Summary
Her beskriver vi en optimeret og effektiv fjernelse strategi for indsamling af bio-partikler i "røre DNA 'prøver, sammen med en forbedret amplifikationsprotokol involverer en et-trins 5 pi mikro-volumen lyse / STR forstærkning, for at tillade genvinding af kort tandemgentagelse (STR) profiler af bio-partikel donor (s).
Abstract
DNA-profiler kan fås fra 'berøring DNA' beviser, som omfatter mikroskopiske spor af menneskeligt biologisk materiale. Aktuelle metoder til genopretning af spor DNA ansætte vatpinde eller tape til at prøve et interesseområde. Dog vil en sådan »blind-pensling" tilgang co-prøve cellulært materiale fra forskellige individer, selv om den enkeltes celler er placeret i geografisk adskilte steder på emnet. Således er nogle af de DNA-blandinger stødt kontakten DNA-prøver kunstigt skabt af pensling selv. I nogle tilfælde kan et offers DNA findes i betydelige overskud dermed maskering enhver potentiel gerningsmand DNA.
For at omgå udfordringerne med standard nyttiggørelse og analysemetoder, har vi udviklet en lavere pris, "intelligent analyse« metode, som medfører forøget genetisk analyse af trit DNA-beviser. Vi beskriver en optimeret end effektiv mikromanipuleringer recovery strategi for indsamling af bio-partikler i kontakt DNA-prøver, samt en forbedret forstærkning strategi med en et-trin 5 pi microvolume lyse / STR forstærkning for at tillade udvinding af STR-profiler fra bio-partikel donor (s). Brugen af individuelle eller få (dvs. "klumper") biopartikler resulterer i evnen til at opnå en enkelt kilde profiler. Disse procedurer udgør alternative forbedrede teknikker til isolering og analyse af enkelte biopartikler fra retsmedicinsk touch-DNA-beviser. Selv om det ikke er nødvendigt i hvert retsmedicinsk undersøgelse, kan metoden være yderst gavnligt for inddrivelse af en enkelt kilde gerningsmanden dna-profil i sager om fysiske overgreb (fx kvælning), som måske ikke muligt ved hjælp af standard analyseteknikker. Derudover de strategier, der er udviklet her giver mulighed for at få genetisk information på enkelt celle niveau fra en række forskellige other ikke-retsmedicinsk spor biologisk materiale.
Introduction
Touch-DNA er en form for spor biologiske beviser, som er den direkte overførsel af cellemateriale (f.eks kaste hudceller) fra et individ til et objekt eller en anden person under fysisk kontakt 1. Evnen til at få DNA-profiler fra en række rørt objekter (dokumenter, sengetøj, sko, skydevåben, drikke containere, kuglepenne, håndtag dokumentmappe) er blevet rapporteret i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen af touch-DNA-beviser er en vellykket genopretning af spor biologisk materiale til stede. Touch DNA-beviser er typisk indsamlet af pensling den mistænkte område med en steril vatpind (omtalt som "blind-pensling"). Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er arten af det indsamlede biologiske materiale ikke kendt, og prøveudtagning af en generaliseret område udføres. Tilstedeværelsen af overfladevand riller eller sprækker kan hindre en vellykket inddrivelse af de ofte allerede lille mængde bigiske materiale til stede. Derudover en 'blind-pensling tilgang nødvendigvis co-prøve cellulært materiale fra forskellige individer, hvis celler er til stede på det element, selv om den enkeltes celler er placeret i rumligt adskilte steder på emnet. Genopretningen af iblandede dna-profiler, der ofte udfordrende at løse især lav skabelon DNA-prøver, der ofte observeres 8,10,11 og i mange tilfælde vil være en konsekvens artefakt af pensling selve processen. Hvis kun en lille mængde materiale var til stede fra en af donorerne, kan standard udvinding og analyseteknikker undlader at inddrive en profil fra den mindre bidragyder. Derudover type vatpind eller om det blev anvendt tør eller våd (præ-fugtet med sterilt vand) kan påvirke mængden af biologisk materiale, der er indsamlet på grund af forskelle i absorptionsevne og adsorptionsevne og effektiviteten af frigivelse af det biologiske materiale 12. Standard ekstraktionsmetoder kan medføre yderligere tab prøve på grund af behov fysisk manipulation af prøven eller prøve transfer trin.
Som beskrevet ovenfor, kan simple pensling teknikker til genvinding af biologisk materiale resultere i tab af spormængder af biologisk prøve samt en øget forekomst af iblandede profiler på grund af en manglende særskilte individuelle biologiske komponenter. Derfor søgte vi at udvikle mere selektive og effektiv inddrivelse strategier for indsamling af cellulære mikropartikler til stede på rørt objekter. Den udviklede strategi til analyse af biologisk materiale fra kontakten DNA beviser (her benævnt "biopartikler" på grund af det faktum, at en kerne er ikke altid synlige, da størstedelen af de celler, der findes i det ydre epidermale lag af huden er døde eller døende keratinocytter 13) omfatter følgende: 1) indsamling af biologisk materiale (dvs. biopartikler) via gel-film frabout rørt genstande og overflader, slidte tøj eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøgelse af den genvundne biologisk materiale for at sikre indsamling af potentiel menneskeligt biologisk materiale, og 3) mikromanipuleringsmetoder af enkelte eller få bio-partikler ved hjælp af en vandopløselig lim, og 4) autosomal DNA-STR profilering af de indsamlede bio-partikler ved hjælp af en microvolume (5 pi) et-trins lyse / amplifikationsreaktion.
Denne procedure giver adskillige fordele i forhold til traditionelt anvendte analysemetoder. Genvinding af biopartikler hjælp af gel-film tillader en mikroskopisk undersøgelse af det biologiske materiale til stede i prøven forud for analyse. Mens et flertal af de biopartikler udvundet fra touch-DNA-beviser ikke kan være celler med kerne, hvilket gør det vanskeligere at afgøre, hvilke eller hvor mange bio-partikler bør vælges, den mikroskopiske undersøgelse af disse prøver inden analyse giver en chance for at søge efter celler med kerne således maximizing sandsynligheden for dna-profil opsving. Indsamlingen af biopartikler hjælp af vandopløseligt selvklæbende assisteret mikromanipulering tillader direkte overførsel af målrettede biopartikler i reaktionsrør. Denne procedure er visualiseret under mikroskop for at sikre en vellykket overførsel af biologisk materiale. Den reducerede eller microvolume reaktion øger følsomheden og samtidig reducere omkostningerne til analyse pr prøve. Dette tillader analyse af øget antal prøver fra en individuel bevis. På grund af det område i den genetiske tilstand af bio-partikler i kontakt DNA-beviser er flere prøvetagninger fra enkelte poster anbefales.
Her viser vi den vellykkede brug af de udviklede protokoller til at opnå meget overbevisende genetiske profiler af donorer af biologisk materiale i kontakt DNA-beviser. De udviklede bioparticle indsamlings- og DNA-profilering metoder giver en omfattende 'smart' (dvs. specifikke, målelige, attainable, realistiske og rettidige) molekylær tilgang til karakterisering, analyse og fortolkning af spor biologisk materiale. Mens oprindeligt udviklet til anvendelse til retskemisk analyse af trit DNA-beviser, kan de strategier, der er udviklet her blive anvendt på andre kilder til biologisk materiale og giver en mulighed for at få individuelle identifikationsoplysninger på enkelt celle niveau.
Protocol
BEMÆRK: Kropsvæsker blev indsamlet fra frivillige ved hjælp procedurer er godkendt af University of Central Florida Institutional Review Board. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra hver donor.
1. Indsamling af biopartikler fra Rørt Objekter og overflader
- Skær gel-film til den ønskede størrelse. Sikre, at den passende størrelse for objektglas anvendes som den faste bærer. For eksempel, for en 3 "x 1" objektglas, anvende en gel-film størrelse på 2 "x 0,75".
BEMÆRK: længde og bredde af materialet kan reduceres, hvis det ønskes, men bør ikke overstige denne størrelse. - Fjern den hvide opbakning fra gel-film og vedhæfte gel-film til mikroskopobjektglas (figur 1A). Tryk godt ned for at sikre en komplet vedhæftet fil.
BEMÆRK: Der er en klar top beskyttende lag, som ikke bør fjernes for at give tryk, der påføres langs stykke gel-film uden at forurene gel-filmoverflade. Fremstillet gel-film slides (med beskyttende lag fæstnet) kan opbevares ved stuetemperatur indtil brug. - Fjern den gennemsigtige top beskyttende film fra gelen-film med sterile pincetter når de er klar til brug (figur 1B) gel-film prøve. Placer gel-film overflade i direkte kontakt med den ønskede rørt genstand eller overflade (figur 2). Påfør en lille mængde af pres for at sikre effektiv overførsel af bio-partikler til gel-film.
BEMÆRK: Hvis for meget pres anvendes, kunne objektglasset knække.
BEMÆRK: Flere prøvetagninger fra samme formål eller overfladen kan indsamles på samme stykke gel-film. - Bekræft overførsel af bio-partikler på gel-film (figur 3) ved at placere glider på et stereomikroskop (trans- eller epi-illumination kan anvendes). Brug forstørrelse på ~ 20X for bedste visning af større områder af gel-film, og forstørrelse på ~ 200X for bedste viEwing individuelle bio-partikler.
- Opbevar gel-filmprøve objektglas ved stuetemperatur i en overdækket slide kasse eller anvendes straks til farvning og / eller bio-partikel samling.
2. Valgfrit Farvning af biopartikler til støtte i Visualisering
- Placer gel-filmprøve slide fremstillet i trin 1 på en slide-farvning rack over en vask.
- Ved hjælp af en engangs overføringspipette dække hele gel-filmoverflade med trypan blå plet (figur 4A). Inkuber ved stuetemperatur i 1-2 min.
- Fjern overskydende plet ved at vippe slæden for at tillade pletten løbe ud i vasken (figur 4B).
BEMÆRK: Slæden kan skylles ved forsigtig oversvømmelser med sterilt vand med en engangs overførsel pipette, hvis nødvendigt (figur 4C). - Lad dias lufttørre før du fortsætter til isolering af bio-partikler. Se dias ved hjælp af et stereomikroskop (~ 20X for totale billedoplevelse og ~ 200-300X til view individuelle biopartikler) for at sikre korrekt farvning (figur 4D-E).
BEMÆRK: Slæden kan opbevares ved stuetemperatur i en overdækket slide kassen.
3. Isolering af biopartikler af interesse for analyse
- Placer passende antal 0,2 ml PCR-rør i et rack og mærke rørene hensigtsmæssigt.
- Forbered STR forstærkning mix (se Materialer List) i en udpeget PCR amplifikation hætte eller biosikkerhed kabinet. Vortex master mix godt og kortvarigt centrifugeres i en mini-centrifuge.
- Mængden af amplificeringsblandingen nødvendige pr prøve 3.5 pi; forberede en passende mængde master mix for det ønskede antal prøver.
- Pipetter 3,5 pi amplificeringsblandingen i hver 0,2 ml rør. Cap hvert rør løst.
- Anbring et stykke dobbeltklæbende tape på en ren objektglas eller direkte på et glas blok.
BEMÆRK: Dette vil blive brugt til at holde0,2 ml rør på plads under prøvetagningen. - Læg et stykke dobbeltklæbende tape på en ren objektglas. Anbring et stykke vandopløseligt bølge lodde tape på toppen af dobbeltklæbende tape.
BEMÆRK: Denne slide kan opbevares i en ekssikkator til fremtidig brug. - Læg den første 0,2 ml rør på dobbeltklæbende tape dias eller blokere fremstillet i trin 3.4. Sæt dette rør til side, indtil prøven er indsamlet.
- Placer vandopløselige bølge lodde tape slide under mikroskop (lav forstørrelse). Med spidsen af en wolfram nål forsigtigt at skrabe overfladen af båndet for at indsamle en lille mængde (eller "bolden") af klæbemiddel ved enden af nålen (figur 5A).
BEMÆRK: Størrelsen af kuglen kan gøres lille eller stort afhængigt af antallet af biopartikler, der skal indsamles. - Fjern forsigtigt wolfram nål med klæbemidlet under mikroskopet uden at forstyrre spidsen af nålen. Nålen kanvære plads i et rack, hvis det ønskes under prøven placering.
- Placer rede gel-filmprøve (fra trin 1 og 2) på mikroskopbordet. Juster fokus, og forstørrelsen indtil biopartikler let kan ses. Identificer bio-partikler, der vil blive indsamlet.
BEMÆRK: Et glas blok kan anvendes til at støtte dias, hvis nødvendigt. - Hent den wolfram nål med lim bold, og placere nålen over gel-film overflade, hvor bio-partikler af interesse er placeret. Tryk spidsen af nålen (med lim) ned, så det er i kontakt med bio-partikel (figur 5B). Løft nålen op for at sikre, at bio-partiklen er blevet indsamlet. Gentag denne proces, indtil det ønskede antal af bio-partikler er blevet indsamlet.
- Placer fremstillet 0,2 ml PCR-rør på mikroskopbordet. Juster forstørrelse, således at bunden af røret indeholdende amplificeringsblandingen er i fokus.
- Sæt forsigtigt wolfram needle i 0,2 ml PCR-rør, indtil spidsen af kanylen er i amplificeringsblandingen.
BEMÆRK: Dette er bedst udføres, mens du ser gennem mikroskop. - Hold nålen i forstærkning mix indtil limen opløses og biopartikler frigives i opløsning (figur 5C). Fjern nålen, placere 0,2 ml oprejst og løst cap røret.
- Gentag proceduren indsamling til yderligere prøver. Rengør wolfram nål med pre-fugtet alkohol (isopropanol) skubbes ind mellem prøverne.
4. Kombineret Microvolume nukleinsyreisolering (Direkte lysis) og Autosomal Short Tandem Repeat (STR) Profilering
- Forbered lysisbuffer (se Materialer) i en udpeget PCR amplifikation hætte eller biosikkerhed kabinet. Tilføj 1,5 pi lysis buffer til hvert rør for en 5 pi total reaktionsvolumen. Luk rør låg stramt.
BEMÆRK: De 0,2 ml rør indeholder allerede 3,5 ul afforstærkning mix og indsamlingen bio-partikler fra trin 3. - Anbring prøverne i den termiske cycler og forstærke prøverne ved hjælp af følgende cykelforhold: 75 ° C i 15 minutter; 95 ° C i 11 min; 34 cykler af 94 ° C i 20 sekunder og 59 ° C i 3 minutter; 60 ° C i 10 min; og 4 ° C hold.
- Store amplificeringsprodukter ved 4 ° C for korte tids opbevaring.
5. Produkt Detection - kapillarelektroforese (CE)
- I en 96-brønds plade tilsættes 10 pi CE kører mix (9,7 pi deioniseret formamid og 0,3 pi størrelse standard, se Materialer). Tilsæt 1 pi amplificeret produkt eller allelisk stige til hver brønd.
ADVARSEL: Formamid er en potentiel mutagen og bør håndteres i en kemisk hætte, mens iført passende personlige værnemidler. - Brug elektroforetiske betingelser specificeret af producenten i forstærkning kit manual eller internally validerede betingelser.
- Analyser rådata med STR-analyse software.
Representative Results
Repræsentative billeder af individuelle og sammenklumpede biopartikler der blev udvundet fra en skjorte krave (100% polyester), der bæres af en mandlig donor er vist i figur 6 (individuelle biopartikler) og figur 7 (sammenklumpede biopartikler). De biopartikler blev udvundet fra flipperne hjælp protokollen beskrevet her: overførsel af biopartikler fra flipperne til gel-film gennem direkte kontakt, farvning af de genvundne biopartikler med trypanblåt, indsamling af bioparticle prøver ved hjælp af en wolfram nål og vandopløseligt lim og STR-analyse under anvendelse af 5 pi mikro-volumen lysis / STR-amplifikation. Figur 6 og 7 repræsenterer en typisk prøveudtagning af biopartikler, der ville blive analyseret af en individuel kontakt DNA element (20 enkelt / individuelle biopartikler og 20 sammenklumpede biopartikler). Den bioparticle (er) opsamles i hvert billede er mærket med længde og bredde målinger (i mikrometer). Den percentage af STR alleler udvundet fra hver af de indsamlede bioparticle (er) er tilvejebragt på hvert enkelt billede for at demonstrere de variable grader af succes, som kan forventes at opnå fra biopartikler med denne type beviser. De udvundne fra touch-DNA-prøver biopartikler er stort set døde eller døende keratinocytter og derfor en overbevisende STR profil ikke opnået fra hver bioparticle opsamlet, som det kan ses i figur 6 og 7. Til dette flipperne prøve blev STR profiler opnået fra 14/20 (70%) af de individuelle biopartikler og 15/20 (75%) clumped biopartikler. Men hver af de genvundne profiler varierer i bevisværdi: 3-97% allel genvinding for individuelle biopartikler profiler og 3-100% allel opsving for de klumpet bioparticle profiler. På grund af variabilitet i succesrater, er indsamlingen af talrige biopartikler fra hver berøring DNA post anbefales. Dette sikrer en bedre chance for at opnå en meget probative STR-profil.
STR-profil opnået fra en af de enkelte bioparticle prøver fra flipperne er vist i figur 8 (den bioparticle hvorfra profil stammer er vist til venstre). Næsten en fuld STR-profil (28 ud af 30 alleler, et locus droppe ud, nøjagtighed af den opnåede profil verificeret ved sammenligning med en reference profil) blev opnået fra denne person bioparticle. Den opnåede profil er af høj kvalitet med rimelighed balancerede mellem locus tophøjder og ingen allel falde ud. Allelic droppe ud og ubalancerede peak højde artefakter er begge jævnligt observeret med lav skabelon DNA-prøver. Den STR-profil opnået fra en af de klumpet bioparticle prøver fra flipperne er vist i figur 9. En fuld STR-profil (30/30 alleler, nøjagtighed af den opnåede profil verificeret ved sammenligning med en reference-profil) blev opnået. Som tidligere nævnt er en STR-profil ikke er inddrevet i nogensindey bioparticle indsamles. Et eksempel på mislykket DNA-profilering af et enkelt bioparticle (3% allel nyttiggørelse, 1/30 alleler) er vist i figur 10 (individuel bioparticle). Mens denne person bioparticle lykkedes ikke, var stærkt bevisværdi STR profiler af donoren af biopartikler i denne prøve opnået fra andre biopartikler udvundet fra den samme prøve. Dette illustrerer behovet for at udføre flere enkelt celle / klump prøvetagninger fra samme objekt.
De udviklede "smarte" analysemetoder beskrevet her til touch DNA-beviser er blevet anvendt med succes til at genvinde bevisværdi enkelt kilde profiler fra single og "klumpet" biopartikler fra forskellige rørt genstande og tøj (fx stol armlæn, bil rat, mobiltelefoner, kaffekopper, cigaretter, kuglepenne, skjorter, shorts, og trøjer). Men vigtigere, denne tilgang er også blevet anvendt til påvisning og profilering af mandlige dOnor DNA (enkelt kilde) i simulerede fysisk kontakt / overfald blandingen prøver (f.eks gerningsmand snuppe et offers håndled, hals eller tøj, eller kontakt med ofrets strøelse som i seksuelle overgreb).
Figur 1: Fremstilling af gel-film slides for bioparticle samling. (A) Den hvide tilbage overdækning fjernes under anvendelse af sterile pincetter fra det stykke gel-film for at blotlægge det klæbende bagside. Gel-film er derefter klæbet til et objektglas med et fast tryk. (B), når gel-filmprøve er klar til at blive anvendt til bioparticle indsamling, den øverste klare beskyttende film fjernes ved anvendelse af sterile pincetter.
Figur 2: Bioparticle samling ved hjælp af gel-film fra forskellige substrater. kan gel-film slides anvendes til at indsamle biopartikler fra en række forskellige overflader. Gel-film placeres i direkte kontakt med genstanden eller overfladen af interesse. Trykker let med henblik på at overføre biopartikler på gelen-film overflade. Indsamling af biopartikler fra (A) brugte beklædningsgenstande poster (frakke krave), (B) rørt objekter (rejse kaffekop) og (C) direkte menneskelig hud (mand håndled) er vist.
Figur 3:. Biopartikler på en slidt tøj element (inde bukseben) biopartikler overføres til gel-film gennem direkte kontakt med genstanden overflade. Biopartikler kan findes som "klumper" eller individuelle / enkelt biopartikler (angivet med røde pile).
Figur 4:. Valgfri farvning af biopartikler på gel-film dias for bedre visualisering af biopartikler kan gel-filmprøver farves med trypanblåt plet. Hele overfladen af gel-film er dækket af trypanblåt (A). Efter 1-2 min af farvning objektglasset forsigtigt vippes for at tillade overskydende plet at løbe skyderen (B). Let oversvømmelser med sterilt vand (C) kan anvendes til at fjerne overskydende farve. Efter objektglasset lufttørret kan slide ses under mikroskop for at sikre korrekt farvning (D, E). Bemærk:. Ikke alle biopartikler er farvede (dvs. blåt) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
OAD / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
Figur 5: Bioparticle indsamling og analyse. (A) En lille mængde (eller "bolden") af vandopløseligt bølge lodde tape ("klæbende") opsamles på spidsen af en wolfram nål ved forsigtig skrabning. (B) Klæbemidlet derefter rørt til gel- film overflade for at indsamle biopartikler af interesse. Individuelle eller flere biopartikler kan opsamles med en enkelt klæbende bold. (C) Når de ønskede biopartikler er blevet indsamlet, er spidsen af nålen placeres i forstærkning mix i en 0,2 ml PCR-rør. Nålen holdes i væsken, indtil det opløses og observeres frigivelse af biopartikler i opløsning. Alle trin i samlingen processen udføres, og set under mikroskop for at sikre en vellykket bioparticle indsamling og overførsel. Klik her for at se et larGER version af denne figur.
Figur 6:. Individuelle biopartikler i en skjorte krave prøve biopartikler blev udvundet under anvendelse af gel-film fra indersiden af en skjorte krave båret af en mandlig donor. De biopartikler blev farvet ved hjælp af trypanblåt og billeder af tyve forskellige individuelle biopartikler i stikprøven identificeres, vises. I hvert billede er bioparticle der blev indsamlet cirkel (røde cirkler angiver biopartikler, hvor en profil blev genfundet, sorte cirkler angiver biopartikler, hvor en profil ikke er inddrevet). Den procentvise allel genvinding (antal observerede alleler ud af en mulig 30) vises over billedet af bioparticle hvorfra en profil blev udvundet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7: klumpet biopartikler i en skjorte krave prøve biopartikler blev udvundet under anvendelse af gel-film fra indersiden af en skjorte krave båret af en mandlig donor.. De biopartikler blev farvet ved hjælp af trypanblåt og billeder af tyve forskellige klumpet biopartikler i stikprøven identificeres, vises. I hvert billede er bioparticle der blev indsamlet cirkel (røde cirkler angiver biopartikler, hvor en profil blev genfundet, sorte cirkler angiver biopartikler, hvor en profil ikke blev genfundet Procenten allel genvinding (antal observerede alleler ud af en mulig 30). er vist for hver bioparticle hvorfra en profil blev udvundet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 8: Autosomal STR profil opnået fra en enkelt bioparticle fra en mandlig flipperne en autosomal STR profil blev opnået fra en enkelt bioparticle (vist til venstre) ved hjælp af de 5 pi direkte lysis / amplifikationsreaktion.. Nøjagtigheden af denne profil blev bestemt ved sammenligning med en donor referenceprøve. Femten autosomal STR-loci og amelogenin (kønsbestemmelse) co-amplificeres i en enkelt reaktion og separeret ved kapillarelektroforese. Resultaterne vises her som et elektroferogram. Allel numre er betegnelse under hver top ved hvert locus. X-aksen repræsenterer størrelse fragment (basepar, bp) og y-aksen repræsenterer signal intensitet (RFU relative fluorescensenheder, forudsat under hver tilsvarende allel nummer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Autosomal STR-profil opnået fra en klumpet bioparticle fra en mandlig flipperne en autosomal STR-profil blev opnået fra en klumpet bioparticle (vist til venstre) ved hjælp af de 5 pi direkte lysis / amplifikationsreaktion.. Nøjagtigheden af denne profil blev bestemt ved sammenligning med en donor referenceprøve. Femten autosomal STR-loci og amelogenin (kønsbestemmelse) co-amplificeres i en enkelt reaktion og separeret ved kapillarelektroforese. Resultaterne vises her som et elektroferogram. Allel numre er betegnelse under hver top ved hvert locus. X-aksen repræsenterer størrelse fragment (basepar, bp), og Y-aksen repræsenterer signalintensitet (RFU relative fluorescens enheder under hver tilsvarende allel nummer).pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 10:. Eksempel på manglende opnåelse en autosomal STR-profil opnået fra en samlet bioparticle Den individuelle bioparticle vist på venstre blev indsamlet fra en skjorte krave gel-film prøve. Som det kan ses fra den resulterende STR profil (vist til højre), blev kun en allel (ud af 30 mulige) opnået. Allel numre er betegnelse under hver top ved hvert locus. X-aksen repræsenterer størrelse fragment (basepar, bp) og y-aksen repræsenterer signal intensitet (RFU relativ fluorescensenheder, forudsat under hver tilsvarende allel nummer). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Her har vi beskrevet metoder til indsamling og øget genetisk analyse af biopartikler udvundet fra touch-DNA-beviser. Den udviklede metode involverer følgende: 1) indsamling af biologisk materiale (dvs. biopartikler) via gel-film fra rørt genstande og overflader, slidte tøj eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøgelse af den genvundne biologisk materiale for at sikre samling af potentielle humant biologisk materiale, og 3) mikromanipulering af enkelt eller få biopartikler anvendelse af et vandopløseligt klæbemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering af de indsamlede biopartikler bruger microvolume (5 pi) i ét trin lysis / amplifikationsreaktion. Brugen af en et-trins lukkede rør reaktion reducerer risikoen for forurening og prøve tab fra yderligere prøve manipulationer eller overførsel til andre reaktionsrør. Den forbedrede en-trin microvolume (5 pi) lysis / STR amplificeringsreaktioner tillader inddrivelse af hel eller probative STR profiler af donoren af enkelte eller få biopartikler. Denne fremgangsmåde blev udviklet for at opnå en enkelt kilde STR profiler fra enkelt- og multi-source touch-DNA-beviser (f.eks, slidte tøj og andre husholdningsartikler, rørt håndteres / genstande og overflader, hud / hud blandinger). Det har med succes været anvendt til påvisning af den mandlige donor i simulerede fysiske overgreb blandingen prøver.
Denne strategi kunne evalueres yderligere i yderligere kropsvæske / væv blandingen scenarier såsom et offer skrabe hans / hendes voldsmand, hvor kun få biopartikler fra voldsmand ville være til stede blandt en overvældende mængde af biologisk materiale fra offeret. Derudover, da denne tilgang er udviklet i den aktuelle undersøgelse muliggør analyse på enkelt bioparticle niveau, det kunne bruges til at få en bedre forståelse af arten og omfanget af sekundær overførsel 14-19, hvor en mellemmand overfører en dna-profil på en Surface, genstand eller person til en anden overflade genstand eller person 20. En blind-pensling tilgang til analysen af sekundær overførsel kan ikke identificere spormængder af materiale fra den sekundære donor. Den fremgangsmåde udviklet her tillader analyse af enkelte eller få biopartikler, og derfor er resultaterne ikke forstyrret af tilstedeværelsen af en overvældende mængde af biologisk materiale fra den primære donor. De metoder, der er udviklet i dette arbejde kan også have konsekvenser for analyse af spor biologisk materiale i seksuelle overgreb tilfælde som dem, der involverer digitale penetration af skeden, hvor positiv identifikation af spormængder af hudceller fra gerningsmanden kan være afgørende at fastslå, at seksuel kontakt opstod.
Mens indsamling af biopartikler fra gel-film prøve ikke indebærer vanskelige og komplekse manipulationer, der er kritiske skridt i denne procedure, der skal udføres med stor omhu for at sikre, successful overførsel af biopartikler til den nedstrøms reaktionsbeholder. Samlingen af biopartikler med vandopløseligt klæbemiddel skal ses mikroskopisk (dvs. at stereomikroskop ved stor forstørrelse (~ 200-300X) sikre, at kun de biopartikler af interesse opsamles. Afhængig af størrelsen af klæbemidlet "bolden" bruges, er der er potentialet til at indsamle yderligere omgivende materiale, som kan omfatte både biologiske og ikke-biologisk materiale (f.eks, fibre, andet snavs). kan Indsamlingen af utilsigtede yderligere biopartikler medføre inddrivelse af sammenblandede DNA-profiler. Samlingen af ikke-biologisk materiale kan indføre inhibitorer ind i mikro-volumen lyse / STR reaktioner. Hvis flere biopartikler indsamles med samme lim "bold", er der et potentiale for tidligere indsamlede biopartikler at blive Ikkefastgjorte fra limen. Dette er ikke observeret hyppigere, men kan forekomme når større antal bioparticles er indsamlet (fx over 50) med en enkelt klæbemiddel "bolden". Hvis der målrettet et stort antal biopartikler, anbefales det, at flere samlinger af færre biopartikler er lavet, men alle overføres til samme 0,2 ml rør. Når biopartikler er blevet indsamlet, skal man være omhyggelig under fjernelse af gel-film slide fra mikroskopbordet og anbringelse af 0,2 ml rør, således at spidsen af nålen ikke forstyrres. Under placering af spidsen af nålen i amplificeringsblandingen nederst 0,2 ml rør, bør nålespidsen ikke komme i kontakt med siderne af røret for at undgå tab af materiale på siderne af røret. Mens solubilisering af klæbemidlet er typisk hurtig (~ 30 sek eller mindre afhængig af størrelsen af klæbemidlet "bolden") og kan overvåges under mikroskopisk undersøgelse bør kanylespidsen langsomt fjernes fra amplificeringsblandingen at sikre fuldstændig solubiliseringaf klæbemidlet er blevet opnået. Hvis klæbemidlet ikke er helt opløst, kan nålen blive returneret til væsken for at tillade fuldstændig opløsning.
De her beskrevne protokoller er blevet optimeret til brug med biopartikler og menneskelige celler fra retsmedicinsk biologiske beviser. Lysis buffer valgt, er kompatibel med det valgte DNA-STR amplifikation kit. Selvom der kan være passende alternative lysis buffere, skal deres effektivitet med hensyn til cellelyse og kompatibilitet med nedstrøms analyse kontrolleres af brugeren. Derudover har STR forstærkning kit og amplifikationscyklus nummer beskrevet i denne protokol er optimeret til brug med en enkelt eller få biopartikler. En næste generation STR forstærkning kit med rapporteret øget robusthed og følsomhed blev udvalgt og har vist sig at resultere i inddrivelse af høj kvalitet STR-profiler fra enkelte eller få biopartikler. Mens mange andre STR kits, med varierende anbefalet forstærker,kation cyklus tal, er til rådighed, kan de ikke råder over det fornødne følsomhed og derfor vil skulle evalueres korrekt før brug i disse protokoller.
På trods af den vellykkede anvendelse af de beskrevne metoder til genopretning STR profiler fra en enkelt eller få biopartikler vil succesraten for profil opsving ikke være 100%. Derfor kan for nogle prøver observeres en begrænset del dna-profil eller ingen profil. Dette kan ikke undgås på grund af den manglende evne til endegyldigt visuelt identificere de fleste biopartikler som cellulært materiale, den potentielle forringede tilstand af det nukleare materiale i de indsamlede biopartikler eller tab af prøvemateriale fra klæbemidlet før overførsel til reaktionsbeholderen. Derfor er analysen af en enkelt bioparticle prøve for hvert tryk DNA element ikke anbefales. Vi ofte indsamler 20 prøvesæt fra en person gel-film prøven og vil indsamle yderligere prøvesæt efter behov, hvis en egnet STR-profil ikke opnås. THan eneste begrænsning for samlinger er mængden af biologisk materiale til stede på gelen-film prøve (og sandsynligvis udgifter til analyse, selvom microvolume reaktioner giver mulighed for at indsamle yderligere prøver til en tilsvarende eller lavere pris som en enkelt standard reaktion volumen ( fx 25 pi).
De udviklede DNA-profilering metoder beskriver her giver en molekylær tilgang til karakterisering, analyse og fortolkning af spor biologisk materiale udvundet fra touch-DNA-prøver. Men der er yderligere genetisk information, der kan fås fra de gendannede biopartikler foruden bestemmelse af donor (dvs. STR profil) af donoren af det biologiske materiale. Vævet eller kropsvæske kilde til oprindelse (f.eks, hud versus spyt) kan tilvejebringe vigtige baggrundsoplysninger til en strafferetlig efterforskning. Uden en sådan bestemmelse, kan den tvetydighed af vævet kilde til oprindelseslandet eksplgrænset som alternative omstændigheder i kriminalitet (f.eks hvordan kroppen væske kan være deponeret) kunne foreslået. De bioparticle indsamling og isolation protokoller beskrevet her kan anvendes til at indsamle biopartikler eller andre celler (f.eks, buccal, vaginal) til anvendelse i et væv kildeidentifikation (mRNA profilering 21-30) strategi der involverer mikro-volumen revers transkription (RT) og amplifikationsreaktioner. Med yderligere optimering kan det også være muligt at udvikle en DNA / RNA co-isolation strategi at tillade celletype identifikation (RNA) og STR profilering fra den samme prøve, herunder biopartikler fra kontakt DNA-beviser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767 (1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
