Summary
כאן אנו מתארים אסטרטגית ההסרה מותאמת ויעילה לאיסוף ביו-חלקיקים הנמצאים ב'לגעת DNA 'דגימות, יחד עם פרוטוקול הגברה משופרת מעורב תמוגה מיקרו נפח 5 μl צעד אחד / הגברה STR, כדי לאפשר ההתאוששות של בד בבד חוזר קצרים (STR) פרופילים של התורם ביו-חלקיקים (ים).
Abstract
ניתן להשיג פרופילי DNA מהראיות "DNA מגע ', הכוללת עקבות מיקרוסקופיות של חומר ביולוגי אנושי. שיטות קיימים להתאוששות של צמר גפן להעסיק DNA עקבות או דבק לדגום שטח של עניין. עם זאת, גישתו של עיוורת-שטיפה 'כגון תשתף מדגם חומר תאי מהאנשים השונים, גם אם התאים' האנשים נמצאים במיקומים שונים מבחינה גיאוגרפית על הפריט. לפיכך, חלק מתערובות DNA נתקלו בדגימות DNA מגע נוצרים באופן מלאכותי על ידי השטיפה עצמו. בחלק מהמקרים, ה- DNA של קורבן ניתן למצוא בעודף משמעותי ובכך מיסוך DNA של כל עבריין פוטנציאלי.
על מנת לעקוף את האתגרים עם שיטות התאוששות וניתוח סטנדרטיים, פיתחנו בעלות נמוכה יותר, שיטה 'ניתוח חכם' כי תוצאות ניתוח גנטי משופר של ראיות המגע DNA. אנו מתארים מותאמיםהתאוששות מיקרומניפולציה אסטרטגיה יעילה ד לאיסוף ביו-חלקיקים הנמצאים בדגימות DNA מגע, כמו גם אסטרטגית הגברה משופרת הכוללת הגברה תמוגה microvolume / STR 5 μl צעד אחד כדי לאפשר ההתאוששות של פרופילי STR מהתורם ביו-החלקיקים (ים). השימוש באדם או כמה (כלומר, "גושים") תוצאות bioparticles ביכולת להשיג פרופילי מקור יחידים. נהלים אלה מייצגים טכניקות משופרות חלופיות לבידוד והניתוח של bioparticles אחת מראיות המגע DNA לזיהוי פלילי. אמנם לא הכרחי בכל חקירה משפטית, השיטה יכולה להיות מאוד מועילה להתאוששות של פרופיל DNA עבריין המקור יחיד במקרים של תקיפה פיזית (למשל, חנק) שלא יכול להיות אפשרי תוך שימוש בטכניקות ניתוח סטנדרטיים. בנוסף, האסטרטגיות שפותחו כאן מציעות הזדמנות להשיג מידע גנטי ברמת התא בודדת ממגוון רחב של oעקבות שאינן משפטיים יס חומר ביולוגי.
Introduction
Touch DNA הוא צורה של ראיות ביולוגיות עקבות שהוא ההעברה הישירה של חומר תאי (למשל, לשפוך תאי עור) מפרט לאובייקט או אדם אחר במהלך המגע פיזי 1. היכולת להשיג פרופילי DNA ממגוון רחב של חפצים נגעו (מסמכים, מצעים, נעליים, כלי נשק, כלי שתייה, עטים, תיק ידיות) דווחה בספרות 2-9.
גורם קריטי בניתוח ראיות המגע DNA הוא השחזור המוצלח של הווה חומר ביולוגי עקבות. גע ראיות DNA שנאספו בדרך כלל על ידי שטיפת האזור החשוד עם מקלון צמר גפן סטרילי (המכונה "עיוור-בניקוי"). שימוש בגישה זו, טבעו של החומר ביולוגי שנאסף אינו ידוע ודגימה של אזור כללי מתבצעת. הנוכחות של חריצי משטח או סדקים עלולה לעכב את ההתאוששות המוצלחת של הכמות הקטנה לעתים קרובות כבר של דוהווה חומר ological. בנוסף, גישה "עיוור-בניקוי" יהיה בהכרח שיתוף מדגם חומר תאי מאנשים השונים תאים שנמצאים על הפריט, גם אם התאים 'האנשים נמצאים במיקומים במרחב שונים על הפריט. ההתאוששות של פרופילי DNA ונכללו, אשר לעתים קרובות מאתגרים לפתור במיוחד עם דגימות DNA תבנית נמוכה, הוא ציין לעתים קרובות 8,10,11 ובמקרים רבים יהיה חפץ תוצאה של התהליך בניקוי עצמו. אם רק כמות קטנה של חומר הייתה מתנה מאחד התורמים, שיטות מיצוי וניתוח סטנדרטיים עלולות להיכשל להתאושש פרופיל מתורם הקטין. בנוסף, הסוג של ספוגית או בין אם זה היה בשימוש יבש או רטוב (טבולה מראש עם מים סטריליים) עשוי להשפיע על כמות חומר ביולוגי שנאסף בשל הבדלים בספיגות וadsorptivity ואת היעילות של שחרורו של החומר הביולוגי 12. Sשיטות חילוץ tandard עלולות לגרום לאובדן מדגם נוסף בשל מניפולציה פיזית הנדרשת ממדגם או העברת דגימת הצעדים.
כפי שתואר לעיל, טכניקות שטיפה פשוטות להתאוששות של חומר ביולוגי עשויות לגרום לאובדן של כמויות זעירות של מדגם ביולוגי, כמו גם שכיחות מוגברת של פרופילים ונכללו בשל כשל להפריד רכיבים ביולוגיים בודדים. לכן, אנו מבקשים לפתח אסטרטגיות התאוששות בררני יותר ויעילה לאיסוף microparticles הסלולרי קיימים באובייקטים נגעו. האסטרטגיה שפותחה עבור הניתוח של חומר ביולוגי מראיות המגע DNA (המכונה כאן "bioparticles" בשל העובדה שגרעין הוא לא תמיד נראה לעין שכן רוב של התאים הנמצאים בשכבה החיצונית של עור אפידרמיס מת או גוסס קרטינוציטים 13) כרוכים הבאים: 1) איסוף חומר ביולוגי (כלומר, bioparticles) באמצעות fr ג'ל-סרטאום נגע חפצים ומשטחים, פריטים שחוקים בגד או על עור אנושי ישיר, 2) בדיקה מיקרוסקופית של החומר ביולוגי התאושש כדי להבטיח איסוף חומר ביולוגי אנושי פוטנציאלי, ו- 3) מיקרומניפולציה של ביו-חלקיקים בודדים או כמה באמצעות דבק מסיס במים, ו 4) פרופיל DNA-STR אוטוזומלית של יו-החלקיקים שנאספו באמצעות microvolume (5 μl) תמוגה צעד אחד / תגובת הגברה.
הליך זה מציע יתרונות רבים על פני שיטות ניתוח המשמשים באופן מסורתי. שחזור של bioparticles באמצעות ג'ל הסרט מאפשר בדיקה מיקרוסקופית של הווה החומר הביולוגי במדגם לפני הניתוח. בעוד שרוב bioparticles התאושש מראיות המגע DNA לא יכול להיות תאי בעלי גרעין ולכן קשה יותר לקבוע איזה או כמה יש לבחור ביו-חלקיקים, הבדיקה המיקרוסקופית של דגימות אלה לפני הניתוח מספק להזדמנות כדי לחפש תאי בעלי הגרעין כך maximizing ההסתברות של התאוששות פרופיל DNA. האוסף של bioparticles באמצעות מיקרומניפולציה בסיוע דבק מסיסה במים מאפשר העברה הישירה של bioparticles הממוקד לתוך צינורות תגובה. הליך זה דמיין תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח העברה מוצלחת של החומר הביולוגי. התגובה המופחתת או microvolume מגבירה את הרגישות תוך הפחתת העלות של ניתוח לדגימה. זה מאפשר ניתוח של מספרים מוגברים של דגימות מראיה בודדת. בשל מגוון במדינה הגנטית של ביו-חלקיקים בראיות DNA מגע, דגימות מרובות מפריטים בודדים מומלצות.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש המוצלח של הפרוטוקולים שפותחו כדי להשיג פרופילים גנטיים הראייתית מאוד של התורמים של חומר ביולוגי בראיות DNA מגע. שיטות אפיון אוסף bioparticle פיתח וDNA לספק מקיף "חכם" (כלומר, ספציפי, מדיד, אתאגישת inable, מציאותית והזמן) מולקולרית המבוססת על האפיון, הניתוח והפרשנות של חומר ביולוגי עקבות. בעוד שפותח במקור עבור יישום לניתוח משפטי של ראיות המגע DNA, יכולות להיות מיושמות האסטרטגיות שפותחו כאן למקורות של חומר ביולוגי אחרים ומציעות הזדמנות להשיג מידע מזהה אישי ברמת התא הבודד.
Protocol
הערה: נוזלי גוף נאספו ממתנדבים באמצעות נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת Institutional Review Board של מרכז פלורידה. הסכמה מדעת בכתב מתקבלת מכל תורם.
1. אוסף של Bioparticles מחפצים ומשטחים נגעו
- חותך את ג'ל-סרט לגודל הרצוי. לוודא שהוא בגודל המתאים לשקופית מיקרוסקופ הזכוכית המשמש כתמיכה המוצקה. לדוגמא, עבור "x 1" שקופיות זכוכית 3, להשתמש בגודל ג'ל-סרט של 2 "x 0.75".
הערה: האורך והרוחב של החומר יכולה להיות מופחתת, אם תרצה בכך, אך לא תעלה על הגודל הזה. - הסר את הגיבוי הלבן מג'ל-הסרט ולצרף את הג'ל-סרט לשקופית מיקרוסקופ (איור 1 א). לחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לוודא קובץ מצורף מלא.
הערה: יש שכבת מגן עליונה ברורה שלא צריך להסיר כדי לאפשר לחץ להיות מיושם לאורך פיסת ג'ל-filמ 'ללא זיהום משטח ג'ל-סרט. שקופיות ג'ל סרט מוכן (עם שכבת מגן המצורפת) ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר עד צורך. - הסר את הסרט המגן העליון ברור מן הג'ל הסרט באמצעות פינצטה סטרילית כאשר מוכן לשימוש (איור 1) מדגם ג'ל-סרט. הנח את משטח ג'ל-סרט במגע ישיר עם האובייקט הרצוי נגע או משטח (איור 2). למרוח כמות קטנה של לחץ כדי להבטיח העברה יעילה של ביו-חלקיקים לג'ל-הסרט.
הערה: אם יותר מדי לחץ מוחל, שקופיות הזכוכית עלולות להישבר.
הערה: דגימות מרובות מאותו האובייקט או המשטח יכולה להיות שנאספו על אותה פיסת ג'ל-סרט. - לאשר את העברת ביו-חלקיקים על ג'ל-הסרט (איור 3) על ידי הצבת השקופיות על סטראו (ניתן להשתמש טרנס או עלית תאורה). הגדלת שימוש ב~ 20X לאזורים גדולים צפייה הטובים ביותר של ג'ל-הסרט, וגדלה של ~ 200X לvi הטוב ביותרביו-חלקיקים בודדים יואינג.
- אחסן את שקופיות מדגם ג'ל-סרט בטמפרטורת חדר בקופסא שקופיות מכוסות או להשתמש באופן מיידי למכתים ו / או איסוף ביו-חלקיקים.
2. מכתים אופציונאלי של Bioparticles על סיוע ויזואליזציה
- מניחים את שקף מדגם ג'ל-סרט שהוכן בשלב 1 על מדף שקופיות מכתים מעל כיור.
- באמצעות pipet העברה חד פעמי, לכסות את פני השטח ג'ל סרט כולו עם הכתם הכחול trypan (איור 4 א). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1-2 דקות.
- להסיר את הכתם עודף על ידי הטיית השקופיות כדי לאפשר את הכתם כדי לנקז לתוך הכיור (איור 4).
הערה: השקופית ניתן לשטוף על ידי הצפה עדינה עם מים סטריליים באמצעות pipet העברה חד פעמי במידת הצורך (איור 4C). - לאפשר שקופיות לייבוש באוויר לפני שתמשיך לבידודה של יו-חלקיקים. הצג את השקופית באמצעות סטראו (~ 20X לצפייה כוללת ו~ 200-300X לvbioparticles פרט iew) כדי להבטיח צביעה נאותה (איור 4D-E).
הערה: השקופיות ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר בקופסא שקופיות מכוסות.
3. בידוד של Bioparticles של ריבית לניתוח
- הנח את המספר המתאים של 0.2 מיליליטר צינורות PCR במעמד ולתייג את הצינורות כראוי.
- מכין את תערובת ההגברה STR (ראה חומרי רשימה) במכסת מנוע מיועדת PCR הגברה או ארון בטיחות ביולוגי. מערבולת תערובת האמן היטב ובקצרה צנטריפוגות במיני-צנטריפוגות.
- הנפח של תערובת הגברה הדרושה לדגימה הוא 3.5 μl; להכין נפח מתאים של תערובת אב את המספר הרצוי של דגימות.
- μl Pipet 3.5 תמהיל הגברה לכל צינור 0.2 מיליליטר. כובע צינור אחד באופן רופף.
- מניחים נייר דבק דו מקל לשקופית מיקרוסקופ הזכוכית נקייה או ישירות על גבי בלוק זכוכית.
הערה: זה ישמש להחזיקצינור 0.2 מיליליטר במקום במהלך איסוף דגימה. - מניחים נייר דבק דו מקל לשקופית מיקרוסקופ הזכוכית נקייה. מניחים חתיכת סרט הלחמת גל מסיס במים על גבי הקלטת דו המקל.
הערה: שקופית זו יכולה להיות מאוחסנת בתא ייבוש לשימוש עתידי. - מניחים את צינור 0.2 מיליליטר הראשון לשקופית הכפולה קלטת מקל או לחסום מוכנה בשלב 3.4. הגדר הצינור הזה בצד עד שהמדגם שנאסף.
- מניחים את שקופית קלטת הלחמת גל מסיס במים מתחת למיקרוסקופ (בהגדלה הנמוכה). באמצעות הקצה של מחט טונגסטן, בעדינות לגרד את פני השטח של הקלטת כדי לאסוף כמות קטנה (או "כדור") של דבק בסופו של המחט (איור 5 א).
הערה: הגודל של הכדור יכול להיות קטן או גדול בהתאם למספר של bioparticles שייגבה. - מוציא בזהירות את מחט טונגסטן עם דבק מתחת למיקרוסקופ מבלי להפריע קצה המחט. המחט יכולהלהיות מקום במדף אם ארצה בכך במיקום מדגם.
- מניחים את המדגם מוכן ג'ל-סרט (משלבי 1 ו -2) על הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד וגדלה, עד שניתן להציג את bioparticles בקלות. זהה את יו-החלקיקים שייגבו.
הערה: גוש זכוכית יכול לשמש לתמיכה בשקופית במידת צורך. - אחזר את מחט טונגסטן עם דבק כדור, ומניח את המחט על פני השטח ג'ל-הסרט שבו ביו-החלקיקים של עניין נמצאים. לחץ על קצה המחט (עם דבק) כלפי מטה, כך שזה במגע עם יו-החלקיק (איור 5). מרים את המחט על מנת להבטיח כי ביו-החלקיקים שנאספו. חזור על תהליך זה עד שהמספר הרצוי של יו-חלקיקים שנאסף.
- הנח את צינור 0.2 מיליליטר PCR מוכן על הבמה מיקרוסקופ. התאם את ההגדלה, כך שהחלק התחתון של הצינור המכיל תערובת ההגברה הוא בפוקוס.
- הכנס את needl טונגסטן בזהירותדואר לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר עד קצה המחט הוא בתמהיל ההגברה.
הערה: זו מבוצעת הטובה ביותר בעת צפייה מבעד למיקרוסקופ. - החזק את המחט בתמהיל ההגברה עד להמסת הדבק וbioparticles משתחררות לפתרון (איור 5 ג). הסר את המחט, למקם את 0.2 מיליליטר זקוף ורופף מכסה את הצינור.
- חזור על הליך הגבייה לדגימות נוספות. נקה את מחט טונגסטן עם האלכוהול הרטיב מראש (isopropanol) מגבונים בין דגימות.
4. בידוד המשולב Microvolume חומצות גרעין (הישיר תמוגה) וAutosomal הקצר טנדם חזור Profiling (STR)
- הכן את חיץ תמוגה (ראה חומרים) במכסת מנוע מיועדת PCR הגברה או ארון בטיחות ביולוגי. להוסיף 1.5 μl של מאגר תמוגה על צינור אחד ל5 μl כולל נפח תגובה. מכסי צינור לסגור בחוזקה.
הערה: 0.2 מיליליטר הצינורות כבר מכילים 3.5 μl שלתמהיל הגברה והגבייה ביו-חלקיקים משלב 3. - דגימות מקום בCycler התרמית ולהגביר את הדגימות באמצעות תנאי האופניים הבאים: 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 11 דקות; 34 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ו -59 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות; ואחיזת C 4 מעלות.
- מוצרי הגברה חנות ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר.
איתור מוצרים 5. - נימי אלקטרופורזה (CE)
- בצלחת גם 96, להוסיף 10 μl של תמהיל ריצת CE (9.7 μl פוראמיד deionized וסטנדרטי בגודל 0.3 μl, ראה חומרים). הוסף 1 μl של מוצר מוגבר או סולם allelic היטב כל אחד.
זהירות: Formamide הוא mutagen פוטנציאל וצריך להיות מטופל במנדף כימי בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים. - השתמש בתנאי electrophoretic צוינו על ידי היצרן במדריך לערכת הגברה או internally תוקף תנאים.
- לנתח נתונים גולמיים עם תוכנת ניתוח STR.
Representative Results
נציג תמונות של bioparticles פרט והכבדות שהתאוששו מצווארון חולצה (100% פוליאסטר) משוחק על ידי תורם זכר מוצגות באיור 6 (bioparticles הבודד) ואיור 7 (bioparticles בכבדות). Bioparticles היו התאוששו מצווארון החולצה באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן: העברת bioparticles מצווארון החולצה לג'ל סרט באמצעות מגע ישיר, צביעת bioparticles התאושש עם trypan כחול, איסוף דגימות bioparticle באמצעות מחט טונגסטן ודבק מסיס במים וניתוח STR באמצעות ההגברה תמוגה מיקרו-נפח 5 μl / STR. איורים 6 ו -7 מייצגים דגימה טיפוסית של bioparticles שינותח מפריט המגע DNA בודד (20 bioparticles היחיד / בודד ו -20 bioparticles תגליתנו מראה ש). Bioparticle (ים) שנאסף בכל תמונה מסומנות עם מדידות אורך ורוחב (במיקרון). PERCentage של אללים STR התאוששו מכל אחת מbioparticle (ים) שנאסף מסופק על כל תמונה בנפרד כדי להדגים את מעלות משתנים הצלחה שניתן לצפות שיתקבל מbioparticles עם סוג זה של ראיות. Bioparticles התאושש מדגימות DNA מגע הוא במידה רבה מת או גוסס קרטינוציטים ולכן פרופיל STR הראייתית לא מתקבל כל bioparticle נאסף, כפי שניתן לראות באיורים 6 ו -7. לדוגמא צווארון חולצה הזאת, פרופילי STR התקבלו מ14/20 (70%) של bioparticles הפרט ו15/20 (75%) בכבדות bioparticles. עם זאת, כל אחד מהפרופילים התאוששו נע בערך הוכחתי: 3-97% התאוששות אלל לפרופילים אישיים וbioparticles 3-100% התאוששות אלל לפרופילי bioparticle בכבדות. עקב השונות בשיעורי הצלחה, האוסף של מספר רב של bioparticles מכל פריט DNA מגע מומלץ. הדבר מבטיח סיכוי טוב יותר של קבלת probati מאודve פרופיל STR.
פרופיל STR התקבל מאחד מהדגימות bioparticle בודדות מצווארון החולצה מוצג באיור 8 (bioparticle ממנו הפרופיל מקורו מוצג משמאל). כמעט פרופיל STR מלא (28 מתוך 30 אללים, מוקד אחד לנשור, דיוק של הפרופיל הושג מאומת על ידי השוואה לפרופיל הפניה) התקבל מbioparticle אדם זה. הפרופיל המתקבל הוא באיכות גבוהה עם גבהים שיא בין-לוקוס מאוזנים באופן סביר ולא allelic לנשור. Allelic לנשור וחפצי גובה שיא לא מאוזנים נצפים לעתים קרובות גם עם דגימות DNA תבנית נמוכה. פרופיל STR התקבל מאחד מהדגימות bioparticle בכבדות מצווארון החולצה מוצג באיור 9. פרופיל מלא STR (30/30 אללים, דיוק של הפרופיל הושג מאומת על ידי השוואה לפרופיל הפניה) הושג. כפי שהוזכר קודם לכן, פרופיל STR לא התאושש מאי פעםbioparticle y נאסף. דוגמא של פרופיל DNA מוצלח של bioparticle אחד (3% התאוששות אלל, 1/30 אללים) מוצגת באיור 10 (bioparticle הבודד). בעוד bioparticle אדם זה לא היה מוצלח, פרופילי STR הראייתית ביותר של התורם של bioparticles במדגם זה התקבלו מbioparticles האחר התאושש מהמדגם זהה. זה ממחיש את הצורך בביצוע דגימות תא בודד / גוש מרובים מאותו האובייקט.
השיטות שפותחו "חכמות" הניתוח שתוארו כאן לראיות DNA מגע שימשו בהצלחה להתאושש פרופילי מקור יחיד הראייתית מאחת וbioparticles "כבדות" משונה נגעו חפצים ופריטי לבוש (לדוגמא, משענות כיסא, גלגלי הגה מכונית, טלפונים סלולריים, כוסות קפה, סיגריות, עטים, חולצות, מכנסיים קצרים, וסוודרים). עם זאת, חשוב, גישה זו שימשה גם לזיהוי והאפיון של ד הגבריonor DNA (מקור יחיד) בדגימות תערובת קשר / תקיפה פיזית מדומה (למשל, עבריין תופס של קורבן שורש כף יד, צוואר או בגדים, או מגע עם המצעים של הקורבן כמו בתקיפות מיניות).
איור 1: הכנת שקופיות ג'ל-סרט לאוסף bioparticle. (א) כיסוי מגן האחורי הלבן מוסר באמצעות פינצטה סטרילית מהחתיכה של ג'ל-סרט לחשוף את הגיבוי דבק. ג'ל-הסרט אז דבק שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם לחץ חזק. (ב) כאשר מדגם ג'ל סרט הוא מוכן לשמש לאיסוף bioparticle סרט מגן ברור העליון, הוסר הוא באמצעות פינצטה סטרילית.
איור 2: אוסף Bioparticle שימוש בג'ל-film ממצעים שונים. ניתן להשתמש בשקופיות ג'ל-הסרט כדי לאסוף bioparticles ממגוון רחב של משטחים. ג'ל-הסרט ממוקם במגע ישיר עם האובייקט או משטח של עניין. לחץ עדין מוחל על מנת להעביר bioparticles על פני השטח ג'ל-סרט. אוסף של bioparticles מפריטים () לבשו בגדים (צווארון מעיל), (ב) נגע אובייקטים (כוס קפה נסיעה), ו- (ג) עור אנושי ישיר (פרק כף יד גברית) מוצג.
איור 3:. Bioparticles על פריט בגדים משומש (בתוך מכנס) Bioparticles מועבר לג'ל סרט דרך מגע ישיר עם משטח האובייקט. ניתן למצוא Bioparticles כ" גושים "או bioparticles הבודד / בודד (מסומן בחצים אדומים).
איור 4:. מכתים אופציונלית של bioparticles בשקופיות ג'ל-סרט להדמיה טובה יותר של bioparticles, יכולות להיות מוכתמות דגימות ג'ל סרט עם כתם כחול trypan. כל פני השטח של ג'ל-סרט הוא מכוסה על ידי trypan כחול (). אחרי 1-2 דקות של מכתים, השקופיות מוטה בעדינות כדי לאפשר כתם עודף לברוח השקופיות (B). הצפה עדינה עם מים סטריליים (C) ניתן להשתמש כדי להסיר את הכתם עודף. לאחר שקופית אוויר יבשה, השקופיות ניתן לראות תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח צביעה נכונה (D, E). הערה:. לא כל bioparticles יופיע מוכתם (כלומר, בצבע כחול) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
OAD / 52,612 / 52612fig5.jpg "/>
איור 5: איסוף וניתוח Bioparticle. כמות קטנה (א) (או "כדור") של קלטת הלחמת גל מסיס במים ("דבק") נאסף על קצה מחט טונגסטן על ידי גירוד עדין. (ב) הדבק אז נגע לג'ל משטח סרט כדי לאסוף את bioparticles של עניין. ניתן לאסוף bioparticles בודד או מרובה עם כדור דבק יחיד. (ג) ברגע שbioparticles הרצוי כבר נאסף, קצה המחט ממוקם לתוך תערובת הגברה בצינור PCR 0.2 מיליליטר. המחט מוחזקת בנוזל עד שהוא נמס ושחרורו של bioparticles לפתרון הוא ציין. כל השלבים בתהליך האיסוף מתבצעים ומוצגים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח אוסף bioparticle מוצלח והעברה. אנא לחץ כאן לצפייה בlarגרסת ger של נתון זה.
איור 6:. Bioparticles פרט במדגם צווארון החולצה Bioparticles נמצא שימוש בג'ל-סרט מהחלק הפנימי של צווארון חולצה שלבש תורם ממין זכר. Bioparticles היו מוכתם באמצעות כחול ותמונות של עשרים bioparticles האישי שונה שזוהה במדגם trypan מוצג. בכל תמונה, bioparticle שנאסף הקיף (עיגולים אדומים המציינים bioparticles בי פרופיל היה התאושש; עיגולים שחורים מצביעים bioparticles בי פרופיל לא התאושש). התאוששות אלל אחוזים (מספר אללים נצפו מתוך 30 אפשריים) מוצגת מעל התמונה של bioparticle ממנו הפרופיל שהתאושש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
bioparticles מגושם במדגם צווארון החולצה Bioparticles נמצא שימוש בג'ל-סרט מהחלק הפנימי של צווארון חולצה שלבש תורם גברי: איור 7.. Bioparticles היו מוכתם באמצעות כחול ותמונות של עשרים bioparticles תגליתנו מראה שונה שזוהה במדגם trypan מוצג. בכל תמונה, bioparticle שנאסף הקיף (עיגולים אדומים המציינים bioparticles בי פרופיל היה התאושש; עיגולים שחורים מצביע bioparticles בי פרופיל לא התאושש התאוששות אלל אחוזים (מספר אללים נצפו מתוך 30 אפשריים). מוצג עבור כל bioparticle ממנו הפרופיל שהתאושש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דק-page = "תמיד"> 
איור 8: פרופיל Autosomal STR מתקבל מbioparticle אחת מצווארון חולצה גברי פרופיל STR אוטוזומלית התקבל מbioparticle בודד (המוצג על שמאל) באמצעות 5 μl תמוגה הישירה / תגובת הגברה.. הדיוק של פרופיל זה נקבע על ידי השוואה למדגם התייחסות תורם. חמישה עשר אוטוזומלית לוקוסי STR וamelogenin (קביעת מין) נמצאים בתגובה אחת ומופרד על ידי אלקטרופורזה נימים-מוגבר במשותף. התוצאות מוצגות כאן כelectropherogram. מספרי אלל הם ייעוד מתחת לכל שיא בכל מוקד. ציר X מייצג גודל שבר (זוגות בסיסים, נ"ב) וציר y מייצג עוצמת אות (יחידות הקרינה היחסית RFU; הניתן במסגרת כל מספר אלל המקביל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: פרופיל Autosomal STR מתקבל מbioparticle תגליתנו מראה שמצווארון חולצה גברי פרופיל STR אוטוזומלית התקבל מbioparticle תגליתנו מראה ש( מוצג על שמאל) באמצעות 5 μl תמוגה הישירה / תגובת הגברה.. הדיוק של פרופיל זה נקבע על ידי השוואה למדגם התייחסות תורם. חמישה עשר אוטוזומלית לוקוסי STR וamelogenin (קביעת מין) נמצאים בתגובה אחת ומופרד על ידי אלקטרופורזה נימים-מוגבר במשותף. התוצאות מוצגות כאן כelectropherogram. מספרי אלל הם ייעוד מתחת לכל שיא בכל מוקד. ציר X מייצג גודל שבר (זוגות בסיסים, נ"ב) וציר y מייצג עוצמת אות (יחידות הקרינה היחסית RFU; הניתנת במסגרת כל מספר אלל המקביל).pg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 10:. דוגמא לכישלון להשיג פרופיל STR אוטוזומלית מתקבל מbioparticle נאסף bioparticle הבודד מוצג בשמאל נאסף ממדגם ג'ל סרט צווארון של חולצה. כפי שניתן לראות מהפרופיל וכתוצאה מכך STR (מוצג מימין), רק אחד אלל (מתוך 30 אפשריים) הושג. מספרי אלל הם ייעוד מתחת לכל שיא בכל מוקד. ציר X מייצג גודל שבר (זוגות בסיסים, נ"ב) וציר y מייצג עוצמת אות (יחידות הקרינה היחסית RFU; הניתנת במסגרת כל מספר אלל המקביל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כאן יש לנו תארנו שיטות לאיסוף והניתוח גנטי משופר של bioparticles התאושש מראיות DNA מגע. הגישה שפותחה כרוכה הבאה: 1) איסוף חומר ביולוגי (כלומר, bioparticles) באמצעות ג'ל סרט מאובייקטים נגעו ומשטחים, פריטי לבוש שחוקים או עור אנושי ישיר, 2) בדיקה מיקרוסקופית של החומר ביולוגי התאושש כדי להבטיח אוסף של פוטנציאל חומר אנושי ביולוגי, ו- 3) מיקרומניפולציה של bioparticles הבודד או כמה באמצעות דבק מסיס במים, ו- 4) פרופיל DNA-STR אוטוזומלית של bioparticles נאסף באמצעות microvolume (μl 5) תמוגה צעד אחד / תגובת הגברה. השימוש בצינור תגובה סגור צעד אחד מפחית את הפוטנציאל לזיהום ומדגם הפסד ממניפולציות מדגם נוספים או להעביר צינורות תגובה אחרים. Microvolume הצעד אחד המשופר (5 μl) תמוגה / תגובות ההגברה STR מאפשר ההתאוששות של מלא או probativהדואר STR פרופילים של התורם של bioparticles הבודד או כמה. גישה זו פותחה על מנת להשיג פרופילי STR המקור יחידים מראיות DNA מגע חד ורב-מקור (למשל, פריטים שחוקים בגדים וחפצי בית אחרים, אובייקטים נגעו / טיפלו ומשטחים, תערובות עור / עור). זה בהצלחה כבר בשימוש לצורך זיהוי של התורם ממין זכר בדגימות תערובת תקיפה פיזיות מדומה.
גישה זו יכולה להיות מוערכת יותר בתרחישי תערובת נוזלים / רקמות גוף נוספים כגון קורבן מגרד התוקף שלו / שלה, שבו רק כמה bioparticles מהתוקף יהיה נוכח בין כמות עצומה של חומר ביולוגי מהקורבן. בנוסף, מאז גישה זו פותחה במחקר הנוכחי מאפשרת ניתוח ברמת bioparticle אחת, זה יכול לשמש כדי להשיג הבנה טובה יותר של האופי וההיקף של העברה משנית 14-19, שבו מתווך מעביר פרופיל DNA על surface, חפץ או אדם לאובייקט משטח אחר או אדם 20. גישה עיוורת-שטיפה לניתוח של העברה משנית עלולה להיכשל לזהות כמויות זעירות של חומר מהתורם המשני. הגישה שפתחה כאן מאפשרת הניתוח של bioparticles הבודד או כמה, ולכן התוצאות אינן מבולבלות על ידי הנוכחות של כמות עצומה של חומר ביולוגי מהתורם העיקרי. מתודולוגיות שפותחו בעבודה זו גם עשויה להיות השלכות על הניתוח של חומר ביולוגי עקבות במקרי תקיפה מיניות כגון אלה הכרוכים בחדירה דיגיטלית של הנרתיק שבו זיהוי חיובי של כמויות זעירות של תאי עור מהעבריין יכול להיות מכריע לקבוע כי מגע מיני התרחש.
בעוד האוסף של bioparticles ממדגם ג'ל סרט אינו כרוך במניפולציות קשות ומורכבות, ישנם צעדים קריטיים בהליך זה שצריך להתבצע בזהירות רבה על מנת להבטיח את suהעברת ccessful של bioparticles לכלי תגובה במורד הזרם. האוסף של bioparticles עם הדבק המסיס במים יש לראות במיקרוסקופ (כלומר, סטראו בהגדלה גבוהה (~ 200-300X) כדי להבטיח שרק bioparticles עניין נאספים. בהתאם לגודל של "הכדור" הדבק משמש, שם הוא הפוטנציאל לאיסוף חומר הסובב נוסף שעשויה לכלול גם חומר ביולוגי ולא-ביולוגי (למשל, סיבים, פסולת אחרת). האוסף של bioparticles נוסף בלתי צפויה עלול לגרום להתאוששות של פרופילי DNA ונכללו. האוסף של חומר לא-ביולוגי עשוי להציג את המעכבים לתמוגה מיקרו-הנפח / תגובות STR. אם bioparticles מרובה נאספים עם אותו הדבק "כדור", יש פוטנציאל לbioparticles שנאסף בעבר להפוך פנוי מדבק. זה לא בתדירות גבוהה נצפה, אך יכול להתרחש כאשר מספרים גדולים יותר של bioparticles נאספים (למשל, מעל 50) עם "כדור" אחד דבק. אם מספר גדול של bioparticles ממוקדים, מומלץ שאוספים רבים של פחות bioparticles נעשים אך כל שהועברו לתוך צינור 0.2 מיליליטר. ברגע שbioparticles כבר נאסף, יש להקפיד במהלך הסרת השקופיות מבמת מיקרוסקופ ג'ל-סרט ואת המיקום של צינור 0.2 מיליליטר, כך שקצה המחט אינו מופרע. במהלך מיקום של קצה המחט לתוך תערובת ההגברה בחלק התחתון של צינור 0.2 מיליליטר, קצה המחט לא צריך ליצור קשר עם הצדדים של הצינור כדי למנוע אובדן של חומר על הצדדים של הצינור. בעוד solubilization של הדבק הוא בדרך כלל מהיר (~ 30 שניות או פחות, תלוי בגודל של "הכדור" הדבק) ויכולים להשגחה במהלך הבדיקה מיקרוסקופית, קצה המחט יש להסיר לאט מתמהיל ההגברה כדי להבטיח שמלא solubilizationשל הדבק הושג. אם הדבק לא נמס לגמרי, המחט ניתן להחזיר לנוזל כדי לאפשר פירוק מלא.
הפרוטוקולים שתוארו כאן כבר מותאמים לשימוש עם bioparticles ותאים אנושיים מראיות ביולוגיות לזיהוי פלילי. מאגר תמוגה נבחר תואם את ערכת ההגברה DNA-STR נבחרה. למרות שעשויה להיות מאגרי תמוגה חלופה מתאימים, היעילות שלהם במונחים של תמוגה תא ותאימות עם ניתוח במורד הזרם חייבת להיות מאומת על ידי המשתמש. בנוסף, מספר ערכת ההגברה STR ומחזור ההגברה המתואר בפרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם bioparticles בודד או כמה. ערכת ההגברה STR הדור הבא עם דיווח חוסן ורגישות מוגברים נבחרה וכבר הוכיחה לגרום להתאוששות של פרופילי STR באיכות גבוהה מbioparticles הבודד או כמה. בעוד ערכות רבות אחרות STR, עם amplifi המומלץ משתנהמספרי מחזור קטיון, זמינים, הם לא יכולים להחזיק את רגישות מתאימה, ולכן היית צריך להיות מוערך כראוי לפני השימוש בפרוטוקולים אלה.
למרות השימוש המוצלח של השיטות שתוארו עבור פרופילי ההתאוששות STR מbioparticles בודד או כמה, את שיעור ההצלחה של התאוששות פרופיל לא יהיה 100%. לכן, עבור כמה דוגמאות פרופיל מוגבל חלקי DNA או לא פרופיל אפשר לראות. זה לא ניתן להימנע בשל חוסר היכולת לזהות בוודאות מבחינה ויזואלית ביותר bioparticles כחומר תאי, המדינה מושפלת הפוטנציאל של החומר הגרעיני בbioparticles או אובדן של חומר מדגם מהדבק שנאסף לפני ההעברה לכלי התגובה. לכן, הניתוח של מדגם bioparticle אחת עבור כל פריט DNA מגע אינו מומלץ. לעתים קרובות אנו אוספים 20 קבוצות מדגם ממדגם ג'ל סרט אישי ונאסוף סטי מדגם נוספים בהתאם לצורך אם פרופיל STR מתאים ולא התקבל. Tהוא רק מגבלה של אוספים היא הכמות של חומר ביולוגי הנוכחית על מדגם ג'ל-סרט (וסביר להניח את עלות הניתוח, למרות שתגובות microvolume לספק את ההזדמנות כדי לאסוף דגימות נוספות לעלות דומה או נמוכה יותר כיחיד סטנדרטי נפח תגובה ( לדוגמא, 25 μl).
שיטות פרופיל DNA פיתחו מתארות כאן מספקות גישה מבוססת מולקולרית לאפיון, הניתוח והפרשנות של חומר ביולוגי עקבות התאוששו מדגימות DNA מגע. עם זאת, יש מידע גנטי נוסף שניתן להשיג מbioparticles התאושש בנוסף לנחישותו של התורם (כלומר, פרופיל STR) של התורם של החומר הביולוגי. מקור נוזל הרקמה או גוף ממוצא (למשל, עור לעומת רוק) עשוי לספק מידע קונטקסטואלי חיוני לחקירה פלילית. ללא קביעה כאמור, העמימות של מקור הרקמה ממוצא ניתן exploדות כנסיבות חלופיות של הפשע (למשל, איך נוזלי הגוף עשויים הופקדו) יכול להיות שהציע. פרוטוקולי אוסף bioparticle ובידוד שתוארו כאן יכולים לשמש כדי לאסוף bioparticles או תאים אחרים (לדוגמא, buccal, נרתיק) לשימוש בזיהוי מקור רקמה (mRNA פרופיל 21-30) אסטרטגיה שכרוכה מיקרו-נפח הפוך שעתוק (RT) ו תגובות הגברה. עם אופטימיזציה נוספת זה עשוי להיות גם אפשר לפתח DNA / אסטרטגית שיתוף בידוד RNA להתיר זיהוי סוג התא (RNA) ופרופיל STR מאותו המדגם, כולל bioparticles מראיות המגע DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767 (1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
