Summary
Burada mevcut olan biyo-parçacıkların toplanması için, optimize edilmiş ve etkin bir temizleme stratejisi tarif tek-aşamalı bir 5 ul mikro hacim liziz / STR amplifikasyon içeren geliştirilmiş bir amplifikasyon protokolü ile birlikte numune 'DNA dokunun', bir geri kazanıma müsaade etmek kısa tandem tekrarı (STR) biyo-parçacık verici (ler) profilleri.
Abstract
DNA profilleri, insan biyolojik materyalin mikroskopik izlerini oluşur 'dokunmatik DNA' delil, elde edilebilir. Iz DNA istihdam pamuklu ya da yapışkan bant kurtarma için mevcut yöntemler ilgi alanı örnek. Ancak, bu tür bir 'kör-alma, temizleme' yaklaşımı birlikte örnek olacak hücresel materyal, farklı bireylerden, bireylerin hücreleri öğe üzerinde coğrafi farklı konumlarda bulunan bile. Bu durumda, tarama DNA örnekleri karşılaşılan bir DNA karışımların bazı yapay kendisi sürme ile oluşturulur. Bazı durumlarda, bir kurbanın DNA'sı, böylece herhangi bir potansiyel failin DNA maskeleme anlamlı fazla bulunabilir.
Standart kurtarma ve analiz yöntemleri ile zorlukları aşmak için, biz dokunmatik DNA kanıtları gelişmiş genetik analiz sonuçları düşük maliyet, 'akıllı analiz' yöntemi geliştirdik. Biz optimize edilmiş tarifDokunmatik DNA örneklerinde, bu biyo-parçacıkların toplanması ve aynı zamanda biyo-parçacık vericiden STR kurtarma izin vermek için, bir aşamalı bir 5 ul microvolume lizis / STR amplifikasyon içeren gelişmiş bir yükseltme stratejisi d etkili mikromanipulasyon kurtarma stratejisi (ler). kullanımı, bireysel ya da birkaç (yani, "kümeleri") tek kaynak profilleri elde etmek yeteneği bioparticles sonuçları. Bu prosedürler izolasyon ve adli dokunmatik DNA kanıtları gelen tek bioparticles analizi için alternatif gelişmiş teknikler temsil eder. Her adli soruşturmada gerekli olmasa da, yöntem standart analiz teknikleri kullanılarak mümkün olmayabilir fiziksel saldırı (örn, boğulma) içeren durumlarda tek bir kaynak failin DNA profilinin kurtarma için çok faydalı olabilir. Ayrıca, burada geliştirilen stratejiler o çeşitli tek hücre düzeyinde genetik bilgiyi elde etmek için bir fırsat sunuyoruzther olmayan adli iz biyolojik materyal.
Introduction
Dokunmatik DNA hücresel materyalin doğrudan transferi iz biyolojik delillerin bir şeklidir fiziksel temas sırasında 1 bir nesne ya da başka bir kişiye bir kişiden (örn, cilt hücrelerini döken). dokundu nesnelerin çeşitli DNA profilleri elde yeteneği (belgeler, yatak, ayakkabı, ateşli silahlar, içme kapları, kalem, çanta kolları) literatürde 2-9 bildirilmiştir.
Dokunmatik DNA kanıtları analizinde kritik bir faktör iz biyolojik madde mevcut başarılı kurtarma. DNA kanıtları genellikle steril bir pamuklu bir bez ile şüpheli bölgeyi sürüntü ile toplanır dokunun ("kör-svapları" olarak anılacaktır). Bu yaklaşımı kullanarak, toplanan biyolojik maddenin doğası bilinmemektedir ve genelleştirilmiş bir alan örnekleme yapılır. Yüzey oluklar veya yarıklar varlığı bi genellikle zaten az miktarda başarılı kurtarma engelleyebilirological malzeme mevcut. Ayrıca, bir 'kör-alma, temizleme' yaklaşımı olacak hücreler öğe üzerinde mevcut, bireylerin hücreleri öğe üzerinde mekansal farklı konumlarda bulunan bile farklı bireylerden mutlaka ortak örnek hücresel materyal. genellikle düşük şablon DNA örnekleri ile özellikle çözmek için zorlu olan karıştırılmış DNA profilleri, kurtarma, sık sık 8,10,11 görülmektedir ve birçok durumda alma, temizleme işleminin kendisi bir netice eserdir olacaktır. Malzemenin sadece küçük bir miktar vericilerden birinden mevcut ise, standart ekstre etme ve analiz teknikleri küçük katkı bir profil kurtarmak için başarısız olabilir. Buna ek olarak, kuru ya da ıslak kullanılmış ya da ister çubukla tipi bağlı bir emme kapasitesine ve emme kapasitesinin ve biyolojik malzemenin 12 salım etkinliğindeki farklılıkları için toplanan biyolojik maddenin miktarını etkileyebilir (steril su ile önceden ıslatılmış). Standard ekstraksiyon yöntemleri, numune ya da örnek aktarımı adımları için gerekli fiziksel manipülasyonu için ek örnek kaybına neden olabilir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, biyolojik maddenin geri kazanılması için basit bir swab teknikleri nedeniyle ayrı biyolojik bileşenleri ayırmak için bir hata için biyolojik örnek olarak karıştırılmış profillerin bir artış meydana eser miktarlarda kaybına neden olabilir. Bu nedenle, biz dokundu nesneler üzerinde bulunan hücresel mikro parçacıkların toplanması için daha seçici ve etkin kurtarma stratejileri geliştirmeye çalıştılar. Dokunmatik DNA kanıtları biyolojik materyalin analizi için geliştirilen strateji (nedeniyle cildin dış epidermal tabakasında bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu ölü veya ölmekte olduğundan bir çekirdek her zaman görünür olmadığı gerçeği "bioparticles" olarak anılacaktır Jel film fr yoluyla biyolojik materyal (yani, bioparticles) 1) toplama: Aşağıdaki) 13 keratinositler içerirom suda çözünür bir yapıştırıcı kullanarak nesneleri ve yüzeyleri, yıpranmış giyim öğeleri veya doğrudan insan derisi, potansiyel insan biyolojik materyalin toplanmasını sağlamak kurtarıldı biyolojik maddenin 2) mikroskobik inceleme, tek veya birkaç biyo-parçacıkların 3) mikromanipulasyon dokundu, ve Bir mikrohacim (5 ul), tek aşamalı bir lizis / amplifikasyon reaksiyonu kullanılarak toplanmıştır biyo-parçacıkların 4), otozomal DNA STR profil.
Bu prosedür geleneksel olarak kullanılan analiz yöntemleri üzerinde çok sayıda avantaj sunuyor. Jel film kullanılarak bioparticles geri kazanımı analiz öncesi numune içinde biyolojik madde mevcut mikroskobik muayene izin verir. Dokunmatik DNA kanıtları elde bioparticles bir çoğunluğu çekirdekli hücreler daha zor ya da biyo-parçacıklar seçilmelidir kaç, analiz fırsatı sağlar önce bu örneklerin mikroskobik incelemesinde çekirdekli hücreler için arama belirlemek için yapım olmayabilir Bu şekilde maximizDNA profili kurtarma olasılığını ing. suda çözünür yapışkan destekli Mikromanipülasyondan kullanarak bioparticles toplama reaksiyon tüpleri içine hedeflenen bioparticles doğrudan transferine izin verir. Bu prosedür, biyolojik materyalin başarılı transferini sağlamak için mikroskop altında görüntülenmiştir. örnek başına analiz maliyetini azaltan azaltılmış ya da microvolume Reaksiyon duyarlılığını arttırır. Bu kanıt, bir bireysel parça örneklerinin artan sayıda analiz edilmesini sağlar. Nedeniyle dokunmatik DNA kanıtları biyo-parçacıkların genetik devlet aralığı, ürüne birden fazla örnekleme tavsiye edilir.
Burada, biz dokunmatik DNA kanıtları biyolojik materyalin donörlerin yüksek ispatlayıcı genetik profilleri elde etmek için geliştirilen protokoller başarılı kullanımını göstermektedir. geliştirilen bioparticle toplama ve DNA profilleme yöntemleri kapsamlı bir 'akıllı' (yani, belirli, ölçülebilir, Atta sağlamakkarakterizasyonu, analiz ve iz biyolojik maddenin yorumlanması, inable gerçekçi ve zamanında) moleküler temelli yaklaşım. Başlangıçta dokunmatik DNA kanıtları adli analiz uygulaması için geliştirilmiş olsa da, burada geliştirilen stratejiler biyolojik maddenin diğer kaynaklardan uygulanan ve tek hücre düzeyinde bireysel tanımlama bilgilerini elde etmek için bir fırsat sunuyoruz olabilir.
Protocol
NOT: Vücut sıvıları Merkez Florida'nın Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürleri kullanarak gönüllülerden toplanmıştır. Bilgilendirilmiş yazılı onay her vericiden elde edilmiştir.
Dokundu Nesneler ve Yüzeyler gelen Bioparticles 1. Koleksiyonu
- İstenilen boyuta jel filmi kesin. Katı destek olarak kullanılan cam mikroskop lamı için uygun boyutta olduğundan emin olun. Örneğin, 3 "x 1" cam slayt için, 2 "x 0.75" bir jel film boyutunu kullanın.
Not: uzunluk ve malzemenin genişlik arzu edildiği takdirde, daha az olabilir, fakat bu boyut aşmamalıdır. - Jel-film beyaz desteğini çıkarın ve mikroskop lamı (Şekil 1A) jel-filmi takın. Tam bir eki sağlamak için sıkıca bastırın.
NOT: Basınç jel fil parçasının boyunca uygulanacak izin çıkarılmamalıdır berrak üst koruyucu tabaka vardırJel-film yüzeyine kirletmeden m. Gerekli olana kadar (bağlı koruyucu bir tabaka ile) hazırlanmıştır jel film slaytlar, oda sıcaklığında saklanabilir. - Hazır (Şekil 1B) jel film örneği kullanmak için zaman steril cımbız kullanarak jel film net üst koruyucu filmi çıkarın. İstenen temas nesne ya da yüzeye (Şekil 2) ile doğrudan temas halinde jel film yüzeyine yerleştirin. Jel filme biyo-partiküllerin randımanlı bir şekilde aktarımı için küçük bir baskı miktarı uygulanır.
NOT: Çok fazla basınç uygulandığında ise, cam slayt kırabilir.
NOT: Aynı nesne veya yüzeyden Çoklu örnekleme jel-film aynı parça üzerine toplanabilir. - Bir stereomikroskop slaydı yerleştirerek (Şekil 3) jel film üzerine biyo-partiküllerinin transferini teyit (trans veya epi-aydınlatma kullanılabilir). En iyi vi için ~ 200X kullanımı jel filmin en görüntüleme geniş alanlar için ~ 20X büyütme ve büyütmeEwing bireysel biyo-parçacıklar.
- Kapalı bir slayt kutu içinde oda sıcaklığında jel film numunesi slayt saklayın veya ve / veya biyo-parçacık toplama boyama için hemen kullanılır.
Görselleştirme Yardım Bioparticles 2. İsteğe bağlı Boyama
- Bir lavabonun üzerinde bir slayt-boyama raf üzerine Adım 1 hazırlanan jel film örneği slayt yerleştirin.
- Tek kullanımlık bir aktarım pipeti kullanarak, tripan mavi boyama (Şekil 4A) ile tüm jel film yüzeyini kapsamaktadır. 1-2 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Leke lavabo (Şekil 4B) içine kapalı drenaj sağlamak için slayt eğerek aşırı leke çıkarın.
NOT: (Şekil 4C), gerekirse kaydırma tek kullanımlık bir aktarım pipet kullanılarak steril su ile hafif bir taşma ile durulanır. - Biyo-parçacıkların izole geçmeden önce hava içinde kurumaya slayt izin verir. V ~ bir genel görüntüleme için stereomikroskopta (~ 20X ve kullanma 200-300X slayt görüntüleiew bireysel bioparticles) uygun boyama (Şekil 4D-E) sağlamak.
NOT: slayt kapalı sürgü kutusunda oda sıcaklığında saklanabilir.
Analiz için İlgi Bioparticles 3. İzolasyonu
- Bir rafa 0.2 ml PCR tüplerine uygun sayıda koyun ve uygun tüpleri etiket.
- Belirlenmiş bir PCR amplifikasyon kaput veya biyogüvenlik kabini STR amplifikasyon karışımı (Malzeme listesi bakınız) hazırlayın. Vortex ana karışımı iyi ve kısaca mini-santrifüj santrifüj.
- Her numune için gereken amplifikasyon karışımı hacmi 3,5 ul; Numunelerin istenilen sayıda ana karışımı uygun bir hacmi hazırlamak.
- Her 0.2 ml tüp içine amplifikasyon karışımı Pipetleyin 3.5 ul. Gevşek, her tüp kap.
- Temiz bir cam mikroskop lamı üzerine veya doğrudan bir cam bloğu üzerine çift sopa bant bir parça yerleştirin.
Not: Bu tutmak için kullanılacakÖrnek toplama sırasında yerinde 0.2 ml tüp. - Temiz bir cam mikroskop lamı üzerine çift sopa bant bir parça yerleştirin. Çift sopa bant üstünde suda çözünür dalga lehim bant bir parça yerleştirin.
NOT: Bu kaydırma ileride kullanılmak üzere bir desikatör içinde saklanabilir. - Adım 3.4 hazırlanan çift sopa bant slayt veya blok üzerine ilk 0.2 ml tüp yerleştirin. Örnek toplanana kadar bir kenara, bu tüp ayarlayın.
- Mikroskop (düşük büyütme) altında suda çözünür dalga lehim bant slayt yerleştirin. Tungstenli bir iğne ucuyla hafifçe küçük bir miktarda (ya da "topu"), bir iğne (Şekil 5A) sonunda yapışkan toplanması amacıyla bant yüzeyinde kazıyın.
NOT: top boyutu elde edilecek bioparticles sayısına bağlı olarak, küçük ya da büyük yapılabilir. - Dikkatle iğne ucu bozmadan mikroskop altında yapışkan ile tungsten iğne çıkarın. İğne canNumune yerleştirme sırasında istenirse rafa yer olabilir.
- Mikroskop sahnede hazırlanan jel film (Adımlar 1 ve 2) örnek yerleştirin. Bioparticles kolayca görülebilir kadar odağı ve büyütme ayarlayın. Tahsil edilecek biyo-parçacıkları tanımlamak.
NOT: Bir cam blok gerekirse slayt desteklemek için kullanılabilir. - Yapışkan top ile tungsten iğne almak ve ilgi biyo-parçacıklar bulunduğu jel film yüzeyi üzerinde iğne yerleştirin. Bu biyo-parçacık (Şekil 5B) ile temas halinde olduğu, böylece aşağı doğru (yapışkan) iğne ucu basın. Biyo-parçacık toplanmıştır emin olmak için iğne yukarı kaldırın. Biyo-parçacıkların istenen sayıda toplanmış kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Mikroskop sahnede hazırlanan 0.2 ml PCR tüpü yerleştirin. Amplifikasyon karışımını içeren tüp alt odak şekilde büyütme ayarlayın.
- Dikkatle tungsten needl eklemekiğne ucu kadar 0.2 ml PCR tüpüne e yükseltme karışımı olduğunu.
NOT: mikroskop aracılığıyla izlerken Bu en iyi yapılır. - Yapışkan çözünür ve bioparticles solüsyonu (Şekil 5C) salınan kadar amplifikasyon karışımı iğne tutun. , Iğne çıkarın dik 0.2 ml yerleştirin ve gevşek tüp kap.
- Ek örnekler için toplama işlemini tekrarlayın. Numuneler arasında mendil önceden ıslatılmış alkol (izopropanol) tungsten iğne temizleyin.
4. Kombine Microvolume Nükleik Asit İzolasyon (Doğrudan Lizis) ve Otozomal Kısa Tandem Tekrar (STR) Profil
- Belirlenmiş bir PCR amplifikasyon kaput veya biyogüvenlik kabini lizis tamponu (Malzemeler bakınız) hazırlayın. 5 ul toplam reaksiyon hacmi için, her bir tüpe lisis tamponu 1.5 ul ekleyin. Sıkıca kapatın tüp kapakları.
NOT: 0.2 ml tüpler zaten 3.5 ul ihtivaamplifikasyon karışımı ve Adım 3 toplama biyo-parçacıklar. - Talep termal döngüleyici içinde örnekleri aşağıdaki döngü koşulları kullanılarak örnekleri amplifiye: 15 dakika boyunca 75 ° C; 11 dakika boyunca 95 ° C; 20 saniye ve 3 dakika için 59 ° C, 94 ° C 34 döngü; 10 dakika boyunca 60 ° C; ve 4 ° C tutun.
- Kısa süreli depolama için 4 ° C'de saklayın büyütme ürünleri.
5. Ürün Tespiti - Kapiler Elektroforez (CE)
- 96 plaka olarak, (bkz Malzemeler, 9.7 ul deiyonize formamid ve 0.3 ul boyutu standart) CE çalışan karışımı 10 ul ekleyin. Her bir oyuğa, amplifiye edilen ürünün ya da allelik merdivenin 1 ul ekle.
DİKKAT: Formamid potansiyel mutajen ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek bir kimyasal kaputu ele alınmalıdır. - Amplifikasyon kiti manuel veya internall üretici tarafından belirtilen elektroforetik koşulları kullanıny koşulları valide.
- STR analizi yazılımı ile ham verileri analiz.
Representative Results
Bir erkek vericiden tarafından giyilen bir gömlek yakası (% 100 polyester) den elde edildi, bireysel ve topaklanmış bioparticles temsili görüntüsü, Şekil 6 (özel bioparticles) ve Şekil 7 (topaklaşmamış bioparticles) gösterilmiştir. bioparticles burada açıklanan protokol kullanılarak gömlek yaka elde edildi: tripan mavisi, tungsten iğne ve suda çözünür yapıştırıcı kullanılarak bioparticle örneklerinin toplanması ile kurtarılan bioparticles doğrudan temas, boyama yoluyla jel-film gömlek yaka bioparticles transferi ve 5 ul mikro hacim liziz / STR amplifikasyonu kullanılarak. STR analizi 6 ve 7, bir tek tarama DNA ürünün (20 tek / bireysel bioparticles 20 topaklaşan bioparticles) analiz edilecek bioparticles tipik bir örnekleme sunmaktadırlar. Her bir görüntü toplanan bioparticle (ler) i (mikron olarak) uzunluk ve genişlik ölçümleri ile etiketlenir. percToplanan bioparticle (ler) in her biri elde STR allel oranı olarak ifade edilir kanıt bu tür bioparticles elde edilmesi beklenebilir başarı değişken derecelerde göstermek için, her bir görüntü sağlanır. Şekil 6 ve 7'de görüldüğü gibi, dokunmatik DNA örnekleri elde bioparticles, büyük oranda ölü veya ölmekte olan keratinositler ve bu nedenle ispat STR profili toplanan her bioparticle elde edilmemektedir bulunmaktadır. Bu gömlek yakası örnek, STR bireysel bioparticles arasında 14/20 (% 70) elde edildi ve 15/20 (% 75) bioparticles topaklanmış edildi. Ancak, kazanılan profillerin her ispatlayıcı değer aralıkları: clumped bioparticle profilleri için bireysel bioparticles profilleri ve 3-100% alel kurtarma için 3-97% alel kurtarma. Nedeniyle başarı oranları değişkenlik, her dokunmatik DNA kalemi sayısız bioparticles toplanması tavsiye edilir. Bu son derece probati elde daha iyi bir şans sağlarSTR profili ettik.
Gömlek yakası tek tek bioparticle örneklerinden birine elde edilen STR profili, Şekil 8'de gösterilmiştir (profil kaynaklandığı bioparticle sola gösterilir). Neredeyse bir tam STR profili (28, 30 allel dışında, bir lokusu, bir referans profiline kıyasla tarafından doğrulanmadı edilen profilin doğruluğunu terk) bu bireysel bioparticle elde edilmiştir. Elde edilen profil makul dengeli arası odağı pik yükseklikleri ile yüksek kalitede ve hiçbir alel bırakma. Alelik terk ve dengesiz tepe yüksekliği eserler hem sık sık düşük şablon DNA örnekleri ile gözlenir. Gömlek yakası gelen topaklaşan bioparticle örneklerinden birine elde edilen STR profili, Şekil 9'da gösterilmiştir. Elde edildi tam STR profilini (30/30 alelleri, bir referans profili ile kıyaslanarak doğrulanmıştır edilen profilin doğruluk). Daha önce belirtildiği gibi, bir STR profili hiç elde edilmezy bioparticle topladı. Tek bioparticle (% 3 alel kurtarma, 30/01 allelleri) başarısız DNA profil örneği, Şekil 10 (özel bioparticle) 'de gösterilmiştir. Bu tek tek bioparticle başarılı değildi, bu örnekteki bioparticles donörünün yüksek ispat STR aynı numune elde diğer bioparticles elde edilmiştir. Bu aynı nesneden birden tek hücre / yığın demonstrasyonların gerçekleştirmek için ihtiyaç göstermektedir.
Dokunmatik DNA kanıtları burada anlatılan geliştirilen "akıllı" analiz yöntemleri tek gelen ispatlayıcı tek kaynak profilleri kurtarmak için başarıyla kullanılmıştır ve çeşitli dan "kümesinin" bioparticles nesneler ve giyim öğeleri (örneğin, sandalye kol dayama, araba direksiyon simitleri, cep telefonları dokundu kahve fincanları, sigara, kalem, gömlek, şort, kazak ve). Ancak daha da önemlisi, bu yaklaşım, aynı zamanda, erkek d saptanması ve profil kullanılmaktadırsimüle fiziksel temas / saldırı karışımı örneklerinde onor DNA (tek kaynak) (örn, cinsel saldırı gibi kurbanın yatak ile bir kurbanın bilek, boyun ya da giysi, ya da kişiyi kapma fail).
Şekil 1: bioparticle toplama jel film slaytlar hazırlanması. (A) beyaz arka koruyucu kapak yapışkan destek maruz jel filmin parça steril cımbız kullanarak kaldırılır. Jel-Film daha sonra firma basınç cam mikroskop lamı yapıştırılır. (B) jel film örneği, üst şeffaf koruyucu film steril bir cımbız kullanılarak kaldırılır bioparticle toplanması için kullanılacak hazır olduğunda.
Şekil 2: jel kullanılarak Bioparticle toplamaÇeşitli alt tabakalardan -film. jel film kayar yüzeylerin çeşitli bioparticles toplamak için kullanılabilir. Jel film ilgi konusu nesne ya yüzeyi ile doğrudan temas halinde yerleştirilir. Yumuşak bir baskı jel film yüzeyi üzerine bioparticles transfer etmek için uygulanır. (A) yıpranmış giyim öğeleri (ceket yaka), (B) bioparticles toplanması gösterilmiştir (seyahat kahve fincanı), ve (C) doğrudan insan derisi (erkek bilek) nesneler dokundu.
Şekil 3:. Bioparticles (pantolon bacak içi) bir yıpranmış giysiler öğe üzerinde Bioparticles nesne yüzeyi ile doğrudan temas yoluyla jel film aktarılır. Bioparticles "kümeleri" veya (kırmızı oklarla gösterilen) Bireysel / tek bioparticles olarak bulunabilir.
Şekil 4:. Jel film slaytlar üzerinde bioparticles Opsiyonel boyama bioparticles daha iyi görselleştirme için, jel film örnekleri tripan mavisi boyası ile boyanmış olabilir. Jel-filmin tüm yüzeyi tripan mavisi (A) kaplıdır. lekelenme 1-2 dakika sonra, slayt yavaşça aşırı leke slayt (B) kapalı çalışmasına izin vermek için eğilir. Steril su (C) nazik sel Boya fazlasını uzaklaştırmak için de kullanılabilir. Slayt havayla kurutulur sonra, lam uygun lekeleme (D, E) sağlanması için bir mikroskop altında bakıldığında edilebilir. Not:. Tüm bioparticles (renk yani mavi) lekeli görünür , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAD / 52.612 / 52612fig5.jpg "/>
Şekil 5: Bioparticle toplama ve analizi. Suda çözünen dalga lehim bant (A) Az miktarda (ya da "top") ("yapışkan") nazik kazıma tarafından bir tungsten iğne ucu üzerine toplanır. (B) yapıştırıcı Jel- için dokunulduğunda Çevrede bioparticles toplamak için film yüzeyi. Bireysel ya da birden fazla bioparticles tek yapışkan top ile toplanabilir. (C) arzu edilen bioparticles toplanmıştır sonra, iğnenin ucunun bir 0.2 mi PCR tüpü amplifikasyon karışımı içine yerleştirilir. eriyene kadar iğne sıvı içinde tutulur ve çözelti içine bioparticles salınması görülmektedir. Toplama sürecinde tüm adımlar başarılı bioparticle toplama ve transferi sağlamak için yapılan ve mikroskop altında incelendi. LAR görüntülemek için buraya tıklayınızBu rakamın ger versiyonu.
Şekil 6:., Bir gömlek yakası numunesinde bireysel bioparticles Bioparticles bir erkek vericiden tarafından giyilen bir gömlek yakası içinden jel film kullanarak elde edildi. bioparticles gösterilmiştir tripan mavisi ve numune içinde tespit yirmi farklı bireysel bioparticles görüntüleri ile boyandı. Her görüntüde, toplandı bioparticle (; bir profil kurtarıldı değildi hangi bioparticles gösteren siyah daireler bir profil kurtarıldı edildiği bioparticles gösteren kırmızı daireler) daire edilir. Yüzde alel kurtarma (olası bir 30 dışarı gözlenen allel sayısı) bir profil elde edildi hangi bioparticle imajı üzerinde gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: Bir gömlek yakası örneğinde topaklaşan bioparticles Bioparticles bir erkek vericiden tarafından giyilen bir gömlek yakası içinden jel film kullanarak elde edildi.. bioparticles gösterilir tripan mavisi ve numunede tespit yirmi farklı topaklaşan bioparticles görüntüleri kullanılarak boyandı. . Bir profil olası 30 üzerinden yüzde alel kurtarma (gözlenen allel sayısı) değil kurtarıldı edildiği bioparticles gösteren siyah daireler, her görüntüde, toplandı bioparticle bir profil kurtarıldı edildiği bioparticles gösteren (kırmızı daireler daire edilir Bir profil kurtarıldı hangi her bioparticle için gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: bir erkek gömlek yakası tek bioparticle elde Otozomal STR profili otozomal STR profili 5 ul doğrudan parçalama / amplifikasyon reaksiyonu (solda gösterilen) tek bioparticle elde edilmiştir.. Bu profil doğruluğu verici bir referans numunesi ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Onbeş otozomal STR lokus ve amelogenin (cinsiyet tespiti) birlikte büyütülmüş tek bir reaksiyonda ve kapiler elektroforez ile ayrılır. Sonuçlar bir electropherogram olarak burada görüntülenir. Alel sayıları her lokustaki her tepe altındaki atama vardır. x ekseni fragmanı boyutu (baz çifti, bp) ve y-ekseni temsil sinyal yoğunluğu temsil eder. (RFU nispi floresan üniteleri; her gelen alel numarası altında sağlanan) daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.
Şekil 9: bir erkek gömlek yakası bir topaklaşan bioparticle elde Otozomal STR profili otozomal STR profili 5 ul doğrudan parçalama / amplifikasyon reaksiyonu (solda gösterilen) bir topaklaşan bioparticle elde edilmiştir.. Bu profil doğruluğu verici bir referans numunesi ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Onbeş otozomal STR lokus ve amelogenin (cinsiyet tespiti) birlikte büyütülmüş tek bir reaksiyonda ve kapiler elektroforez ile ayrılır. Sonuçlar bir electropherogram olarak burada görüntülenir. Alel sayıları her lokustaki her tepe altındaki atama vardır. (; her gelen alel numarası altında sağlanan RFU göreli floresan birimleri) x ekseni sinyal yoğunluğunu temsil fragmanı boyutu (baz çifti, bp) ve y-ekseni temsil eder.pg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 10: a. Toplanan bioparticle elde otozomal STR profilini elde etmek için bir hata Örnek solda gösterilen tek tek bioparticle bir gömlek yakası jel film numunesi toplanmıştır. (Sağda gösterilen) elde edilen STR profilinden görülebileceği gibi, (mümkün olan 30 üzerinden), sadece bir alel elde edildi. Alel sayıları her lokustaki her tepe altındaki atama vardır. x ekseni sinyal yoğunluğunu temsil fragmanı boyutu (baz çifti, bp) ve y-ekseni temsil eder. (RFU nispi floresan üniteleri; her gelen alel numarası altında sağlanan) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada toplama ve dokunmatik DNA kanıtları elde bioparticles gelişmiş genetik analiz için yöntemler tarif etmişlerdir. dokundu nesneler ve yüzeyler, yıpranmış giysiler öğeleri veya doğrudan insan derisinden jel film aracılığıyla biyolojik materyal (yani, bioparticles) 1) koleksiyon, geri kazanılmış biyolojik materyalin 2) mikroskobik inceleme potansiyeli toplanmasını sağlamak için: geliştirilen yaklaşım aşağıdaki içerir insan biyolojik madde ve suda çözünür bir yapışkan kullanılarak bir veya birkaç bioparticles 3) mikro manipülasyon ve mikrohacim (5 ul), tek aşamalı bir lizis / amplifikasyon reaksiyonu kullanılarak toplanmıştır bioparticles 4), otozomal DNA STR profil. tek-aşamalı bir kapalı tüp reaksiyon kullanımı ek örnek manipülasyon ya da diğer reaksiyon tüplerine transfer kontaminasyonu ve örnek kaybı için potansiyeli azaltmaktadır. geliştirilmiş tek aşamalı microvolume (5 ul) lizis / STR amplifikasyon reaksiyonları tam ya da probativ ve geri kazanımına olanake STR tek veya birkaç bioparticles bir donörün profilleri. Bu yaklaşım, tek ve çoklu-dokunmatik kaynak DNA kanıtları (örneğin, yıpranmış giysiler öğeleri ve diğer ev eşyaları, dokundu / ele nesneler ve yüzeyler, cilt / deri karışımları) den tek kaynak STR profillerini elde etmek için geliştirilmiştir. Bu başarıyla simüle fiziksel saldırı karışımı örneklerinde erkek donör tespiti için kullanılmaktadır.
Bu yaklaşım ayrıca, saldırgan sadece birkaç bioparticles kurbanın biyolojik maddenin ezici bir miktarda arasında mevcut olacağı onun / onu saldırganı çizilmemesi bir kurban gibi ek vücut sıvısı / doku karışımı senaryolarda değerlendirilebilir. Mevcut çalışmada geliştirilen bu yaklaşım tek bioparticle düzeyinde analiz izin çünkü Ayrıca, bir aracı, bir surfa bir DNA profili aktaran hangi ikincil transferi 14-19 doğası ve ölçüde daha iyi bir anlayış, kazanmak için kullanılan olabilirBaşka bir yüzey nesnesi veya kişiye 20 ce, nesne ya da kişi. İkinci transfer analizine bir kör-alma, temizleme yaklaşımı ikincil donörden malzeme eser miktarda tespit başarısız olabilir. Burada geliştirilen bir yaklaşım tek veya birkaç bioparticles analiz edilmesini sağlar ve bu nedenle sonuç, birincil verici biyolojik malzemenin bir ezici miktarının mevcudiyetinde karmakarışık değildir. Böyle failin cilt hücrelerinin eser miktarda pozitif tanımlama önemli olabilir nerede vajina dijital penetrasyon içeren gibi cinsel saldırı olgularında iz biyolojik maddenin analizi için etkileri olabilir, bu çalışmada geliştirilen yöntemler cinsel temas kurmak için oluştu.
Jel film örneğinden bioparticles toplanması zor ve karmaşık manipülasyonlar içermeyen iken, SU sağlamak için büyük bir özenle yapılması gerekir, bu prosedürün kritik adımlar vardıraşağı akış reaksiyon kabına bioparticles arasında ccessful transferi. suda çözünür yapıştırıcı ile bioparticles toplanması var, kullanılan yapıştırıcı "top" boyutuna bağlı. yani, yüksek büyütme (~ 200-300X) de stereomikroskopta ilgi sadece bioparticles toplanır emin olmak için (mikroskobik inceledi gerekir biyolojik ve biyolojik olmayan malzeme (örneğin, elyaflar, diğer enkaz) içerebilir ek çevreleyen maddenin toplanması potansiyelidir. istenmeyen ek bioparticles toplanması karıştırılmış DNA profilleri geri neden olabilir. biyolojik olmayan materyalin toplanmasını Birden bioparticles Aynı yapıştırıcı "top" ile tahsil edilmesi durumunda mikro-hacim lizis içine inhibitörleri tanıtmak olabilir / STR reaksiyonları., daha önceden toplanmış bioparticles yapışkan bekâr olmak için bir potansiyel var. Bu sık görülmez, ancak oluşabilir zaman bioparticl büyük sayıdaes toplanır (örneğin, 50) tek bir yapıştırıcı "top" ile. Bioparticles çok sayıda hedef ise, daha az sayıda bioparticles birden koleksiyonları yapılır ama aynı 0.2 ml tüp içine aktarılmıştır önerilir. Bioparticles toplanmıştır sonra, bakım mikroskop aşamasından jel film slayt ve iğnenin ucu rahatsız etmeyecek şekilde 0.2 ml tüp yerleştirilmesi çıkarılması sırasında alınmalıdır. 0.2 ml tüp altındaki amplifikasyon karışımı içine iğne ucunun yerleştirilmesi sırasında, iğnenin ucu tüp yanlarındaki madde kaybını önlemek için, boru tarafı ile temas etmemelidir. Yapıştırıcı çözündürülme tipik hızlı iken (~ 30 sn veya daha az yapışkan "top" boyutuna bağlı olarak) ve can mikroskobik muayenesi sırasında izlenen, iğne ucu yavaş yavaş bu tam emin olmak için amplifikasyon karışımı çıkarılmalıdır çözündürmeyapışkan elde edilmiştir. • Yapışkan tamamen eritilir değilse, iğne tam erimeyi sağlamak için sıvı geri döndürülebilir.
Burada anlatılan protokoller adli biyolojik delillerin gelen bioparticles ve insan hücreleri ile kullanım için optimize edilmiştir. Seçilen liziz tamponu seçilen DNA-STR amplifikasyon kiti ile uyumludur. Uygun alternatif parçalama tamponlar olsa da, alt analizi ile hücre parçalama ve uyumluluk açısından kendi verimlilik kullanıcı tarafından doğrulanması gerekir. Ayrıca, bu protokol açıklanan STR amplifikasyon kiti ve yükseltme döngüsü numarası tek veya birkaç bioparticles ile kullanım için optimize edilmiştir. Rapor artan sağlamlık ve duyarlılığı olan bir yeni nesil STR amplifikasyon kiti seçilmiş ve tek ya da birkaç bioparticles yüksek kaliteli STR geri kazanımı ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Birlikte değişen önerilen amplifi ile çok sayıda STR kitleri,katyon döngüsü numaraları, onlar uygun hassasiyeti sahip olmayabilir ve bu nedenle doğru bu protokollerde kullanılmak önce değerlendirilmelidir gerekir mevcuttur.
Tek ya da birkaç bioparticles kurtarma STR için tarif edilen yöntemlerden başarılı olarak kullanılmasına rağmen, profil iyileşme başarı oranı% 100 değildir. Bu nedenle, bazı örnekler, sınırlı kısmi DNA profil veya profil gözlenebilir. Bunun nedeni kesin görsel hücresel materyal olarak en bioparticles tespit edilemediği için önlenemez, reaksiyon kabına aktarılmadan önce toplanan bioparticles veya yapıştırıcı örnek malzeme kaybına nükleer malzemenin potansiyel bozulmuş devlet. Bu nedenle, her bir temas DNA madde için tek bioparticle numunesinin analizi tavsiye edilmez. Biz sık sık bireysel jel film örneğinden 20 örnek setleri toplamak ve uygun bir STR profili elde değilse gerekli ek örnek setleri toplamak olacaktır. Tmicrovolume reaksiyonları (bir tek standart reaksiyon hacmi olarak benzer veya daha düşük maliyet için ek örnekleri toplamak için fırsat rağmen koleksiyonları için o sadece sınırlama, jel film örneği (ve analiz muhtemel maliyeti mevcut biyolojik materyalin miktarı örneğin, 25 ul).
geliştirilen DNA profilleme yöntemleri burada açıklamak karakterizasyonu, analiz ve dokunmatik DNA örnekleri elde iz biyolojik maddenin yorumlanmasında bir moleküler temelli yaklaşım sağlar. Bununla birlikte, biyolojik maddenin vericinin verici (örneğin, STR profili) belirlenmesi ve buna ek olarak geri bioparticles elde edilebilir ek genetik bilgi yoktur. menşe doku veya vücut sıvısı kaynağı (örneğin, tükürük karşı deri) Bir suç soruşturması önemli bağlamsal bilgiler sağlayabilir. Böyle bir belirleme olmadan, menşe doku kaynağı belirsizlik explo edilebilirsuç alternatif koşullar gibi kısıtlı erişim vardır (örneğin, vücut sıvısı tevdi edilmiş olabilir nasıl) önerilebilir. Burada tarif edilen bioparticle toplanması ve izole etme protokolleri (örneğin, yanaktan, vajinal), bir doku kaynağı tanımlama kullanım için mikro hacim transkripsiyonu (RT), ters içeren stratejisi (mRNA 21-30 profil) bioparticles veya diğer hücreleri toplamak için kullanılabilir ve amplifikasyon reaksiyonları. Daha fazla optimizasyonu ile de tarama DNA kanıtlardan bioparticles de dahil olmak üzere, aynı örnek, hücre tipi kimlik (RNA) ve STR profil izin vermek için, bir DNA / RNA eş izolasyon stratejisi geliştirilmesi mümkün olabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767 (1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
