Summary
小梁网（TM）迁移进入施累姆氏管的空间可以由急性压力上升来诱导由ophthalmodynamometer，并通过谱域光学相干断层扫描观察。该方法的目标是要量化活流出道急性压力升高的在生物体组织的原位的形态反应。
Abstract
小梁网（TM）的机械特性都与流出阻力和眼内压（IOP）调节。这种技术背后的基本原理是直接观察以旧换新急性眼压升高的机械反应。在扫描之前，眼压测量在基线和在IOP升高。角膜缘是在基线和在高眼压扫描谱域光学相干断层扫描（ophthalmodynamometer（ODM）施加于30挤压力g）。扫描处理，以提高使用ImageJ房水外流通路的可视化。血管地标被用于识别在基线和高眼压扫描体积相对应的位置。 Schlemm管（SC）的截面积（SC-CSA）和由前向沿其长轴后路SC长度手动在SC的1毫米段内10个位置测量。平均数内到外壁上的距离（短轴长度）计算为SC的由划分区域其长轴长度。为了检查邻近组织的效果的IOP升高的贡献，重复测量不具有和具有平滑肌松弛与托滴注。 TM迁移进入SC由TM刚度抵抗，但由它附着到相邻的平滑肌睫状体内的支持增强。这种技术是在第一测量生理条件下，人眼内的活的人类TM响应于压力上升的原位 。
Introduction
青光眼是全球第二大不可逆转的失明1的原因。升高的眼内压（IOP）是用于青光眼2-7的存在和发展的主要致病危险因素。 眼压是由房水8的形成和流出之间的平衡调节。最大流出阻力的位置是juxtacanicular组织和Schlemm管（SC）的内壁，SC和小梁网（TM）9-11之间的接口。而TM刚度可以在IOP升高的脸向预防SC崩溃，奥弗等人 12最近证明在青光眼基因表达被改变，从而提高SC内皮变硬，妨碍形成气孔，导致高眼压中青光眼13。 TM形态和刚度与相关设施的流出14,15，强调牛逼他需要测量其生物力学特性。
以旧换新的原子力显微镜测量表明高架刚度眼青光眼患者（81千帕）捐赠的眼睛捐助者无青光眼（4.0千帕）16相比，但这些测量是在解剖离体组织进行。后TM被锚定到经由纵肌细胞中插入到外lamellated和cribiform TM 17的前肌腱睫状肌。睫状肌（CM）的活动可能会增加TM绷紧，酷似TM升高17的刚度。观察改建耐诱导的平滑肌扰动SC崩溃的能力已经显示出在动物模型18。我们已经证明了能够非侵入性图像的主房水外流系统在活的人的眼睛的远端并包括SC使用谱域光学相干断层扫描（OCT）<SUP> 19-21。使用这种技术，我们已经证明，量化TM和SC急性IOP升高22的形态反应的能力。
本文所描述的方法的总体目标是量化活流出道急性IOP升高的在生物体组织中原位形态响应。这种技术具有检查在生理条件下对TM，其中既包括收缩纤维活性的T M和CM以TM刚度内贡献相比，在解剖组织制成公布的测量的优点。背后采用这种技术来观察机械TM响应的理由是，它为我们提供了其他原因无法分析上市公司以旧换新，我们现在知道被直接链接到水流出阻力，眼压第13条的力学性能。辨别收缩组织对整体刚度，小的银的贡献受试者室温进行了检查，并没有与抑制平滑肌的活动由托的管理。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
伦理声明：批准从医学匹兹堡大学的大学机构审查委员会获得的对象招募开始之前。参与研究之前提供所有受试者签署知情同意书。
1.数据采集
- 压力上升
- 取基线测量（眼压和OCT测量）灌输一滴0.5％丙美卡因的入眼睛。等待3分钟的疗效。
- 轻轻施加压力的时间巩膜与ophthalmodynamometer，将30g在第1组，和5，然后用10克队列2。然后取所需的（眼压及OCT）测量如下
- 眼压测量
- 测量基线眼压。如第1.1节所述升高的压力。
- 在第1组灌输一滴0.5％丙美卡因的，允许3分钟为疗效，并应用将30克的压力来巩膜。当压力被应用，测量眼压使用眼压计厂家专业如下cturer的说明。
- 在第2组，灌输一滴0.5％丙美卡因的，允许3分钟为疗效，并使用ophthalmodynamometer申请将5g巩膜压力。期间使用眼压计根据制造商的说明压力上升测量眼压。
- 等待5克测定后5分钟。
- 应用将10克巩膜压力ophthalmodynamometer，并使用以下制造商的说明在眼压计中压力上升测量眼压。记录在研究记录中的IOP和条件（ 即基准或10克）。
- 华侨城扫描
- 座位在OCT扫描仪的主题。输入病人的人口统计数据为新的科目，或者从先前扫描的科目华侨城数据库回忆人口统计数据。
- 选择的前部部分512×128的扫描协议。居中眼在视频图像的窗口。降低扫描器之间的距离和眼睛直到角膜断层图像显示在扫描窗口
- 利用口头指令通过引导病人注视在鼻方向定位颞缘到扫描窗口的中心
- 获得基线扫描，并查看质量扫描。如果可以接受，保存，如果不能接受，重复此步骤。
- 接受扫描如果没有闪烁，并且角度被可视化在整个体积而不漂流断图像的边缘或翻转顶部。
- 灌输一滴0.5％丙美卡因的，允许3分钟的疗效，并重复步骤1.3.2至1.3.5。
- 为1组，应用将30克巩膜压力ophthalmodynamometer，并获得扫描的同时施加压力的状态。卸下压力和审查质量的扫描。如果可以接受，保存，如果不能接受，重复此步骤。
- 对于队列2，加5克巩膜压力ophthalmodynamomETER，并且获得在扫描的同时施加压力的状态。卸下压力和审查质量的扫描。如果可以接受，保存，如果不能接受，重复此步骤。
- 等待5分钟，让眼睛从5克压力扰动中恢复过来。
- 为第2组，应用将10克巩膜压力ophthalmodynamometer，并获得扫描的同时施加压力的状态。卸下压力和审查质量的扫描。如果可以接受，保存，如果不能接受，重复此步骤。
- 记录扫描时间，条件在研究记录（ 即，基线或10克）和位置。
- 眼压测量
2.数据处理
- 插头的高容量的USB存储设备插入十月从华侨城记录菜单中选择“ 导出 ”。指定一个文件位置为USB驱动器上的导出文件。取消选择“.ZIP”选项。输入SC患者姓名答要出口，并选择扫描出口。启动出口。
- 当导出完成后，卸载USB驱动器，并从华侨城删除。请将包含导出图像到图像处理工作站的高容量USB驱动器。
- 在这种情况下的ImageJ推出的图像处理程序。
- 导入原始图像数据;选择“ 文件- >导入- >原始 ”从文件菜单中。选择与结尾的“_cube_raw.img”被从USB驱动器处理的文件。
- 保存使用新名称导入的文件，使原来的图象数据被保存不变（http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages）。
- 进入导入参数如下，图片类型：8位，宽度：512，高度：1,024偏移：0;图片数：128。
- 从插件菜单中选择“> StackReg插件- - >研究egistration”。然后选择“ 刚体“选项。然后选择“ 文件- >另存为- > TIFF”保存对齐堆栈。
- 选择“ 过程- >过滤器- > 3D平均 ”从过程菜单。输入参数X = 1，Y = 1和Z = 1作为过滤器选项。重复此步骤两次。
- 选择“ 文件- >另存为- > TIFF”，保存平均堆栈。旋转鼠标滚轮移动到活动的堆栈帧1。
- 选择“ 过程- >增强局部对比度（CLAHE）”，从处理菜单。使用参数块大小：31，直方图箱：256，最大坡度：5，面膜：没有，勾选“快速”选项。使用右箭头键前进到下一帧。
- 移动到活动堆栈帧2和重复流程 - >增强局部对比度（CLAHE）。重复，直到所有的帧有对比增强。
- 选择“ 文件- >另存为- > TIFF”;保存对比增强栈。然后选择“ 图像- >调整- >大小 ”从图像菜单。取消选择“ 约束纵横比 ”选项，然后输入宽：2048，高：1024值。
- 选择“ 图像- >变换- >垂直翻转 ”从图像菜单。然后选择“ 分析- >设置比例 ”，从分析菜单。以像素为单位输入距离：2048，已知的距离：4000，而像素长宽比：1，然后单击确定。选择“ 文件- >另存为- > TIFF”，保存校准1：1宽高比堆栈。
- 慢慢转动鼠标滚轮来直观地检查扫描，以确定一个鲜明的船只穿越作为一个点的扫描范围内引用。记录在分析电子表格中的图像数目和参考帧号。
- 按左方向键15次赴第一次测量框架。选择“写意SelectionsR21;从工具栏。
- 鼠标放置在SC的中心，按向上箭头。重复此步骤，直到SC充满屏幕。
- 手动段SC由盘旋的边界用鼠标。按住控制（Ctrl）键，然后按D当前图像帧。按住Ctrl键，然后按M.转录SC截面积和测量帧数的测量分析电子表格。取消选择的轮廓区域。按右箭头键3次。直到SC已经在10帧为单位重复此步骤。
- 按左方向键30次返回到第一测量框架。
- 从工具栏中选择直线段工具。
- 借鉴SC上最前到最靠后的位置的直线。按住Ctrl键，然后按D仅当前帧。按住Ctrl键，然后按M.抄表SC长度和帧数来分析电子表格。取消选择的轮廓区域。按下右箭头键3次。直到SC长度已在相同的10帧作为对SC截面积被测量重复此步骤。
- 插入公式SC-IOWD = SC-CSA /轴向长度到电子表格分析除以面积测量的长度测量计算平均SC内壁至外壁的距离（SC-IOWD）。
- 按左方向键30次返回到第一测量框架。
- 从工具栏中选择直线段工具。
- 从画一条直线最前的SC到小梁网和前室的边界。确保线垂直于边界。按住Ctrl键，然后按D，然后M.
- 绘制从SC的最靠后的位置和TM的边界和前房的线。确保垂直于边界线。按住控制并按下D，则M.
- 绘制从SC的中心和TM的边界和前房的线。确保林Ë垂直边界。按住Ctrl键，然后按D仅当前帧。
- 录制三个TM厚度测量和帧号到分析电子表格。要做到这一点按右箭头键3次。直到TM厚度已经在相同的10帧作为对SC截面积被测量重复此步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
利用这些数据采集和图像分析技术，对流出道形态学参数眼压小和大的变化，如SC截面积的影响，获得（ 图1）。我们可以看到，水平高的眼压增加产生的SC的可观察到的塌陷，因为由大的减少的截面面积表示。眼睛看来是能够容纳小增加眼压，就证明了缺乏变化的SC-CSA的（ 图1）。这些结果表明，该技术能够定量流出道的锐角眼压挑战的形态反应。技术或技术没有其他家庭既提供有关流出道生物力学的视觉和定量信息。
整个研究过程中，观察到在TM厚度没有显著变化。响应于一个23毫米汞柱眼压升高，SC内到外壁距离减少了5.03微米。 W¯¯ithout和抑制平滑肌的活动，一个6毫米汞柱增加眼压造成SC内外壁的距离由0.18微米和2.34微米的下降分别。此外，基线的SC-CSA从4597±2503微米2下降到3588±1198微米2（平均值±标准差）与平滑肌的活性抑制。一起，与来自睫状肌其中插入到外lamellated和cribiform TM 17前肌腱的插入，这意味着一个控制系统，以保持涉及平滑肌SC通畅。进一步的研究是值得。
图1. Schlemm管区域与在活的眼睛的眼内压。Schlemm管（SC）提供从受试者的两个队列横截面积。在我误差线目前1标准误差ntraocular压（IOP）上的X轴和SC面积上的Y轴。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本技术利用非侵入性的观察软组织的机械响应量化的SC崩溃。利用人类尸体的眼睛今后的工作中，需要解剖后校准组织变形实际组织硬度。但是，这样的研究将遭受先前流出模型的相同的限制;具体地，该活肌到组织张力的贡献将不存在。在哺乳动物活眼模型进一步校准可以让影像和TM的刚度直接测量校准。
有几个限制的技术。它尚待证实在其他平台华侨城。该文献表明，相同的结构可被可视化在其他的OCT设备，然而灵敏度与急性眼压升高在这些设备相关的尚未被证明在人眼的变化。本装置采用了方便，因为没有额外的光学是所需的眼前段扫描。最大的挑战这项工作是扫描识别范围内的SC。这是不可能的一个片内肯定识别SC。体积的询问需要首先找到的含有组织SC的区域。其身份，然后通过观察收集渠道窦口，和互连SC的各个环节中出现一片切片证实。根据我们的经验，SC将呈现为可合并成单一的大开口附近的一个收藏家通道口，或折叠到完全关闭的捏段内缘0〜4开口之间。
这种突破技术的最大意义在于，有没有其他的选择TM刚度原位的评估。以旧换新的形态和刚度与相关设施的流出14,15，强调需要测量的流出途径的生物力学特性。在未来，这样的测量可以提供深入了解当前在青光眼的管理不可用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
舒曼博士收到版权费知识产权由美国麻省理工学院和马萨诸塞州眼耳医院蔡司公司许可
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectral Domain OCT | Zeiss | Cirrus | |
| Imaging Workstation | Apple | iMac | |
| Ophthalmodynamometer | Baillairt Matalene Ophthalmodynamometer, Surgical instruments CO., Inc. New York, NY | ||
| Image Processing Program | rsb.info.nih.gov/ij | ImageJ, FIJI |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide 2010 and 2020. The British journal of ophthalmolog. 90, 262-267 (2006).
- Sommer, A., et al. Relationship between intraocular pressure and primary open angle glaucoma among white and black Americans. The Baltimore Eye Survey. Archives of ophthalmolog. 109, 1090-1095 (1991).
- Sommer, A., et al. Racial differences in the cause-specific prevalence of blindness in east Baltimore. The New England journal of medicin. 325, 1412-1417 (1991).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L., Schachat, A. P. Distribution of intraocular pressure. The Barbados Eye Study. Archives of ophthalmolog. 115, 1051-1057 (1997).
- Leske, M. C., Wu, S. Y., Hennis, A., Honkanen, R., Nemesure, B. Risk factors for incident open-angle glaucoma: the Barbados Eye Studies. Ophthalmolog. 115, 85-93 (2008).
- Mitchell, P., Lee, A. J., Rochtchina, E., Wang, J. J. Open-angle glaucoma and systemic hypertension: the blue mountains eye study. Journal of glaucom. 13, 319-326 (2004).
- Mitchell, P., Smith, W., Attebo, K., Healey, P. R. Prevalence of open-angle glaucoma in Australia. The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmolog. 103, 1661-1669 (1996).
- Gabelt, B., Kaufman, P. Adler's Physiology of the Ey. Kaufman, P. L. , Mosby. 237-289 (2003).
- Grant, W. M. Experimental aqueous perfusion in enucleated human eyes). Archives of ophthalmolog. 69, 783-801 (1963).
- Jocson, V. L., Sears, M. L. Experimental aqueous perfusion in enucleated human eyes. Results after obstruction of Schlemm's canal. Archives of ophthalmolog. 86, 65-71 (1971).
- Maepea, O., Bill, A. Pressures in the juxtacanalicular tissue and Schlemm's canal in monkeys. Experimental eye researc. 54, 879-883 (1992).
- Johnstone, M. A., Grant, W. G. Pressure-dependent changes in structures of the aqueous outflow system of human and monkey eyes. American journal of ophthalmolog. 75, 365-383 (1973).
- Overby, D. R., et al. Altered mechanobiology of Schlemm's canal endothelial cells in glaucoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americ. , (2014).
- Allingham, R. R., de Kater, A. W., Ethier, C. R. Schlemm's canal and primary open angle glaucoma: correlation between Schlemm's canal dimensions and outflow facility. Experimental eye researc. 62, 101-109 (1996).
- Camras, L. J., Stamer, W. D., Epstein, D., Gonzalez, P., Yuan, F. Differential effects of trabecular meshwork stiffness on outflow facility in normal human and porcine eyes. Investigative ophthalmolog., & visual scienc. 53, 5242-5250 (2012).
- Last, J. A., et al. Elastic modulus determination of normal and glaucomatous human trabecular meshwork. Investigative ophthalmolog., & visual. 52, 2147-2152 (2011).
- Lutjen-Drecoll, E. Functional morphology of the trabecular meshwork in primate eyes. Progress in retinal and eye researc. 18, 91-119 (1999).
- Li, G., et al. Pilocarpine-induced dilation of Schlemm's canal and prevention of lumen collapse at elevated intraocular pressures in living mice visualized by OCT. Investigative ophthalmolog., & visual scienc. 55, 3737-3746 (2014).
- Francis, A. W., et al. Morphometric analysis of aqueous humor outflow structures with spectral-domain optical coherence tomography. Investigative ophthalmolog., & visual. 53, 5198-5207 (2012).
- Kagemann, L., et al. 3D visualization of aqueous humor outflow structures in-situ in humans. Experimental eye researc. 93, 308-315 (2011).
- Kagemann, L., et al. Identification and assessment of Schlemm's canal by spectral-domain optical coherence tomography. Investigative ophthalmolog., & visual. 51, 4054-4059 (2010).
- Kagemann, L., et al. IOP Elevation Reduces Schlemm's Canal Cross-sectional Area. Investigative ophthalmolog & visual scienc. , (2014).
