyne vid slutet av experimentet.
    5. Isolera RNA från 200 ^ il av supernatant (använd kommersiella kit såsom QIAamp Viral RNA-Mini Kit) efter tillverkarens standardprotokoll. För ett stort antal prover, använd Qiagen QIAxtractor.
    6. Butiks RNA-prover vid -80 ° C tills cDNA-syntes.

5.2) cDNA Synthesis (omvänd transkription)

  1. För varje RNA-sriklig, tillsätt 1,2 nmol dNTP och 1,2 pmol av cDNA-syntes-primer, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nukleotid 7968-7995) till 10 fil av viralt RNA. Tillsätt vatten till en slutlig volym av 14 | il. Flick röret för att blanda och snurra kort för att samla vätska i botten av röret.
  2. Inkubera blandningen i 5 minuter vid 65 ° C, håll sedan vid 4 ° C tills Master Mix bereds.
  3. Förbered huvudblandning med användning av 5x första strängen-buffert (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 5 mM DTT, 120 U av SuperScriptIII och 240 U av RNas-inhibitor. Tillsätt vatten till slutlig volym av 10 | il.
  4. Tillsätt 10 pl av Master Mix till RNA blandning, bläddra för att blanda och snurra för att samla.
  5. Inkubera blandningen i 90 minuter vid 50 ° C för att möjliggöra syntes av cDNA. Inkubera i 15 minuter vid 70 ° C för att inaktivera omvänt transkriptas. Håll vid 4 ° C efter behov.
  6. Tillsätt 2 U RNas H, flick att blanda, och sedan snurra att samla in.
  7. Inkubera 20 minutervid 37 ° C. Butiks cDNA vid -20 ° C.

5.3) cDNA Kvantifiering Använda qPCR System

  1. Bered en standardspädningsserier. Gör 10-faldig serieutspädning, från 3 x 10 6 kopior / il ner till 30 kopior / ul, i pNL4-3VifA. Använd destillerat vatten för spädningar. Förbered standardspädningsserier färsk före användning eller förbereda små partier och hålla vid -20 ° C. Får ej frysas-tina normerna mer än tre gånger.
  2. Inrätta en 96-håls qPCR reaktionsplatta. Säkerställ att varje platta innehåller åtminstone en brunn på negativa kontroller, en triplikat av standardspädningsserier, och åtminstone en kopia av varje cDNA-prov.
  3. För varje qPCR reaktion, använda 12,5 pl qPCR Master Mix, 0,2 iM sond, 0,8 pm varje framåt- och bakåt primers och 1 pl av cDNA eller standardspädningsserier eller vatten / buffert (för den negativa kontrollbrunnen). Tillsätt vatten till en slutlig volym av 25 | il. Den qPCR sonden är ljus senkänslig. Håll det i sluten behållare.
    1. För att detektera cDNA härlett från pNL4-3VifA baserad molekylär klon, använd Vifa primer-prob: VifAB framåtriktad primer (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa omvänd primer (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') och VifAB sond (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). För cDNA härlett från pNL4-3VifB baserad klon, använd VifB primer-prob: VifAB framåtriktad primer, VifAB sond och VifB omvänd primer (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 ').
  4. Ställ PCR cyklingsparametrar till 50 ° C under 2 minuter, 95 ° C under 10 minuter, och 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 1 minut. Rådfråga tillverkarens supportdokument för drift av qPCR maskin.
  5. Beräkna en standardkurva med hjälp av data från tre exemplar standardspädningsserier. Jämföra förstärkningsdata för cDNA-provet med standardkurvan för att bestämma kopietalet. Rådfråga tillverkarens supportdokument för daTA bearbetning.

5.4) Bestäm Viral exponentiell tillväxtfas

  1. Plot virala tillväxt kinetik med provtagnings dag längs X-axeln och cDNA kopietal utmed Y-axeln och identifiera virala exponentiella tillväxtfasen, dvs., När virala cDNA kopiera nummer ökning en exponentiell progression.
  2. Använd GRC webbverktyget ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) för att beräkna virustillväxttakt (g). I denna tillämpning accepterar GRC verktyget cDNA kopiera nummer från åtminstone två tidpunkter som indata, och matar ut den virala tillväxthastigheten (g). Använd endast tidspunktsdata inom den exponentiella tillväxtfasen (se steg 5.4.1 ovan) för att få korrekta tillväxttakt. För en detaljerad beskrivning av den matematiska modell som används i GRC webbverktyget, se 20.

6. Tillväxt konkurrensanalys

  1. Seed 3 x 10 5 </ Sup> PHA-stimulerade PBMC: er (eller 1 x 10 5 CEMx174 celler) i 500 | il total volym per brunn i en 48 brunnars flatbottnad platta.
  2. Förvara plattan i 37 ° C i en 5% CO2-atmosfär tills inokulering.
  3. För varje virus, förbereda 3 ml inokulum innehållande 6.000 IE.
  4. Överför 1,5 ml av varje virus inokulum till ett sterilt rör för att skapa dubbelinfektion ympen. Lägg 500 pl av den dubbla inokulum (1500 lU) till 3 x 10 5 celler i en 48-brunnars platta. Den slutliga odlingsvolymen är en ml / brunn. Alikvot 200 pl av inokulatet till två 96-brunnars plattor för RNA-isolering; spara en platta som en back up.
  5. Inkubera ympade celler vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär under 16-24 timmar.
  6. Tvätta kulturer 16-24 h efter ympning.
    1. Ta bort och kassera 750 pl kultursupernatant.
    2. Lägg 750 pl färsk cIMDM. Linda plattorna i plastfolie och snurra i 10 minuter vid 300 x g. Ta bort och kassera 75081, l supematant.
    3. Lägg 750 pl färsk cIMDM. Inkubera vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär (dag 1).
  7. Välj provtagningstider för att inkludera åtminstone 3 tidpunkter inom den exponentiella tillväxtfasen observerades i steg 5.4.1.
    1. För varje provtagning, följ steg 5.1.7.
  8. Utför cDNA-syntes som beskrivs i avsnitt 5.2.
  9. Bestäm virusvariant graden med qPCR.
    1. Förbered en standard seriespädningsserie i tre exemplar, späda 10 gånger i varje steg från 3 x 10 6 kopior / mikroliter till 30 kopior / il pNL4-3VifA.
    2. Inrätta en 96-håls qPCR reaktionsplatta. Säkerställ att varje platta innehåller minst en negativ kontroll, standardspädningsserier i triplikat, och kopior av varje cDNA-prov.
    3. För varje qPCR reaktion, använda 12,5 pl qPCR Master Mix, 0,2 iM sond, 0,8 iM vardera av framåt och bakåt primers och 1 pl av cDNA eller standard d ilution serie eller vatten / buffert (för de negativa kontrollbrunnar). Tillsätt vatten till en slutlig volym av 25 | il. Den qPCR sonden är ljuskänslig, hålla den i sluten behållare.
      1. Använd Vifa primer-prob för att detektera signaler i de negativa kontrollerna och standardspädningsserier och med en kopia av cDNA provet. Använd VifB primer-prob med den andra kopia av cDNA-provet.
    4. Ställ PCR cyklingsparametrar till 50 ° C under 2 minuter, därefter 95 ° C under 10 minuter, och därefter 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 1 minut. Rådfråga tillverkarens supportdokument för drift av qPCR maskin.
    5. Beräkna standardkurvan med förstärkningsdata från standardspädningsserier. Jämföra förstärkningsdata för cDNA-proverna med standardkurvan för att bestämma kopietalet. Rådfråga tillverkarens supportdokument för databehandling.
    6. Använd GRC webbverktyget (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) för att beräkna relativ viral fitness (d).
      OBS: GRC verktyget accepterar cDNA kopiera nummer eller kromatogram topphöjder från minst två tidpunkter som ingången, och matar ut netto tillväxt skillnaden (d) mellan de två virusen. Medan verktyget kan beräkna netto tillväxt från två tidspunktdata, är det starkt rekommenderat att indata från tre eller flera tidpunkter. Använd endast data från tidpunkter inom den exponentiella tillväxtfasen (se steg 5.4) för att erhålla korrekta tillväxttakt. För en detaljerad beskrivning av den matematiska modell som används i GRC webbverktyget, se 20.
  10. Bestäm virus förhållanden med hjälp av kromatogram topphöjder
    1. PCR-amplifiera HIV-1 VIF fragment innehållande VifAB sekvenstagg med användning VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 positionerna 5266-5291) och VifRev primrar (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 positionerna 5579-5553).
      1. För varje PCR-reaktionen används en pl av cDNA, 1 x NH 4-buffert, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq-polymeras, och 0,45 | aM av varje primer. Tillsätt vatten till en slutlig volym av 50 | il.
      2. Ställ PCR cyklingsparametrar till tre cykler vid 94 ° C under 1 min, 55 ° C under 1 min och 70 ° C under 1 min, följt av 34 cykler vid 94 ° C under 15 sek, 58 ° C under 30 sek, och 70 ° C under 1 min och sedan hålla vid 4 ° C.
    2. Rena PCR-produkter med användning av QIAquick PCR-reningskit enligt tillverkarens protokoll.
    3. Skicka renade PCR-produkter till en DNA-sekvense tjänsteleverantör för Sanger-sekvensering.
    4. Kontrollera genomsnittliga läs kvalitetsresultat, vilket bör åstadkommas genom sekvense tjänsten. Om den genomsnittliga basen samtals noggrannhet är mindre än 85%, gör om steg 6.10.1 till 6.10.3
    5. Använd ChromatQuan webbverktyget (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) att beräkna viral förhållande vid varje tidpunkt. Verktyget kräver sekvensspårningsfilen (* .ab1) och sekvensen 5 'om nukleotid stället av intresse. Verktyget mäter toppintensiteten vid den angivna platsen. Förhållandet mellan toppintensiteten motsvarar den ranson av de två virusen (Figur 4B).
    6. Använd GRC webbverktyget ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) och de inspelade toppintensiteter som ingång för att beräkna viral relativ fitness (d). Se steg 6.10.6. 20

Representative Results

För att studera lämplighet inverkan av enstaka aminosyraförändringar i HIV-1 Gag-p24, använde vi oligonukleotid riktad mutagenes för att introducera mutationer in i en pNL4-3 plasmid innehållande HIV-1 COTB-p24-genen 23,32,33. Virus aktier genererades genom transfektion av 293T-celler och skördades efter 48 timmar. Vi uppskattade vävnadskultur smittsam dos 50% (TCID50) av varje virus lager av Reed-Muench-metoden 31. Den TCID50 av prototypen och muterade virus varierade från 10 april-10 Maj IE / ml (Figur 3A).

Tillväxt kinetik de rekombinanta virusen var etablerade i PBMC från en enda donator vid en MOI av 0,005. RT-qPCR användes för att mäta virus cDNA kopietal dagligen under sex dagar. Alla muterade och prototypvirus växte exponentiellt mellan dag 2 och dag 4, varefter virus avtog, vilket indikeras av en minskad lutning av det virala RNA antal kopior ökning (<strong> figur 3B). Minskningen av cDNA kopiera tal mellan dag 0 (motsvarande ympen) och dag 2 beror på absorptionen av virus till celler och avlägsnande av obundna virioner av dag 1 tvätt (steg 5.1.6). I den exponentiella tillväxtfasen, samtliga tre mutanter hade en långsammare tillväxthastighet (g) än prototypvirus (figur 3C).

Alla tre mutanterna tävlade mot prototypen viruset i tillväxtkonkurrensanalyser vid en total MOI av 0,005. Virala tillväxt kinetik i för sig infekterade kulturer var liknande den i monoinfection; den virala exponentiella tillväxtfasen var mellan dag 2 och 4, och virustillväxt nådde en platå runt dag 5 (figur 4A).

Viral tillväxt differenser härleddes från förändringen i den virala förhållande över tiden. Den virala förhållandet beräknades baserat på cDNA-kopia antal referens och muterade virus med hjälp RT-qPCR och genom att jämföra topphöjderi följd Kromatogram vid nukleotid sajter skiljer de två virus (Figur 4B). Tillväxttakten differenser fastställts med hjälp av topphöjden och virala RNA-kopietal metoder gav liknande resultat (Figur 4C). Alla tre mutanter hade lägre replikerings kondition än prototyp virus med mutant I256V har den lägsta fitness (Figur 4C).

Figur 1
Figur 1: Flödesschema av protokollen som presenteras i detta dokument viruspreparatet protokoll rör byggandet av HIV-1 rekombinanta kloner och generering av virala lager.. Fitness Analyser protokoll för att fastställa virus tillväxtkinetik och bestämning av relativ viral fitness. Streckade linjerna representerar alternativa flöden för protokollen. Till exempel kan en mutation införas direkt i HIV-1 NL4-3molekylär klon utan att generera en rekombinant klon.

Figur 2
Figur 2:. Konstruktion av HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 rekombinanta molekylära kloner med användning av överlappande extensions-PCR (A) Plan de chimära primrarna. Den 5 'halvor av primrarna innehåller NL4-3 vektorsekvensen och 3' halvor innehåller ändarna av insatssekvensen. (B) Chimära primrar används för att amplifiera insatsen fragmentet, COTB Gag-p24. (C) Insats fragmenten används som primrar för en andra PCR för att generera en ny rekombinant plasmid.

Figur 3
Figur 3:. Viral tillväxtegenskaper i PBMC (A) Logga 10 TCID50 (B) Viral tillväxt kinetik i monoinfections börjat vid en MOI = 0,005. (C) Virala tillväxthastigheter över sex dagar, inklusive den exponentiella tillväxtfasen (dagarna 2-4) härledda från panel (b). De visade värdena representerar medelvärdet av tre replikat från ett experiment. Felstaplarna utgör 95% konfidensintervall.

Figur 4
Figur 4: Viral tillväxt och relativ fitness bestämningar (A) Viral tillväxt för sig infekterade PBMC kulturer.. (B) Förhållanden mellan T242N och prototyp virus bestämdes med hjälp av RT-qPCR eller sekvense topp-höjd-metoden. (C) Netto virala tillväxtdifferenser (d) mellan mutanten och prototyp virus i för sig infekterade kulturer, såsom visas i (A). d-värden beräknades fROM virala förhållandedata som visas i (B). De visade värdena representerar medelvärdet av tre replikat från ett experiment. Felstaplarna utgör 95% konfidensintervall.

Discussion

De protokoll som presenteras bestod av två huvuddelar: konstruktion av rekombinanta HIV-1 molekylära kloner och tillväxt konkurrensanalyser. För att särskilja två virus i en för sig infekterad cellkultur, är det viktigt att de konkurrerande molekylära kloner innehåller sekvens taggar, som kan detekteras av en RT-qPCR primer-prob-analys eller av Sånger-sekvensering. Detta protokoll använder sig av de Vifa och VifB taggar, som upptar samma region av HIV-1 NL4-3 vif och kodar för samma aminosyrasekvens men skiljer sig åt med sex synonyma mutationer. Dessa mutationer visades inte påverka viral replikation kondition 20. PCR-baserad klonings metod som används i detta protokoll ger större flexibilitet vid val av kloningsställen, jämfört med restriktionsställe baserad kloning. Emellertid effektiviteten av PCR-kloning minskar när storleken ökar insatsen. Den nuvarande gränsen för insatsen storlek är ~ 5 kb 34. För PCR-baserad kloning och ställesriktad mutagenesiar, är användningen av en high-fidelity-DNA-polymeras avgörande för att minska sannolikheten för att extra mutationer. Användning av det minimala antalet PCR-cykler som behövs för att ge tillräckliga mängder av produkter rekommenderas också. I vår erfarenhet, vi inte upptäcka några extra mutationer efter PCR-baserade kloning och riktad mutagenes steg som beskrivs här. Ändå PCR-produkterna skall sekvenseras för att kontrollera om det finns några oönskade mutationer. Helst ska hela HIV-kodande regionen kan resequenced.

Minst tre provtagnings tidpunkter bör undersökas inom den exponentiella tillväxtfasen 9. De virala tillväxtkinetik måste först fastställas med hjälp av daglig provtagning för att fastställa lämpliga odlingsperioden och samplingstidpunkter för tillväxt konkurrens. En faktor som påverkar virala tillväxtkinetik är den mångfald av infektion (MOI). Detta protokoll använder totalt MOI av 0,005 för både monoinfection och tillväxt konkurrens, eftersom det visade sig ge mer robyst resultat än lägre MOI 9. Icke desto mindre kan lägre MOI användas för att erhålla en längre exponentiell tillväxtfas om nödvändigt, men på bekostnad av resultatet konsistens. Detta protokoll föreslår en initial infektion förhållandet 50:50, förutsatt att de fitness skillnader i virus är i allmänhet okända i förväg. Men användningen av ojämlika ingångsförhållanden är lämpliga när det finns preliminära data tyder på betydande skillnader i virusreplikation kinetik. I dessa fall är en infektion av 70:30 rekommenderas att möjliggöra detektion av ett stort gym skillnad där mindre passa viruset placeras i överskott 9.

Protokollet för att bestämma TCID50, virala tillväxtkinetik, och för att utföra tillväxt konkurrensanalyser har optimerats med hjälp av HIV-1 subtyp B, har NL4-3 COTB-p24, och PBMC från en enda donator vars PBMC påvisat konsekvent känslighet för HIV 1-infektion in vitro. Odlingsperiodenoch samplingstidpunkter som presenteras i detta protokoll kommer sannolikt att vara lämpliga för att studera HIV-1 grupp M-virus i humana PBMC. Med hjälp av PBMC från en enda källa är starkt rekommenderat att få konsekventa resultat som virusreplikation kan variera i olika givarceller 35. Även mindre önskvärt, kan PBMC poolade från flera givare kan användas som ett byte under förutsättning att samma pool används i alla experiment. Ett annat alternativ är användningen av cellinjer. Protokollet presenteras här användes framgångsrikt med T-cellinje CEMx174 23,36. Det är emellertid viktigt att antalet celler ympade är re-optimerade för att uppnå konsekvent celltillväxt. Viral tillväxtkinetik måste också återupprättas, eftersom det är sannolikt att variera i olika cellinjer, att fastställa lämpliga samplingstidpunkter i tillväxtkonkurrens steg.

Två olika metoder för att bestämma den virala förhållande för beräkning lämplighet ingår i protocol. Den första använder RT-qPCR att mäta viral cDNA-kopietal vid varje provtagningstidpunkt. Viral replikation kondition beräknades sedan från den virala förhållandet, baserat på cDNA-kopietal. Alternativt kan det virala förhållande bestämmas baserat på förhållandet av kromatogram topphöjd på VifAB tagg webbplatser. De två metoderna gav jämförbara resultat (Figur 4). Kromatogrammet topphöjd metod kan tillämpas på andra HIV-1-stammar utan konstruerad sekvens tag. För RT-qPCR, användning av primers eller sönder för att särskilja virusvarianter måste först utvärderas noggrant (se 20). Ändå ger RT-qPCR bättre känslighet för prover med en liten mängd av viralt RNA, såsom de från den första tidpunkt inom den exponentiella tillväxtfasen. Direkt mätning av viral cDNA kan också upptäcka tekniska problem som kan uppstå från RNA-extraktion och cDNA-syntes. Använda molekylära kloner med sekvens taggar ger en kostnadseffektiv lösning to RT-qPCR metoder, eftersom endast två par primers och prober behövs för att studera flera virus. Denna strategi undviker också problemet med topphöjden variation i sekvens kromatogrammen beror på grannbaser 37, som sekvense sker på samma plats för alla virus i studien. PCR-produktema framställda för RT-qPCR och Sånger-sekvensering kan också vara användning av andra metoder för att bestämma viral förhållande såsom bulksekvensering av individuella kloner 12,13, HTA 4,7,17,19, eller oligonukleotid ligering analys (OLA) 38 .

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. De åsikter som uttrycks här är författarnas och skall inte tolkas som tjänsteman eller företräder synpunkter från amerikanska försvarsdepartementet eller avdelningen av armén.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers IDT Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F-549S
High-fidelity buffer Thermo Scientific F-549S
dNTP Bioline Bio-39026
Thermal cycler Life Technologies Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye Thermo Scientific R0631
1 kb Plus DNA ladder Invitrogen 10787-018
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
DpnI enzyme New England Biolabs R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli Invitrogen C4040-10
Luria Broth base powder Invitrogen 12795-084
Carbenicillin Research Products International C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit  Qiagen 27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 6365787001
HEK 293T-17 ATCC CRL-11268 http://www.atcc.org/
0.22 μm filter top tube VWR International 89220-716 
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) Life Technologies 31980-030
RPMI-1640 media Life Technologies 61870-036
Phytohemagglutinin (PHA) Thermo Scientific R30852801
Human Interleukin-2 Roche 11147528001
Fetal bovine serum JR Scientific 43640
Penicillin and Streptomycin Corning Cellgro 30-001-CI
6 well plate VWR Scientific 73520-906
48 well plate VWR Scientific 62407-338
96 well flat-bottomed plate ISC Bioexpress T-3015-4
96 well round-bottomed plate BD Falcon 353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube Mt. Baker Bio MBD-1500
1.5 ml tubes w/ O-ring VWR Scientific 89004-290
50 ml conical tube ISC Bioexpress C-3317-6
ELISA
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Phosphate buffer saline (PBS) Invitrogen 14190-250
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
glycerol Sigma-Aldrich G5516
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum NIH AIDS Reagent Program 4250
Goat anti-rabbit HRP KPL 474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-01
H2SO4 Fisher Scientific A300-500 Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 min.
HIV p24 standard AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader Molecular Devices VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
dNTP Bioline Bio-39026
SuperscriptIII Invitrogen 18080-085
First-strand buffer  Invitrogen 18080-085
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 18080-085
Rnase inhibitor Roche 3335402001
RnaseH Invitrogen 18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine Life Technologies Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Forward, reverse primer IDT Custom order
Probe Life Technologies Custom order
optical 96 well reaction plate Life Technologies I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase) Bioline Bio-21043
NH4 buffer  Bioline Bio-21043
MgCl2 Bioline Bio-21043
Sequencing primer IDT Custom order
QIAxcel Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider http://www.htseq.org/
GRC web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Domingo, E., Holland, J. J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).
  2. Domingo, E. Mechanisms of viral emergence. Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).
  3. Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo. Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).
  4. Troyer, R. M. Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).
  5. Rolland, M. Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics. PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).
  6. Abraha, A. CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic. J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).
  7. Quinones-Mateu, M. E. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).
  8. Ball, S. C. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes. B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).
  9. Lanxon-Cookson, E. C. Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses. J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).
  10. Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine. J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).
  11. Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation. J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).
  12. Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).
  13. Wang, J. The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency. Virology. 348 (2), 462-474 (2006).
  14. Song, H. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome. Retrovirology. 9 (89), (2012).
  15. Ali, A., Yang, O. A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay. Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).
  16. Maarseveen, N. M. A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants. J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).
  17. Liu, Y. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape. J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).
  18. Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).
  19. Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness. Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).
  20. Liu, Y. A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture. J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).
  21. Brumme, Z. L. Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers. J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).
  22. Nomura, S. Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in. Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).
  23. Rolland, M. HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity. J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).
  24. Martinez-Picado, J. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).
  25. Brockman, M. A. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).
  26. Miura, T. HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).
  27. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction (2014).
  28. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).
  29. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests (2014).
  30. McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density. J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).
  31. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimatingfifty percent endpoints. Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).
  32. Nickle, D. C. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).
  33. Rolland, M. Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).
  34. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  35. Spira, A. I., Ho, D. D. Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro. J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).
  36. Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface. PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).
  37. Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing. Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).
  38. Lalonde, M. S. Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies. J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).

Tags

Immunologi HIV-1 rekombinant mutagenes Viral replikering fitness Tillväxt konkurrens Fitness beräkning
Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E.… More

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E. C., Liu, Y., Swain, J. V., McClure, J., Rao, U., Maust, B., Deng, W., Sunshine, J. E., Kim, M., Rolland, M., Mullins, J. I. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (99), e52610, doi:10.3791/52610 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter