Summary
Hier beschreiben wir eine optimierte und effiziente Entfernung Strategie für die Sammlung von in der heutigen Bio-Partikel 'berühren DNA' Proben, zusammen mit einer verbesserten Amplifikationsprotokoll mit einem einstufigen 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der erlauben Short Tandem Repeat (STR) Profile der Bio-Korn Spender (n).
Abstract
DNA-Profile können aus 'touch DNA "Beweise, die mikroskopische Spuren von menschlichem biologischem Material besteht, erhalten werden. Aktuelle Verfahren zur Rückgewinnung von Spuren DNA beschäftigen Wattestäbchen oder Klebeband einen Bereich von Interesse zu probieren. Allerdings wird eine solche "Blind swabbing Ansatz zusammen Probe Zellmaterial aus den verschiedenen Individuen, auch wenn der Individuen Zellen werden in geographisch unterschiedlichen Orten auf dem Artikel entfernt. Somit können einige der DNA-Mischungen in Kontakt DNA Proben angetroffen werden künstlich durch das Einstreich selbst erzeugt. In einigen Fällen kann ein Opfer DNA in erhebliche Überschreitung gefunden werden damit alle potenziellen Täters DNA Maskierung.
Um die Herausforderungen, die mit Standard-Recovery-und Analyseverfahren zu umgehen, haben wir ein kostengünstiger, "intelligente Analyse 'Methode, die zu einer erhöhten genetischen Analyse von Touch-DNA-Beweise ergibt entwickelt. Wir beschreiben eine optimierte eind effiziente Mikromanipulation Recovery-Strategie für die Sammlung von DNA-Proben in Kontakt vorhanden bio-Partikel sowie eine verbesserte Verstärkung Strategie, die ein einstufiges 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der STR-Profile aus dem Bio-Korn Spenders erlauben (e). Die Verwendung von einzelnen oder wenigen (dh "Klumpen") Biopartikeln Ergebnisse in der Fähigkeit, Hand-Profile zu erhalten. Diese Verfahren stellen alternative verbesserte Techniken zur Isolierung und Analyse einzelner Biopartikeln von forensischen Touch-DNA-Beweise. Während in jedem forensischen Untersuchung nicht notwendig ist, kann die Methode sehr vorteilhaft für die Gewinnung von einer Hand Täter DNA-Profil in Fällen körperlicher Gewalt (zB Strangulation), die nicht möglich sein kann mit Standard-Analyseverfahren sein. Zusätzlich sind die hier entwickelten Strategien bieten die Möglichkeit, genetische Information in der Einzelzellebene aus einer Vielzahl von o zu erhaltenther nicht-forensische Spuren biologischem Material.
Introduction
Touch-DNA ist eine Form der Spur biologischen Beweismaterial, das die direkte Übertragung von Zellmaterial ist (zB Schuppen Hautzellen) von einer Einzelperson zu einem Objekt oder einer anderen Person beim Körperkontakt 1. Die Fähigkeit, DNA-Profile aus einer Vielzahl von Objekten zu erhalten berührt (Dokumente, Bettwäsche, Schuhe, Waffen, Trinkbehälter, Stifte, Aktenkoffer Griffe) wurde in der Literatur 9.2 berichtet.
Ein kritischer Faktor bei der Analyse von DNA-Spuren Touch ist die erfolgreiche Wiederherstellung der biologischen Spurenmaterial vorhanden. Tippen Sie auf DNA-Spuren wird typischerweise durch Abtupfen der verdächtigten Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen gesammelt (im Folgenden als "blind-Abstrich" bezeichnet). Mit diesem Ansatz wird die Art der gesammelten biologischen Materials nicht bekannt ist und Abtastung eines verallgemeinerten Bereich durchgeführt wird. Die Anwesenheit der Oberfläche Rillen oder Spalten kann die erfolgreiche Wiederherstellung der oft schon kleine Menge von Bi behinderngischen Material vorhanden. Zusätzlich wird ein "blind-Abstrich-Ansatz zwangsläufig Zusammenarbeit Probe Zellmaterial aus den verschiedenen Individuen, deren Zellen auf das Element vorhanden sind, auch wenn der Individuen Zellen werden in räumlich getrennten Stellen auf dem Objekt befindet. Die Erholung der beigemischten DNA-Profilen, die oft eine Herausforderung, besonders mit niedrigen template DNA-Proben zu lösen, wird häufig beobachtet, 8,10,11 und in vielen Fällen wird eine Folge Artefakt der swabbing Prozess selbst. Wenn nur eine kleine Menge an Material vorhanden war von einem der Spender kann Standard-Extraktion und Analyse-Techniken nicht, ein Profil aus der geringfügigen Beitrag zu erholen. Zusätzlich kann die Art der Tupfer oder ob es trocken oder nass verwendet (vorbefeuchteten mit sterilem Wasser) kann die Menge an biologischem Material, das gesammelt wird aufgrund von Unterschieden in Absorptionsfähigkeit und Adsorptionsfähigkeit und die Effizienz der Freisetzung des biologischen Materials 12 zu beeinflussen. Standard Extraktionsverfahren können in zusätzlichen Probenverlust aufgrund erforderlichen physikalischen Manipulationen der Probe oder Probentransferschritten führen.
Wie oben beschrieben, können einfache Einstreichtechniken für die Gewinnung von biologischem Material in den Verlust von Spurenmengen von biologischen Probe, sowie ein erhöhtes Auftreten von beigemischten Profile aufgrund eines Fehlers zu individuellen biologischen Komponenten zu trennen führen. Deshalb haben wir versucht, selektiver und effizienter Wiederherstellungsstrategien für die Sammlung von über berührte Objekte vorhanden zellulären Mikropartikeln zu entwickeln. Das entwickelte Strategie zur Analyse von biologischem Material durch Berührung DNA Beweis (hier bezeichnet als "Biopartikel" aufgrund der Tatsache, dass ein Kern ist nicht immer sichtbar, da ein Großteil der Zellen in der äußeren epidermalen Schicht der Haut tot oder sterbend sind Keratinozyten 13) beinhaltet die folgenden: 1) Sammlung von biologischem Material (dh Biopartikeln) über Gelfilmbildung from berührt Gegenständen und Flächen, verschlissene Kleidungsstücke oder direkte menschliche Haut, 2) mikroskopische Untersuchung des gewonnenen biologischen Material die Sammlung von möglichen menschlichen biologischen Materials zu gewährleisten, und 3) die Mikromanipulation einzelner oder weniger bio-Partikel mit einem wasserlöslichen Klebstoff und 4) autosomal DNA-STR Profilierung der gesammelten biologischen Partikeln mit einem Mikrovolumen (5 ul) einstufige Lyse / Amplifikationsreaktion.
Dieses Verfahren bietet zahlreiche Vorteile gegenüber traditionell verwendeten Analysemethoden. Rückgewinnung von Biopartikeln mit der Gel-Film ermöglicht eine mikroskopische Untersuchung des in der Probe vor der Analyse der biologischen Material vorhanden. Während ein Großteil der Biopartikel aus Touch DNA Beweis gewonnen möglicherweise nicht kernhaltige Zellen macht es schwierig, festzustellen, welche oder wie viele biologische Partikel sollten ausgewählt werden, die mikroskopische Untersuchung der Proben vor der Analyse bietet die Gelegenheit zu geben für kernhaltige Zellen zu suchen so maximizing die Wahrscheinlichkeit von DNA-Profil Erholung. Die Sammlung von Biopartikeln Verwendung wasserlöslicher Klebstoff unterstützten Mikromanipulation erlaubt die direkte Übertragung von gezielten Biopartikeln in Reaktionsgefäßen. Dieses Verfahren ist unter dem Mikroskop sichtbar gemacht, um eine erfolgreiche Übertragung des biologischen Materials zu gewährleisten. Das reduziert oder Mikrovolumen Reaktion erhöht die Empfindlichkeit bei gleichzeitiger Reduzierung der Kosten für die Analyse pro Probe. Dies ermöglicht die Analyse der erhöhten Anzahl von Proben aus einem einzelnen Stück von Beweisen. Durch den Bereich der genetischen Zustand der Bio-Partikel in Kontakt zu DNA-Spuren werden mehrere Stichproben aus einzelnen Positionen empfohlen.
Hier zeigen wir die erfolgreiche Anwendung der entwickelten Protokolle zur hochBeweis genetische Profile der Spender von biologischem Material in Kontakt zu DNA-Beweise erhalten. Die entwickelten Biopartikel Sammlung und DNA-Profiling Methoden bieten einen umfassenden "intelligenten" (dh spezifisch, messbar, attainable, realistische und zeitnahe) molekularen Ansatz für die Charakterisierung, Analyse und Interpretation der Spuren biologischem Material. Obwohl ursprünglich für die Anwendung auf die forensische Analyse von DNA-Spuren Touch entwickelt, können die hier entwickelten Strategien zu anderen Quellen von biologischem Material aufgetragen werden und bieten die Möglichkeit, individuelle Identifizierungsdaten auf Einzelzellebene zu erhalten.
Protocol
HINWEIS: Körperflüssigkeiten wurden von Freiwilligen unter Verwendung von Verfahren von der University of Central Florida Institutional Review Board genehmigt gesammelt. Informierte Zustimmung wurde von jedem Spender erhalten.
1. Erhebung von Biopartikeln von Touched Objekte und Oberflächen
- Schneiden Sie das Gel-Films auf die gewünschte Größe. Sicherzustellen, dass es die richtige Größe für das Glas-Objektträger, die als fester Träger verwendet wird. Zum Beispiel für eine 3 "x 1" Glasträger, mit einem Gel-Film Größe von 2 "x 0,75".
HINWEIS: Die Länge und Breite des Materials verringert werden kann, wenn gewünscht, aber sollte diese Größe nicht überschreiten. - Entfernen Sie die weiße Schutzfolie von der Gel-Folie und bringen Sie die Gel-Film auf dem Objektträger (Abbildung 1A). Drücken Sie fest, um eine komplette Anlage zu gewährleisten.
HINWEIS: Es gibt einen klaren oberen Schutzschicht, die nicht entfernt werden darf, damit Druck auf dem Stück Gel-fil angewendet werden kannm ohne Kontamination der Gel-Schichtoberfläche. Prepared Gelfilmbildung Folien (mit Schutzschicht befestigt) kann bei Raumtemperatur bis zu ihrer Verwendung gelagert werden. - Entfernen Sie die obere Schutzfolie von der Gel-Folie mit einer sterilen Pinzette, wenn bereit, (1B) das Gel-Folienprobe zu verwenden. Legen Sie das Gel-Folienoberfläche in direktem Kontakt mit dem gewünschten Objekt oder Oberfläche berührt (Abbildung 2). Eine kleine Menge von Druck, um einen effizienten Transfer der Bio-Teilchen zu der Gelfilmbildung gewährleisten.
HINWEIS: Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, der Objektträger brechen könnte.
HINWEIS: Mehrere Abtastungen aus dem gleichen Objekt oder Oberfläche kann auf dem gleichen Stück Gelfilmbildung gesammelt werden. - Die Übertragung der bio-Teilchen auf die Gel-Schicht (3) durch Anordnen der Folie auf ein Stereomikroskop (trans- oder epi-Beleuchtung kann verwendet werden). Verwenden Vergrößerung ~ 20X für beste Sicht größere Bereiche des Gel-Film, und Vergrößerung von ~ 200X für beste viewing einzelnen Bio-Partikel.
- Bewahren Sie die Gel-Folienprobe Rutsche bei Raumtemperatur in einem abgedeckten Schiebefenster oder sofort verwenden zum Färben und / oder Bio-Partikelsammlung.
2. Optional Färbung von Biopartikeln in Visualisierung Aid
- Legen Sie das Gel-Folienprobe Folie in Schritt 1 vorbereitet auf einen Objektträger-Färbebank über ein Waschbecken.
- Verwendung einer Einweg-Transferpipette, decken die gesamte Gel-Filmoberfläche mit Trypanblau-Färbung (4A). Inkubiere bei Raumtemperatur für 1-2 min.
- Überschüssiges Fleck durch Kippen des Schiebe der Fleck in der Spüle (4B) abfließen zu lassen.
Hinweis: Der Schieber kann durch schonende Überflutung mit sterilem Wasser abgespült werden mit einem Einmaltransferpipette, wenn nötig (4C). - Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen, bevor Sie fortfahren, um die Isolierung von Bio-Partikel. Sehen Sie die Folie mit einem Stereomikroskop (~ 20X für die gesamte Anzeige und ~ 200-300X zu view einzelnen Biopartikeln), um die ordnungsgemäße Färbung (4D-E) zu gewährleisten.
Hinweis: Der Schieber kann bei Raumtemperatur in einem abgedeckten Schiebe Kasten gelagert werden.
3. Isolierung Biopartikeln der Zinsen für Analysis
- Legen Sie die entsprechende Anzahl von 0,2 ml PCR-Gefäße in einem Rack und beschriften Sie die Rohre entsprechend.
- Bereiten Sie die STR Amplifikationsgemisch (siehe Materialliste) in einem bestimmten PCR-Amplifikation Haube oder Biosicherheitswerkbank. Mischen Sie den Master-Mix gut und kurz in einem Mini-Zentrifuge zentrifugieren.
- Das Volumen der Mischverstärkung benötigt pro Probe beträgt 3,5 & mgr; l; Vorbereitung ein geeignetes Volumen von Mastermix für die gewünschte Anzahl von Proben.
- Pipettieren Sie 3,5 ul der Verstärkung Mix in 0,2 ml-Tube. Verschließen Sie jedes Rohr locker.
- Legen Sie ein Stück Doppelklebeband auf einen sauberen Glasobjektträger oder direkt auf einem Glasblock.
Hinweis: Dies wird verwendet, um die zu halten0,2-ml-Röhrchen anstelle während der Probenahme. - Legen Sie ein Stück Doppelklebeband auf einen sauberen Glasobjektträger. Legen Sie ein Stück wasserlöslichen Wellenlöten Band auf der Oberseite des Doppelklebeband.
HINWEIS: Diese Folie kann in einem Exsikkator für eine spätere Verwendung gespeichert werden. - Legen Sie die erste 0,2-ml-Tube an die Doppelseitiges Klebeband Schieber oder Block in Schritt 3.4 vorbereitet. Stellen Sie diesen Schlauch zur Seite, bis die Probe gesammelt.
- Setzen Sie den wasserlöslichen Wellenlöten Band Objektträger unter dem Mikroskop (geringer Vergrößerung). Verwendung der Spitze einer Wolfram Nadel sanft kratzen die Oberfläche des Bandes, um eine kleine Menge (oder "Kugel") aus Klebstoff an dem Ende der Nadel (5A) zu sammeln.
HINWEIS: Die Größe der Kugel können klein oder groß sein, abhängig von der Anzahl der Biopartikel, die gesammelt werden soll. - Die Wolfram-Nadel mit Klebstoff unter dem Mikroskop vorsichtig entfernen, ohne dass die Spitze der Nadel zu stören. Die Nadel kannsein Platz in einem Rack, wenn während der Proben Platzierung gewünscht.
- Legen Sie das vorbereitete Gel-Folienprobe (von Schritt 1 und 2) auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus und Vergrößerung, bis die Biopartikeln kann leicht eingesehen werden. Identifizieren Sie die Bio-Partikel, die erhoben werden.
ANMERKUNG: Eine Glasblock kann verwendet werden, um die Folie zu unterstützen, wenn nötig. - Rufen Sie die Wolfram-Nadel mit Klebstoff Ball, und setzen Sie die Nadel über dem Gel-Folienoberfläche, wo die biologischen Partikel von Interesse befinden. Drücken der Spitze der Nadel (mit Klebstoff) so, daß es in Kontakt mit der Bio-Teilchen (5B) ist. Heben Sie die Nadel bis zu gewährleisten, dass die Bio-Teilchen gesammelt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Bio-Partikel gesammelt wurden.
- Die vorbereitete 0,2 ml PCR-Röhrchen auf dem Mikroskoptisch. Wird die Vergrößerung, so daß der Boden der Röhrchen mit dem Amplifikationsgemisch im Fokus ist.
- Die Wolfram needl vorsichtige in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen, bis die Spitze der Nadel in der Verstärkungsmischung.
Hinweis: Dies wird am besten durchgeführt, während Sie durch das Mikroskop. - Halten der Nadel in dem Amplifikationsgemisch, bis der Klebstoff sich auflöst und die Biopartikel in Lösung (5C) freigesetzt. Entfernen Sie die Nadel, legen Sie die 0,2 ml aufrecht und locker Kappe der Röhre.
- Wiederholen Sie den Vorgang für weitere Sammelproben. Reinigen Sie die Wolfram-Nadel mit vorbefeuchtete Alkohol (Isopropanol) wischt in zwischen den Proben.
4. Kombinierte Mikrovolumen Nukleinsäure-Isolierung (Direct Lyse) und autosomal-Short Tandem Repeat (STR) Profiling
- Bereiten Sie die Lyse-Puffer (siehe Materialien) in einem bestimmten PCR-Amplifikation Haube oder Biosicherheitswerkbank. Hinzufügen von 1,5 & mgr; l Lysepuffer zu jedem Röhrchen für ein 5 & mgr; l Gesamtreaktionsvolumen. Schließen Gefäßdeckel fest.
HINWEIS: Die 0,2-ml-Röhrchen mit 3,5 ul der bereits enthaltenVerstärkung Mix und die Sammlung bio-Partikel aus Schritt 3. - Anschließend Proben im Thermocycler und verstärken die Proben unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen: 75 ° C für 15 min; 95 ° C für 11 min; 34 Zyklen von 94 ° C für 20 sec und 59 ° C für 3 min; 60 ° C für 10 min; und 4 ° C halten.
- Speicher Amplifikationsprodukte bei 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung.
5. Produkterkennung - Kapillarelektrophorese (CE)
- In einer Platte mit 96 Vertiefungen, fügen Sie 10 ul CE Lauf Mix (9,7 ul deionisiertem Formamid und 0,3 ul Größenstandard, siehe Materialien). 1 ul der amplifizierten Produkts oder Allelleiter in jede Vertiefung.
VORSICHT: Formamid ist ein potenzieller mutagen und sollte in einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. - Verwenden Sie die vom Hersteller angegeben elektrophoretische Bedingungen im Amplifikationskit manuelle oder internally abgesicherten Bedingungen.
- Analysieren von Rohdaten mit STR-Analyse-Software.
Representative Results
Repräsentative Bilder der einzelnen und verklumpten Biopartikel, die von einem Kragen (100% Polyester) mit einem männlichen Spenders getragen gewonnen wurden, sind in Abbildung 6 (Einzel Biopartikel) und Figur 7 (verklumpt Biopartikel) gezeigt. Die Biopartikeln wurden aus dem Hemdkragen mit dem hier beschriebenen Protokoll erholt: Transfer von Biopartikeln aus dem Hemdkragen zu Gel-Film durch direkten Kontakt, Färbung der wieder Biopartikeln mit Trypanblau, Sammlung von Biopartikel Proben unter Verwendung eines Wolfram Nadel und wasserlöslicher Klebstoff und STR-Analyse mit dem 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung. 6 und 7 stellen eine typische Abtastung Biopartikeln, die von individueller Note DNA Titeln (20 Einzel / Einzel Biopartikeln und 20 verklumpten Biopartikeln) untersucht werden würde. Die Biopartikel (e) in jedem Bild gesammelt werden mit Längen- und Breitenmessungen (in Mikrometer) markiert. Die percentage der STR-Allele aus jedem der gesammelten Biopartikel (e) gewonnen wird, für jedes Einzelbild zur Verfügung gestellt, um die variablen Erfolgsgrade, die voraussichtlich von Biopartikeln mit dieser Art von Nachweis erhalten werden demonstrieren. Die durch Berührung DNA Proben gewonnen Biopartikel weitgehend tote oder sterbende Keratinozyten und damit eine Beweis STR Profil nicht voneinander Biopartikel gesammelt werden, wie dies in den 6 und 7 zu sehen ist. Aus diesem Hemdkragen Probe wurden STR Profile 14/20 (70%) der einzelnen Biopartikeln erhalten und 15/20 (75%) verklumpt Biopartikeln. Aber jeder der wieder Profile reicht in Beweiskraft: 3-97% Allel Erholung für einzelne Biopartikeln Profile und 3-100% Allel Erholung für die verklumpten Biopartikel Profile. Aufgrund der Variabilität der Erfolgsraten wird die Sammlung von zahlreichen Biopartikeln aus jeder Note DNA Artikel empfohlen. Dies gewährleistet eine bessere Chance auf einen hoch probative STR-Profil.
Der STR-Profil von einer der individuellen Biopartikel Proben aus dem Kragen ist in Figur 8 dargestellt (die Biopartikel aus dem das Profil entstanden ist links gezeigt). Fast ein Voll STR-Profil (28 von 30 Allele, ein Ort herausfallen, Genauigkeit der erhaltenen Profile durch Vergleich mit einem Referenzprofil verifiziert) wurde von dieser Person Biopartikel erhalten. Das erhaltene Profil ist von hoher Qualität mit einem angemessenen Verhältnis inter Locus Peakhöhen und kein Allel herausfallen. Allel-drop out und unsymmetrische Peakhöhe Artefakte sind beide häufig mit geringer Template-DNA-Proben beobachtet. Der STR-Profil von einer der verklumpten Biopartikel Proben aus dem Kragen ist in Figur 9 gezeigt. Eine vollständige STR Profil (30/30 Allele, Genauigkeit der erhaltenen Profile durch einen Vergleich mit einem Referenzprofil überprüft) wurde erhalten. Wie zuvor erwähnt, wird ein STR Profil nicht immer gewonneny Biopartikel gesammelt. Ein Beispiel für eine erfolglose DNA-Profiling eines einzelnen Biopartikel (3% Allel Erholung 30.1 Allele) ist in Abbildung 10 (Einzel Biopartikel) gezeigt. Während diese Einzel Biopartikel nicht erfolgreich war, wurden hochBeweis STR Profile der Spender der Biopartikel in dieser Probe aus anderen Biopartikel von der gleichen Probe gewonnen wurde. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, mehrere einzelne Zelle / Klumpen Kostproben aus dem gleichen Objekt.
Die entwickelten "intelligenten" Analyse für Touch-DNA-Beweise hier beschriebenen Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um Beweis Hand Profile Einzel erholen und "verklumpt" Biopartikeln aus verschiedenen berührte Gegenstände und Kleidungsstücke (zB Stuhl Armlehnen, Auto-Lenkräder, Handys, Kaffeetassen, Zigaretten, Kugelschreiber, Shirts, Shorts, und Pullover). Jedoch wichtiger ist, dieser Ansatz ist auch für den Nachweis und die Profilierung des männlichen d verwendet wurdenonor DNA (Single-Source) in simulierten Körperkontakt / Angriff Mischungsproben (zB Täter packte eines Opfers Handgelenk, Hals oder Kleidung, oder Kontakt mit Opfers Betten wie in sexuellen Übergriffen).
Abbildung 1: Herstellung von Gel-Folie Folien für Biopartikel Sammlung. (A) Die Weißrückschutzabdeckung wird unter Verwendung einer sterilen Pinzette aus dem Gelstück Film die Klebeschicht freizulegen. Das Gel-Film wird dann auf einen Glasobjektträger mit festem Druck eingehalten werden. (B) Wenn das Gel-Folienprobe ist bereit, für Biopartikel Sammlung verwendet werden, die obere klare Schutzfolie entfernt wird mit einer sterilen Pinzette.
Abbildung 2: Biopartikel Sammlung mit Gel-Folie aus verschiedenen Substraten. Die Gelfilmbildung Folien können verwendet werden, um Biopartikel aus einer Vielzahl von Oberflächen zu sammeln. Der Gel-Film wird in direkten Kontakt mit dem Gegenstand oder der interessierenden Oberfläche platziert. Ein leichter Druck ist erforderlich, um Biopartikel auf das Gel-Folienoberfläche übertragen aufgebracht. Sammlung von Biopartikeln von (A) getragen Kleidungsstücke (Mantelkragen), (B) berührt Objekte (Reisekaffeetasse) und (C) direkte menschliche Haut (männliche Handgelenk) werden angezeigt.
Abb. 3: Biopartikeln auf einem abgenutzten Kleidungsstück (Innenhosenbein) Biopartikeln sind Gel-Film durch direkten Kontakt mit der Objektoberfläche übertragen. Biopartikeln als "Klumpen" oder einzelne / Einzel Biopartikeln (mit roten Pfeilen gekennzeichnet) gefunden werden.
Abb. 4: Optional Färbung der Biopartikeln auf Gel-Folie Folien zur besseren Visualisierung von Biopartikeln können Gel-Folienproben mit Trypanblau-Färbung gefärbt werden. Die gesamte Oberfläche des Gel-Films wird durch Trypanblau (A) bedeckt. Nach 1-2 min der Färbung, der Schieber leicht geneigt, damit überschüssiges Flecken ablaufen den Schieber (B). Sanfte Überflutung mit sterilem Wasser (C) kann verwendet werden, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Nachdem der Objektträger an der Luft getrocknet, kann die Folie unter dem Mikroskop betrachtet werden, um die richtige Färbung (D, E) zu gewährleisten. Hinweis:. Nicht alle Biopartikeln wird gefärbt erscheinen (dh in der Farbe blau) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 5: Biopartikel Sammlung und Analyse. (A) Eine kleine Menge (oder "Ball") von wasserlöslichen Wellenlöten Band ("Kleber") wird an der Spitze einer Wolfram-Nadel durch vorsichtiges Schaben gesammelt. (B) Der Klebstoff wird dann gerührt, um die Gel- Filmoberfläche, um die Biopartikeln von Interesse zu sammeln. Einzelne oder mehrere Biopartikel mit einem einzigen Klebstoff Kugel gesammelt werden. (C) Wenn die gewünschten Biopartikel gesammelt worden sind, wird die Spitze der Nadel in Amplifikationsgemisch in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen gegeben. Die Nadel wird in der Flüssigkeit gehalten wird, bis es sich auflöst, und die Freisetzung von Biopartikeln in Lösung beobachtet. Alle Schritte in der Sammlung Prozess durchgeführt und unter dem Mikroskop betrachtet, um erfolgreich Biopartikel Sammlung und Übertragung zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine lar anzuzeigenger Version dieser Figur.
Fig. 6: Einzel Biopartikel in eine Hemdkragen Probe Biopartikel wurden unter Verwendung von Gel-Folie von der Innenseite eines Hemdkragens von einem männlichen Spenders getragen gewonnen. Die Biopartikeln wurden mit Trypanblau und Bilder von zwanzig verschiedenen in der Probe identifiziert einzelne Biopartikeln gezeigt gefärbt. In jedem Bild wird der Biopartikel, die gesammelt wurde eingekreist (rote Kreise anzeigt Biopartikel in dem ein Profil gewonnen wurde; schwarzen Kreisen anzeigt Biopartikel in dem ein Profil wurde nicht verwertet). Die prozentuale Allel Recovery (Anzahl der beobachteten Allele von möglichen 30) über dem Bild Biopartikel, aus dem ein Profil erholt zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 7: verklumpt Biopartikel in eine Hemdkragen Probe Biopartikel wurden unter Verwendung von Gel-Folie von der Innenseite eines Hemdkragens von einem männlichen Spenders getragen gewonnen.. Die Biopartikeln wurden mit Trypanblau und Bilder von zwanzig verschiedenen verklumpten Biopartikeln in der Probe identifiziert werden angezeigt gefärbt. In jedem Bild wird der Biopartikel, die gesammelt wurde eingekreist (rote Kreise anzeigt Biopartikel in dem ein Profil gewonnen wurde; schwarzen Kreisen anzeigt Biopartikel in dem ein Profil nicht erholte sich die Prozent-Allel Recovery (Anzahl der beobachteten Allele von möglichen 30). Für jede Biopartikel, aus dem ein Profil erholt zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 8: Autosomal STR-Profil aus einer Biopartikel von einem männlichen Hemdkragen erhalten eine autosomal STR-Profil wurde aus einem einzigen Biopartikel (links dargestellt) unter Verwendung von 5 ul der direkten Lyse / Amplifikationsreaktion.. Die Genauigkeit dieses Profil wurde durch Vergleich mit einem Spender Referenzprobe bestimmt. Fünfzehn autosomal STR-Loci und Amelogenin (Geschlechtsbestimmung) co-amplifiziert in einer einzigen Reaktion und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Die Ergebnisse sind hier als ein Elektropherogramm dargestellt. Allel Zahlen Bezeichnung unter jedem Peak bei jedem Locus. Die x-Achse repräsentiert Fragmentgröße (Basenpaare, bp) und die y-Achse die Signalintensität (RFU relativen Fluoreszenzeinheiten; unter jedem entsprechenden Allel Nummer zur Verfügung gestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
Abbildung 9: Autosomal STR-Profil von einem verklumpten Biopartikel von einem männlichen Hemdkragen erhalten eine autosomal STR-Profil wurde von einem verklumpten Biopartikel (links dargestellt) unter Verwendung von 5 ul der direkten Lyse / Amplifikationsreaktion.. Die Genauigkeit dieses Profil wurde durch Vergleich mit einem Spender Referenzprobe bestimmt. Fünfzehn autosomal STR-Loci und Amelogenin (Geschlechtsbestimmung) co-amplifiziert in einer einzigen Reaktion und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Die Ergebnisse sind hier als ein Elektropherogramm dargestellt. Allel Zahlen Bezeichnung unter jedem Peak bei jedem Locus. Die x-Achse stellt die Fragmentgrße (Basenpaare, bp) und die y-Achse die Signalintensität (RFU relativen Fluoreszenzeinheiten; unter jeder entsprechenden Allel Zahl bereitgestellt).pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 10: Beispiel für ein Versäumnis, eine autosomal STR-Profil von einem gesammelten Biopartikel erhalten erhalten Die links dargestellten Einzel Biopartikel wurde von einem Hemdkragen Gel-Folienprobe gesammelt. Wie aus der resultierenden STR Profil (rechts dargestellt) zu sehen ist, wurde nur ein Allel (von 30 möglichen) erhalten. Allel Zahlen Bezeichnung unter jedem Peak bei jedem Locus. Die x-Achse repräsentiert Fragmentgröße (Basenpaare, bp) und die y-Achse die Signalintensität (RFU relativen Fluoreszenzeinheiten; unter jedem entsprechenden Allel Nummer zur Verfügung gestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Discussion
Hier haben wir Methoden für die Sammlung und verbesserte genetische Analyse Biopartikeln von Touch DNA-Spuren wieder beschrieben. Der entwickelte Ansatz beinhaltet die folgenden: 1) Sammlung von biologischem Material (dh Biopartikeln) über Gel-Film aus berührte Gegenstände und Flächen, tragen Kleidungsstücke oder direkte menschliche Haut, 2) eine mikroskopische Untersuchung des gewonnenen biologischen Material zur Sammlung von potenziellen gewährleisten menschlichem biologischem Material, und 3) die Mikromanipulation einzelner oder weniger Biopartikel Verwendung eines wasserlöslichen Klebstoffs und 4) autosomal DNA-STR Profilierung der gesammelten Biopartikel mit einem Mikrovolumen (5 ul) einstufige Lyse / Amplifikationsreaktion. Die Verwendung von einem einstufigen geschlossenen Rohr Reaktion wird die Gefahr von Kontamination und Probenverlust weitere Probe Manipulationen oder Übertragung auf andere Reaktionsgefäße. Die verbesserte Ein-Schritt-Mikrovolumen (5 ul) Lyse / STR Amplifikationsreaktionen ermöglicht die Wiederherstellung der vollen oder probative STR Profile des Spenders einzelner oder weniger Biopartikel. Dieser Ansatz wurde entwickelt, um Hand STR Profile Single- und Multi-Source-Touch-DNA-Beweise (zB getragen Kleidungsstücken und andere Haushaltsgegenstände, berührt / behandelt Objekte und Oberflächen, Haut / Haut-Gemische) zu erhalten. Es hat erfolgreich für den Nachweis des männlichen Spenders in simulierten Körperverletzung Mischung Proben verwendet.
Diese Vorgehensweise könnte weiter in zusätzliche Körperflüssigkeit / Gewebemischung Szenarien wie ein Opfer kratzen seine / ihre Angreifer, in denen nur wenige Biopartikeln vom Angreifer würde bei einer überwältigenden Menge an biologischem Material von dem Opfer vorhanden sein ausgewertet werden. Zusätzlich wird, da dieser Ansatz in der aktuellen Studie entwickelt erlaubt die Analyse auf der Einzel Biopartikel Ebene könnte sie verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Natur und das Ausmaß der sekundären Übertragungs 14-19, bei dem ein Zwischenträgt ein DNA-Profil auf einem surfa gewinnence, Objekt oder eine Person auf eine andere Oberfläche Objekt oder eine Person 20. Ein Blind swabbing Ansatz zur Analyse der sekundären Übertragung möglicherweise nicht Spuren von Material aus der Sekundär Spender zu identifizieren. Das hier entwickelte Ansatz ermöglicht die Analyse einzelner oder weniger Biopartikel und somit werden die Ergebnisse nicht durch die Anwesenheit von einer überwältigenden Menge an biologischem Material von der primären Donor verwechselt. Die in dieser Arbeit entwickelte können auch Auswirkungen für die Analyse von Spuren biologisches Material in Fällen sexueller Gewalt Methoden wie diejenigen, die digitale Penetration der Vagina, wo positive Identifizierung von Spuren von Hautzellen vom Täter könnte ausschlaggebend sein, dass sexuelle Kontakte zu knüpfen auftrat.
Während die Sammlung von Biopartikeln von Gel-Folienprobe wird schwieriger und komplexer Manipulationen nicht um, gibt es kritische Schritte in diesem Verfahren, die mit großer Sorgfalt, um die so sicher, durchgeführt werden müssenccessful Übertragung Biopartikeln zum nachgeschalteten Reaktionsgefäß. Die Sammlung von Biopartikeln mit dem wasserlöslichen Klebstoff muss mikroskopisch betrachtet werden (dh Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung (~ 200-300X), um sicherzustellen, dass nur die Biopartikeln von Interesse gesammelt werden. Abhängig von der Größe des Klebers "Ball" verwendet wird, ist das Potenzial, um zusätzliche Umgebungsmaterial, das sowohl biologischen und nicht-biologischen Material (zB Fasern, andere Fremdkörper) enthalten kann, zu sammeln. Die Sammlung kann unbeabsichtigte zusätzliche Biopartikeln bei der Verwertung von beigemischten DNA-Profilen führen. Die Sammlung von nicht-biologischem Material Inhibitoren können in den Mikrovolumen Lyse einzuführen / STR Reaktionen. Wenn mehrere Biopartikel werden mit dem gleichen Klebstoff "Kugel" gesammelt werden, gibt es ein Potential für die zuvor gesammelte Biopartikel zu ungebunden vom Klebstoff zu werden. Dies ist nicht häufig beobachtet, können aber auftreten, wenn eine größere Anzahl von bioparticles werden gesammelt (zum Beispiel mehr als 50) mit einem einzigen Klebstoff "Ball". Wenn eine große Anzahl von Biopartikeln sind gezielte, wird empfohlen, dass mehrere Sammlungen von weniger Biopartikel gemacht werden, aber alle in den gleichen 0,2 ml Röhrchen überführt. Sobald Biopartikel gesammelt wurden, muß Sorgfalt während der Entfernung der Gelfilmbildung Folie aus der Objekttisch und der Platzierung der 0,2-ml-Röhrchen, so dass die Spitze der Nadel nicht gestört wird genommen werden. Während der Platzierung der Spitze der Nadel in das Amplifikationsgemisch am Boden der 0,2 ml-Röhrchen, sollte die Spitze der Nadel nicht in Kontakt mit den Seiten der Röhre zu machen, um den Verlust von Material an den Seiten der Röhre zu vermeiden. Während der Solubilisierung des Klebstoffs liegt typischerweise schnell (~ 30 s oder weniger in Abhängigkeit von der Größe der Klebe "Kugel") und kann während der mikroskopischen Prüfung geprüft wird, sollte die Spitze der Nadel langsam von der Amplifikationsgemisch entfernt werden, um sicherzustellen, daß eine vollständige Solubilisierungdes Klebstoffes erreicht wurde. Wenn der Klebstoff noch nicht vollständig gelöst ist, kann die Nadel in die Flüssigkeit zurückgeführt werden, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen.
Die hier beschriebenen Protokolle wurden für die Verwendung mit Biopartikeln und menschlichen Zellen aus forensischen biologischen Spuren optimiert. Der Lysepuffer ausgewählt ist mit der ausgewählten DNA-STR Amplifikationskit kompatibel. Zwar gibt es geeignete Alternative Lysepuffern zu können, muss ihre Effizienz im Hinblick auf die Zell-Lyse und die Kompatibilität mit Downstream-Analyse vom Anwender überprüft werden. Darüber hinaus haben die in diesem Protokoll beschriebenen STR Amplifikationskit und Amplifikationszyklus Nummer für die Verwendung mit einzelnen oder wenigen Biopartikeln optimiert. Eine neue Generation STR Amplification Kit mit berichteten erhöhte Robustheit und Sensitivität ausgewählt und wurde gezeigt, dass bei der Rückgewinnung von hochwertigen STR Profile einzelner oder weniger Biopartikeln führen. Während zahlreiche andere STR-Kits, mit unterschiedlichen empfohlen amplifiKation Zyklenzahlen, zur Verfügung stehen, können sie nicht geeignet Empfindlichkeit besitzen und deshalb müssen richtig vor der Verwendung in dieser Protokolle ausgewertet werden.
Trotz der erfolgreichen Anwendung der beschriebenen Methoden für die Wiederherstellung STR-Profile von einzelnen oder wenigen Biopartikeln, wird die Erfolgsrate der Profilrückgewinnung nicht 100% sein. Daher wird für einige Proben eine begrenzte DNA-Teilprofil oder kein Profil beobachtet werden. Dies kann wegen der Unfähigkeit, abschließend visuell identifizieren meisten Biopartikeln wie Zellmaterial vermieden werden, wird das Potential beeinträchtigten Zustand des Kernmaterials in den gesammelten Biopartikel oder Verlust von Probenmaterial aus dem Klebstoff vor der Übertragung in das Reaktionsgefäß. Daher ist die Analyse eines einzelnen Biopartikel Probe für jede Note DNA Artikel nicht empfohlen. Wir sammeln häufig 20 Sample-Sets von einem einzelnen Gel-Folienprobe und zusätzliche Sample-Sets zu sammeln, wie gebraucht, wenn ein geeignetes STR-Profil wird nicht erhalten. Ter einzige Einschränkung für die Sammlung ist die Menge an biologischem Material auf dem Gel-Folienprobe (und wahrscheinlich die Kosten für die Analyse vorhanden, obwohl die Mikrovolumen Reaktionen bieten die Möglichkeit, zusätzliche Proben für eine ähnliche oder geringere Kosten als ein einziges Standard-Reaktionsvolumen zu sammeln ( beispielsweise 25 & mgr; l).
Die entwickelten DNA-Profiling Methoden beschreiben hier einen molekularen Ansatz für die Charakterisierung, Analyse und Interpretation der Spuren biologisches Material von Touch-DNA-Proben gewonnen. Allerdings gibt es zusätzliche genetische Information, die aus den gewonnenen Biopartikel neben Bestimmung der Spender (dh STR Profil) des Spenders von dem biologischen Material gewonnen werden kann. Das Gewebe oder Körperflüssigkeit Ursprungsquelle (zB der Haut gegenüber Speichel) können vorsehen, wichtige Kontextinformationen zu einer strafrechtlichen Untersuchung. Ohne eine solche Bestimmung kann die Mehrdeutigkeit der Gewebequelle Herkunfts Explo werdenITED als alternative Umstände des Verbrechens (zB, wie der Körper Flüssigkeit abgelagert worden sein) könnte vorgeschlagen werden. Die hier beschriebenen Biopartikel Sammlung und Trennung Protokolle könnten verwendet werden, um Biopartikel oder anderen Zellen (zB bukkal, vaginal) zur Verwendung in einem Gewebequellenidentifikation (mRNA Profilierungs 21-30) Strategie, die Mikrovolumen reverse Transkription (RT) umfasst sammeln und Amplifikationsreaktionen. Mit weiteren Optimierung kann es auch möglich sein, ein DNA / RNA co-Isolationsstrategie, um Zelltyp-Erkennung (RNA) und STR Profilierung aus der gleichen Probe, einschließlich Biopartikel von Berührungs DNA Nachweis gestatten zu entwickeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
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