Summary
여기에 우리가 존재 바이오 입자의 수집을위한 최적화하고 효율적인 제거 전략을 설명 한 번에 5 ㎕를 마이크로 볼륨 용해 / STR 증폭을 포함하는 향상된 증폭 프로토콜과 함께, 샘플 'DNA 터치'를,의 회복을 허용하는 짧은 탠덤 반복 (STR) 바이오 입자 기증자 (들)의 프로필.
Abstract
DNA 프로파일은 인체의 생체 물질을 포함하는 미세 흔적 '터치 DNA'증거로부터 얻을 수있다. 추적 DNA 채용 면봉 또는 접착 테이프를 회수 현재의 방법은 관심 영역을 샘플링. 그러나, 이러한 "블라인드 보라고 '접근 공동 샘플 것이다 다공질 재료를 다른 개체로부터, 개인의 세포가 상품에 지리적으로 구별되는 지역에 위치하는 경우에도. 따라서, 터치 DNA 샘플에서 발생하는 DNA 혼합물의 일부는 인위적으로 자신을 보라고에 의해 만들어집니다. 일부 예에서, 희생자의 DNA 따라서 잠재적 가해자 DNA 마스킹 상당한 과량에서 찾을 수있다.
표준 복구 및 분석 방법에 문제를 회피하기 위해, 우리는 터치 DNA 증거의 향상된 유전자 분석 결과 낮은 비용으로, '스마트 분석'방법을 개발했다. 우리는 최적화를 설명터치 DNA 샘플에 존재하는 생체 입자의 회수뿐만 아니라, 바이오 입자 공여자 STR 프로파일의 회복을 허용하기 위해 한 단계 5 μL microvolume 용해 / STR 증폭 관련된 향상된 증폭 전략 D 효율적인 미세 조작 복구 전략 (들). 개개의 사용 또는 몇몇 (즉, "덩어리") 단일 소스 정보를 획득 할 수있는 능력의 결과 bioparticles. 이러한 절차는 분리 및 법정 터치 DNA 증거에서 단일 bioparticles의 분석을위한 대안 향상된 기술을 나타냅니다. 모든 법의학 수사에 필요한 것은 아니지만,이 방법은 표준 분석 기술을 이용하여 가능하지 않을 수 물리적 공격 (예를 들어, 질식) 포함하는 경우에 단일 소스 가해자 DNA 프로파일의 회복에 매우 유익 할 수있다. 또한, 여기서 개발 된 전략은 O의 다양한 단일 세포 수준에서의 유전자 정보를 얻을 수있는 기회를 제공거기는 비 법정 추적 생물학적 물질.
Introduction
터치 DNA가 세포 물질의 직접 전송입니다 추적 생물학적 증거의 한 형태이다 신체 접촉을 한 동안이나 기타 개인에게 개인으로부터 (예를 들면, 피부 세포를 창고). 터치 개체의 다양한 DNA 프로파일을 얻을 수있는 능력 (문서, 침구, 신발, 총기, 마시는 용기, 펜은, 서류 가방은 핸들) 문헌 2-9에서보고되었다.
터치 DNA 증거의 분석에서 중요한 요소는 추적 생물학적 물질의 존재가 성공적으로 복구 된 것입니다. DNA 증거는 일반적으로 멸균 면봉으로 의심되는 영역을 보라고 의해 수집 만져 ( "블라인드 보라고"라고 함). 이 방법을 이용하여, 수집 된 생체 물질의 특성은 공지되지 않고, 일반화 된 영역의 샘플링이 수행된다. 표면의 홈이나 틈새의 존재는 Bi를 이미 종종 소량의 성공적인 회수를 방해 할 수학적 물질의 존재. 또한, '블라인드 보라고'에 접근하게됩니다 세포 항목에 존재하는, 개인의 세포 항목에 공간적으로 서로 다른 위치에있는 경우에도 다른 개인의 필요 공동 샘플 세포 물질. 종종 낮은 주형 DNA 샘플과 특히 해결하기 위해 도전하고 혼합 된 DNA 프로파일의 회복은 자주 8,10,11를 관찰하고 많은 경우 보라고 프로세스 자체의 결과적인 이슈가 될 것입니다. 물질의 소량 만이 도너의 하나에서 존재하는 경우, 표준 추출 및 분석 기술은 작은 기여도 프로파일을 복구하지 못할 수있다. 또한, 건식 또는 습식 사용 하였다 여부 면봉 형태 인해 흡수율 및 흡착성과 생체 물질 (12)의 방출 효율의 차이에 수집되는 생체 물질의 양에 영향을 미칠 수있다 (멸균 수로 미리 적신). 에스tandard 추출 방법으로 인해 샘플 또는 샘플 전송 단계의 필요한 물리적 조작에 추가 샘플 손실이 발생할 수 있습니다.
상술 한 바와 같이, 생체 물질의 회복을위한 간단한 기술 보라고 인해 개별 생물학적 성분을 분리 실패 생물학적 샘플뿐만 아니라 혼합 된 프로파일의 증가 발생 미량의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 우리는 감동 객체에 존재하는 세포의 미세 입자의 수집에 대한보다 선택하고 효율적인 복구 전략을 개발하기 위해 노력했다. 터치 DNA 증거로부터 생체 물질의 분석을위한 개발 전략 (표피의 외부 표피 층에있는 세포의 대다수가 죽었거나 죽어 때문에 핵 항상 표시하지 않다는 사실을 "bioparticles"로서 여기서 언급 겔 필름 FR을 통해 생물학적 물질 (즉, bioparticles)의 1) 모음 : 다음) (13) 각화 포함톰은 수용성 접착제를 사용하여 객체와 표면 마모 의류 항목 또는 직접 인간의 피부, 잠재적 인 인간의 생물학적 물질의 수집을 보장하기 위해 복구 된 생물학적 물질의 2) 현미경 검사, 단일 또는 소수의 바이오 입자의 3) 미세 조작을 터치하고, microvolume (5 μL) 원스텝 용해 / 증폭 반응을 이용하여 수집 된 생체 입자 4) 염색체 DNA-STR 프로파일.
이 절차는 전통적으로 사용되는 분석 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 겔 필름을 이용하여 복구 bioparticles의 분석 이전에 샘플에 생체 물질 존재 현미경 검사를 허용한다. 터치 DNA 증거에서 발견 bioparticles의 대부분은 핵 세포가 더 어려워 또는 바이오 입자가 선택되어야하는, 분석 기회 제공 이전에 이들 시료의 현미경 검사가 핵 세포를 검색 할 결정 할 수있게되지 않을 수 있지만 따라서 maximizDNA 프로파일 복구의 확률을 보내고. 수용성 접착제를 이용한 미세 조작을 사용하여 bioparticles의 컬렉션은 반응 튜브에 대상 bioparticles의 직접 전송을 가능하게한다. 이 절차는 생체 물질의 성공적인 전송을 보장하기 위해 현미경으로 가시화된다. 샘플 당 분석 비용을 줄이면서 감소되거나 microvolume 반응 민감도를 증가시킨다. 이 증거의 개별 부분에서 샘플의 증가 수의 분석을 수 있습니다. 때문에 터치 DNA 증거에 바이오 입자의 유전 적 상태의 범위, 개별 항목에서 여러 샘플링 권장합니다.
여기서 우리는 터치 DNA 증거 생물학적 물질의 기증자의 높은 입증하는 유전자 프로파일을 얻기 위해 개발 된 프로토콜의 성공적인 사용을 보여줍니다. 개발 bioparticle 수집 및 DNA 프로파일 링 방법은 포괄적 인 '스마트'(즉, 특정, 측정, 아타을 제공특성, 분석 및 추적 생물학적 재료의 해석, inable 사실 적시) 분자 기반의 접근 방식. 원래 터치 DNA 증거 법의학 분석 어플리케이션을 위해 개발 동안, 여기서 개발 된 전략은 생체 물질의 다른 소스에인가하고 단일 세포 수준에서의 개인 식별 정보를 획득 할 기회를 제공 할 수있다.
Protocol
참고 : 체액이 센트럴 플로리다의 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학의 승인 절차를 사용하여 자원 봉사자 수집 하였다. 정보를 서면 동의는 각 기증자로부터 얻은 것입니다.
감동 개체 및 표면에서 Bioparticles 1. 컬렉션
- 원하는 크기 겔 필름을 잘라. 이 고체 지지체로 사용되는 유리 현미경 슬라이드에 대한 적절한 크기인지 확인합니다. 예를 들어, 3 "X 1"유리 슬라이드에 대해,이 "X 0.75"의 겔 필름의 크기를 사용한다.
주 : 길이와 재료의 폭은 원하는 경우 감소 될 수 있지만,이 크기를 초과해서는 안된다. - 겔 필름에서 흰색지지를 제거하고 현미경 슬라이드 (그림 1A)에 겔 필름을 부착합니다. 전체 첨부 파일을 확인하기 위해 단단히 누르십시오.
참고 : 압력이 젤-FIL의 조각을 따라 적용 할 수 있도록 제거하면 안 투명 상도 보호 층이있다겔 필름 표면의 오염없이 m. 필요할 때까지 (부착 된 보호 층)를 제조 겔 필름 슬라이드를 실온에서 저장 될 수있다. - 준비 (그림 1B) 겔 필름 샘플을 사용하는 경우 멸균 핀셋을 사용하여 겔 필름에서 맨 윗부분 보호 필름을 제거합니다. 원하는 터치 객체 또는 표면 (그림 2)와 직접 접촉 겔 필름 표면을 놓습니다. 겔 필름 바이오 입자의 효율적인 전송을 보장하기 위해 압력을 약간 적셔.
주 : 너무 많은 압력이인가되면, 슬라이드 유리가 파손.
참고 : 동일한 객체 또는 표면에서 여러 샘플링 겔 필름의 동일한 부분에 수집 할 수 있습니다. - 실체 현미경 슬라이드에 배치하여 (도 3) 겔 필름 상에 바이오 입자의 전달을 확인 (또는 트랜스 - 에피 조명이 사용될 수있다). 가장 VI의 ~ 200X의 사용 겔 필름의 가장 좋은 보는 큰 지역 ~ 20 배의 확대, 배율유잉 개별 바이오 입자.
- 해당 슬라이드 박스 실온에서 겔 필름 샘플 슬라이드를 저장하거나 및 / 또는 바이오 입자 컬렉션 염색 즉시 사용한다.
시각화에 도움이 Bioparticles 2. 옵션 염색
- 싱크대 위에 슬라이드 염색 랙에 1 단계에서 제조 된 겔 필름 샘플 슬라이드를 놓습니다.
- 전사 일회용 피펫을 사용하여, 트리 판 블루 스테인 (도 4a)와 전체 겔 필름 표면을 커버. 1-2 분 동안 실온에서 배양한다.
- 얼룩이 싱크 (그림 4B)로 떨어져 배출 할 수 있도록 슬라이드를 기울여 초과 얼룩을 제거합니다.
참고 : (그림 4C) 필요한 경우 슬라이드 일회용 전송 피펫을 사용하여 멸균 물과 부드러운 홍수로 세척 할 수있다. - 바이오 입자의 분리를 진행하기 전에 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다. V에 ~ 전체보기를위한 실체 현미경 (~ 20 배와를 사용하여 200-300X을 슬라이드보기서평 개별 bioparticles는) 적절한 염색 (그림 4D-E)를 확인합니다.
참고 : 슬라이드 덮개가 슬라이드 상자에 실온에서 저장 될 수있다.
분석에 대한 관심 Bioparticles 3. 분리
- 랙에 0.2 ㎖의 PCR 튜브의 적절한 수를 놓고 적절하게 튜브를 레이블을 붙입니다.
- 지정된 PCR 증폭 후드 또는 바이오 안전성 캐비닛의 STR 증폭 믹스 (자료 목록 참조) 준비합니다. 소용돌이는 마스터 믹스 잘 짧게 미니 원심 분리기에서 원심 분리기.
- 샘플 당 필요한 증폭 혼합물의 부피는 3.5 μL이고; 원하는 샘플 수에 대한 마스터 믹스의 적절한 볼륨을 준비합니다.
- 각 0.2 ML 튜브로 증폭 믹스의 피펫 3.5 μL. 느슨하게 각 튜브를 모자.
- 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 직접 유리 블록에 더블 스틱 테이프의 조각을 놓습니다.
주 :이를 보유하는 데 사용될시료 채취 동안 장소에 0.2 ML 튜브. - 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 이중 스틱 테이프의 조각을 놓습니다. 이중 스틱 테이프 위에 수용성 웨이브 솔더 테이프의 조각을 놓습니다.
참고 :이 슬라이드가 나중에 사용하기 위해 데시 케이 터에 저장할 수 있습니다. - 3.4 단계에서 제조 된 이중 스틱 테이프 슬라이드 또는 블록에 최초의 0.2 ML 튜브를 놓습니다. 샘플이 수집 될 때까지 옆이 튜브를 설정합니다.
- 현미경 (저배율)에서 수용성 웨이브 솔더 테이프 슬라이드를 놓습니다. 텅스텐 바늘의 팁을 사용하여 조심스럽게 소량 (또는 "공") 바늘 (도 5a)의 단부에 접착제를 수집하기 위해 테이프의 표면을 긁어.
참고 : 공의 크기가 수집 될 bioparticles의 수에 따라 작게하거나 크게 할 수있다. - 조심스럽게 바늘의 끝을 방해하지 않고 현미경 아래에서 접착제로 텅스텐 바늘을 제거합니다. 바늘 수샘플 배치하는 동안 필요한 경우 랙에 장소.
- 현미경 무대에서 제조 된 겔 필름 (단계 1과 2) 샘플을 놓습니다. bioparticles 쉽게 볼 수있을 때까지 초점과 배율을 조정합니다. 수집됩니다 바이오 입자를 식별합니다.
주 : 유리 블록은 필요한 경우 슬라이드를 지원하는데 사용될 수있다. - 접착 공을 텅스텐 바늘을 검색하고, 관심있는 바이오 입자가있는 겔 필름 표면에 바늘을 배치합니다. 이 바이오 입자 (도 5b)와 접촉하도록 아래로 (접착제)의 바늘 끝을 누른다. 바이오 입자가 수집되었는지 확인하기 위해 바늘을 올립니다. 바이오 입자의 원하는 번호가 수집 될 때까지이 과정을 반복합니다.
- 현미경 단계에 준비 0.2 ml의 PCR 튜브를 놓습니다. 증폭 믹스를 함유하는 튜브의 아래쪽에 초점이되도록 배율을 조정한다.
- 조심스럽게 텅스텐 needl를 삽입바늘의 선단까지 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브로 전자가 증폭 믹스이다.
참고 : 현미경을 통해 보는 동안이 가장 수행됩니다. - 접착제를 용해하고 bioparticles이 솔루션 (그림 5C)로 해제 될 때까지 증폭 믹스 바늘을 잡습니다. 바늘을 제거 똑바로 0.2 ml에 배치하고 느슨하게 튜브 캡.
- 추가 샘플 수집 절차를 반복합니다. 샘플 사이에 쳐 미리 적신 알코올 (이소프로판올)와 텅스텐 바늘을 청소합니다.
4. 결합 Microvolume 핵산 분리 (직접 용해)과 염색체 짧은 탠덤 반복 (STR) 프로파일
- 지정된 PCR 증폭 또는 생물 안전성 후드 캐비닛을 용해 완충액 (원료 참조)를 준비한다. 5 μL 총 반응 볼륨에 대한 각각의 튜브에 용해 버퍼의 1.5 μl를 추가합니다. 단단히 닫기 관 뚜껑.
참고 : 0.2 ml의 튜브는 이미 3.5 μl를 포함증폭 믹스와 3 단계에서 수집 바이오 입자. - 도시 열 순환기 샘플 사이클링 다음 조건을 사용하여 증폭 된 샘플 : 15 분 동안 75 ° C를; 11 분 동안 95 ° C; 20 초와 3 분 59 ° C, 94 ° C의 34주기; 10 분 동안 60 ° C; 4 ° C를 유지.
- 단기 저장을위한 4 ° C에서 보관 증폭 제품.
5. 제품 감지 - 모세관 전기 영동 (CE)
- 96 웰 플레이트에서 (자료를 참조, 9.7 μL 탈 포름 아미드 0.3 μL 크기 기준) CE 실행 믹스의 10 μl를 추가합니다. 각 웰에 증폭 된 제품 또는 대립 사다리 1 μl를 추가합니다.
주의 : 포름 아미드 잠재적 돌연변이이며 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 화학 후드에서 처리되어야합니다. - 증폭 키트 설명서 또는 internall에 제조자가 지정한 전기 영동 조건을 사용하여Y는 조건을 검증.
- STR 분석 소프트웨어의 원시 데이터를 분석 할 수 있습니다.
Representative Results
남성 기증자 착용 셔츠 칼라 (100 % 폴리 에스테르)에서 발견 된 개별 서로 응집 bioparticles의 대표 이미지는 그림 6 (개별 bioparticles)와 그림 7 (응집되어 bioparticles)에 표시됩니다. bioparticles는 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 셔츠 칼라에서 발견되었다 : 트리 판 블루, 텅스텐 바늘과 수용성 접착제를 사용하여 bioparticle 샘플 컬렉션 복구 bioparticles의 직접 접촉, 염색을 통해 젤 필름에 셔츠 칼라에서 bioparticles의 전송 상기 5 μL 마이크로 볼륨 용해 / STR 증폭을 사용. STR 분석은도 6 및도 7은 개별 터치 DNA 항목 (20 / 단일 개별 bioparticles 20 뭉쳐 bioparticles)에서 분석 될 것이다 bioparticles의 대표적인 샘플링을 나타내는 도면. 각 이미지에 수집 된 bioparticle (들) (미크론) 길이와 폭 측정과 표시되어 있습니다. 퍼크수집 bioparticle (들) 각각으로부터 회수 STR 대립 유전자 entage 증거 이러한 유형 bioparticles로부터 획득 될 수있는 것으로 기대 성공의 가변도를 보여주기 위해 각 이미지 상에 제공된다. 도 6 및도 7에서 알 수있는 바와 같이 터치 DNA 시료로부터 회수 bioparticles은 크게 죽은 각질 세포 또는 죽어 따라서 시험하는 STR 프로파일 수집 각 bioparticle을 통하지이다. 이 셔츠 칼라 샘플의 경우, STR 프로필은 개별 bioparticles의 14/20 (70 %)에서 얻은 15/20 (75 %)이 bioparticles을 응집되어 있었다. 그러나 복구 된 프로파일의 각 증거물 값 범위 : 응집되어 bioparticle 프로필에 대한 개별 bioparticles 프로필과 3~100% 대립 유전자 복구를위한 3-97% 대립 유전자 복구를. 때문에 성공률의 변화로, 각 터치 DNA 항목에서 수많은 bioparticles의 수집을 권장합니다. 이것은 고도로 probati를 얻는 나은 기회를 보장STR 프로파일을했습니다.
셔츠 칼라에서 개별 bioparticle 샘플 중 하나에서 얻은 STR 프로파일은 그림 8에 표시됩니다 (프로파일이 시작된 bioparticle은 왼쪽에 표시됩니다). 거의 전체 STR 프로파일 (28 30 대립 유전자에서 하나의 궤적은, 참조 프로필에 비교 검증 얻어진 프로파일의 정확도를 드롭 아웃)이 개인 bioparticle로부터 얻은 것입니다. 얻어진 프로파일은 합리적으로 균형 잡힌 간 궤적 피크 높이가 높은 품질과 더 대립 자퇴하지 않습니다. 대립 형질 자퇴 불균형 피크 높이 아티팩트는 모두 자주 낮은 주형 DNA 샘플로 관찰된다. 셔츠 칼라에서 뭉쳐 bioparticle 샘플 중 하나로부터 수득 STR 프로파일은도 9에 도시된다. 얻었다 전체 STR 프로파일 (30/30 대립 기준 프로파일과 비교하여 검증 얻어진 프로파일의 정확도). 앞서 언급 한 바와 같이, STR 적 프로파일로부터 회수되지 않는다y를 bioparticle 수집. 단일 bioparticle (3 % 대립 유전자 복구, 1/30 대립 유전자)의 실패 DNA 프로파일 링의 예는 그림 10 (개별 bioparticle)에 표시됩니다. 이 개인 bioparticle 성공하지 못한 반면,이 샘플에서 bioparticles의 기증자의 높은 입증하는 STR 프로파일은 동일한 샘플에서 발견 한 다른 bioparticles에서 얻었다. 이는 동일한 개체에서 여러 단일 셀 / 덩어리의 샘플링을 수행 할 필요를 예시한다.
터치 DNA 증거에 대해 여기에 설명 된 개발 "스마트"분석 방법은 하나에서 입증하는 하나의 소스 프로파일을 복구하는 데 성공적으로 사용 된 다양한에서 "뭉쳐"bioparticles 개체 및 의류 품목 (예를 들어, 의자 팔걸이, 자동차 스티어링 휠, 휴대폰 터치 커피 컵, 담배, 펜, 셔츠, 반바지, 스웨터). 그러나, 중요한 것은,이 방법은 또한 남성 (D)의 검출 및 프로파일 링에 사용 된시뮬레이션 신체 접촉 / 폭행 혼합 시료에서 onor DNA (단일 소스) (예를 들어, 성폭행과 피해자의 침구와 피해자의 손목, 목이나 옷, 또는 연락처를 잡아 가해자).
그림 1 : bioparticle 수집 젤 필름 슬라이드의 준비. (A) 흰색 다시 보호 커버는 뒷면에 접착제를 노출 겔 필름의 조각에서 멸균 핀셋을 사용하여 제거한다. 겔 필름은 확고한 압력 유리 현미경 슬라이드에 부착된다. (B) 겔 필름 샘플은, 톱 클리어 보호막 무균 핀셋을 사용하여 제거된다 bioparticle 컬렉션에 사용될 준비가되면.
그림 2 : 겔을 사용 Bioparticle 모음다양한 기재에서이 -film. 겔 필름 슬라이드는 다양한 표면으로부터 bioparticles를 수집하는데 사용될 수있다. 겔 필름은 객체 또는 관심 표면과 직접 접촉하여 배치된다. 부드러운 압력 겔 필름 표면 상 bioparticles를 전송하기 위해인가된다. (A) 착용 의류 상품 (코트 칼라), (B)에서 bioparticles의 컬렉션 표시됩니다 (여행 커피 컵), 그리고 (C) 직접 사람의 피부 (남성 손목) 개체를 만졌다.
그림 3 :. Bioparticles (바지 다리 안쪽) 착용 의류 항목에 Bioparticles은 물체 표면과 직접 접촉을 통해 젤 필름으로 전송됩니다. Bioparticles는 "덩어리"또는 (빨간색 화살표로 표시) 개인 / 단일 bioparticles으로 찾을 수 있습니다.
그림 4 :. 젤 필름 슬라이드 bioparticles의 선택 염색 bioparticles의 더 나은 시각화를 들어, 젤 필름 샘플 트리 판 블루 염색을 할 수 있습니다. 겔 필름의 표면 전체 트립 판 블루 (A)에 의해 덮여있다. 1-2 분간 염색 후, 슬라이드는 부드럽게 과잉 기미가 슬라이드 (B)를 해제 실행할 수 있도록 경사. 멸균 수 (C)와 부드러운 플러딩 과잉 스테인을 제거하는데 사용될 수있다. 슬라이드가 공기 건조 후, 슬라이드는 적절한 염색 (D, E)를 보장하기 위해 현미경으로 볼 수있다. 참고 :. 모든 bioparticles은 (색 즉, 파랑) 염색되어 나타납니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 5 : Bioparticle 수집 및 분석. 수용성 웨이브 납땜 테이프 (A) 소량 (또는 "공") ( "접착제") 부드러운 긁어서 텅스텐 바늘의 팁에 수집된다. (B) 접착 후 겔에 터치 관심 bioparticles를 수집하기 위해 필름 표면. 하나 또는 여러 개는 단일 bioparticles 접착제 공 수집 될 수있다. (C) 소정 bioparticles가 수집 된 후에, 바늘의 선단이 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브에 증폭 믹스에 배치된다. 이 용해 될 때까지 바늘이 액체에서 개최되고 용액에 bioparticles의 방출이 관찰된다. 수집 프로세스의 모든 단계가 성공적으로 bioparticle 수집 및 전송을 보장하기 위해 수행 현미경으로 볼 수 있습니다. LAR를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 게르 버전.
그림 6 :. 셔츠 칼라 샘플에서 개별 bioparticles Bioparticles는 남성 기증자 착용 셔츠 칼라의 내부에서 겔 필름을 사용하여 복구 하였다. bioparticles이 표시됩니다 트리 판 블루와 샘플에서 확인 된 20여 개인 bioparticles의 이미지를 사용하여 염색 하였다. 각각의 이미지에서 수집 된 bioparticle은 (; 프로파일이 회복되지 않은에서 bioparticles를 나타내는 검은 동그라미의 프로필을 회수하는 bioparticles를 나타내는 빨간색 원) 원으로. %의 대립 유전자 복구 (수 30 중 관찰 대립 유전자의 개수)의 프로필을 회수하는 bioparticle의 이미지 위에 표시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 셔츠 칼라 샘플에서 응집되어 bioparticles Bioparticles는 남성 기증자 착용 셔츠 칼라의 내부에서 겔 필름을 사용하여 복구 하였다.. bioparticles이 표시됩니다 트리 판 블루와 샘플에서 확인 된 20여 뭉쳐 bioparticles의 이미지를 사용하여 염색 하였다. . 프로파일이 가능한 30 중 퍼센트 대립 유전자 복구 (관찰 대립 유전자의 수)를 복구되지 않은에서 bioparticles를 나타내는 검은 색 원, 각 이미지에서 수집 된 bioparticle 프로파일을 회수했다있는 bioparticles를 나타내는 (빨간색 원을 원으로 프로필을 회수하는 각 bioparticle에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 남성 셔츠 칼라에서 단일 bioparticle에서 얻은 염색체 STR 프로필 상 염색체 STR 프로필이 5 ㎕를 직접 용해 / 증폭 반응을 이용하여 (왼쪽 그림) 단일 bioparticle로부터 얻은 것입니다.. 이 프로파일의 정확성은 도너 기준 샘플과 비교하여 결정 하였다. 다섯 염색체 STR 유전자좌와 성별 감정 (성 결정) 공동 증폭 단일 반응과 모세관 전기 영동에 의해 분리된다. 결과는 electropherogram 여기에 표시됩니다. 대립 유전자 숫자는 각 현장에서의 각 피크 아래 지정합니다. x 축이 단편 크기 (염기쌍, BP) 및 Y 축 나타내는 신호 강도를 나타냅니다. (RFU 상대 형광 단위 각 해당 대립 유전자 수에 따라 제공)을 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
그림 9 : 남성 셔츠 칼라에서 뭉쳐 bioparticle에서 얻은 염색체 STR 프로필 상 염색체 STR 프로필이 5 ㎕를 직접 용해 / 증폭 반응을 이용하여 (왼쪽 그림) 덩어리로 bioparticle로부터 얻은 것입니다.. 이 프로파일의 정확성은 도너 기준 샘플과 비교하여 결정 하였다. 다섯 염색체 STR 유전자좌와 성별 감정 (성 결정) 공동 증폭 단일 반응과 모세관 전기 영동에 의해 분리된다. 결과는 electropherogram 여기에 표시됩니다. 대립 유전자 숫자는 각 현장에서의 각 피크 아래 지정합니다. (각각 대응 대립 번호로 제공 RFU 상대적인 형광 단위) x 축은 신호 세기를 나타내는 단편 크기 (염기쌍, BP)과 y 축을 나타낸다.페이지 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 :. 수집 bioparticle에서 얻은 염색체 STR 프로파일을 얻을 수있는 실패의 예 왼쪽 그림 개별 bioparticle은 셔츠 칼라 젤 필름 샘플에서 수집되었다. (오른쪽 그림) STR 얻어진 프로파일로부터 알 수있는 바와 같이, (가능한 30 중) 하나의 대립 유전자를 얻었다. 대립 유전자 숫자는 각 현장에서의 각 피크 아래 지정합니다. x 축 신호 강도 나타내는 단편 크기 (염기쌍, BP)과 y 축을 나타냅니다. (RFU 상대 형광 단위 각 해당 대립 유전자 수에 따라 제공)를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서 우리는 수집 및 터치 DNA 증거에서 발견 bioparticles의 향상된 유전자 분석 방법을 설명했다. 접촉 물체와 표면, 착용 의류 항목 또는 직접 인간의 피부에서 젤 필름을 통해 생물학적 물질 (즉, bioparticles)의 1) 수집, 회수 된 생물학적 물질의 2) 현미경 검사는 잠재적 인 수집을 보장하기 위해 : 개발 방법은 다음과 같은 포함 인간의 생체 물질 및 수용성 접착제를 사용하여 단일 또는 몇 bioparticles 3) 미세 조작 및 microvolume (5 μL) 원스텝 용해 / 증폭 반응을 사용하여 수집 bioparticles 4) 염색체 DNA-STR 프로파일. 원스텝 폐쇄 반응 튜브의 사용은 추가적인 샘플 조작 또는 다른 반응 튜브에 양도 오염 시료 손실 가능성을 감소시킨다. 향상된 원스텝 microvolume (5 μL)의 용해는 / STR 증폭 반응은 전체 또는 probativ의 복구를 허용전자 STR 단일 또는 몇 bioparticles의 기증자의 프로필. 이 방법은 단일 및 멀티 소스 터치 DNA 증거 (예를 들면, 착용 의류 항목 및 기타 가정 용품, 감동 / 처리 객체와 표면, 피부 / 피부 혼합물)에서 하나의 소스 STR 프로파일을 얻기 위해 개발되었다. 이 성공적 모의 물리적 공격 혼합물 샘플 남성 기증자의 검출을 위해 사용되었다.
이러한 접근 방식은 더욱 이러한 가해자에서 불과 몇 bioparticles 피해자의 생물학적 물질의 압도적 인 양의 사이에 존재하는 것입니다있는 그 / 그녀의 가해자를 긁적 피해자로 추가 체액 / 조직 혼합물 시나리오에서 평가 될 수있다. 현재 연구 개발이 접근법은 단일 bioparticle 수준에서 분석을 허용 이후 또한이를 중개자 표면 처에 DNA 프로파일을 전사하는 이차 전사 14-19의 본질 및 범위의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용될 수있다다른 표면 객체 또는 사람 20 CE, 개체 또는 사람. 차 전사의 분석 블라인드 보라고 방식은 보조 기증자 물질의 미량을 식별하는 데 실패 할 수 있습니다. 여기서 개발 된 방법은 단일 또는 몇 bioparticles의 분석을 허용하고, 따라서 결과가 기본 도너로부터 생체 물질의 압도적 인 양의 존재에 의해 혼동되지 않는다. 이러한 가해자로부터 피부 세포의 미량의 긍정적 인 인식이 중요 할 수있는 곳 질 디지털 침투를 포함하는 것과도 성폭력의 경우 추적 생물학적 물질의 분석에 영향을 미칠 수있다이 연구에서 개발 된 방법은 성적 접촉을 설정하려면 발생했습니다.
겔 필름 샘플에서 bioparticles의 수집이 어렵고 복잡한 조작을 포함하지 않지만, SU을 보장하기 위해 매우 세 심하게 수행해야하는이 절차의 중요한 단계가 있습니다하류 반응 용기에 bioparticles의 ccessful 전송. 수용성 접착제 bioparticles의 컬렉션이 사용 된 접착제 "공"의 크기에 따라. 즉, 높은 배율 (~ 200-300X)의 실체는 관심 만 bioparticles가 수집되도록 (현미경으로 볼 수 있어야합니다 모두 생물학적 및 비 생물학적 물질 (예를 들면, 섬유, 먼지 등)을 포함 할 수있는 추가 주변 재료를 수집 할 가능성이있다. 의도 추가적인 bioparticles의 컬렉션은 혼합 된 DNA 프로파일의 회복 될 수있다. 비 - 생물학적 물질의 컬렉션 여러 bioparticles 동일한 접착제 "공"을 수집하는 경우에는 마이크로 볼륨 용해으로 억제제를 도입 할 수 / STR 반응., 이전에 수집 bioparticles 접착제로 부착되기위한 가능성이있다.이 자주 관찰되지 않고, 발생 때 bioparticl 더 많은 수의ES 수집 (예를 들어, 50) 하나의 접착제 "공"와. bioparticles의 많은 수를 대상으로하면, 적은 수의 다수 bioparticles 모음이 이루어지는하지만 모두 동일한 0.2 ㎖의 튜브에 옮기고 것이 권장된다. bioparticles 수집 되었으면 케어 현미경 스테이지로부터 겔 필름 슬라이드와 바늘의 선단이 방해되지 않도록 0.2 ㎖의 튜브의 배치의 제거시주의해야한다. 0.2 ㎖의 튜브의 아래쪽 증폭 믹스 바늘의 선단부의 배치 중에, 바늘의 선단이 관의 측면에 재료의 손실을 피하기 위해 관의 측면과 접촉해서는 안된다. 접착제의 용해가 빠르며 전형적 동안 (~ 30 초 이하인 접착제 "공"의 크기에 따라) 수는 현미경 시험 동안 모니터링, 바늘의 선단이 서서히 그 완료를 보장하기 위해 증폭 믹스 제거해야 가용화접착제 달성되었다. 접착제가 완전히 용해되지 않은 경우, 바늘이 완전히 용해 할 수 있도록 액체로 복귀 할 수있다.
여기에 설명 된 프로토콜은 법정 생물학적 증거에서 bioparticles과 인간의 세포와 함께 사용하기에 최적화되어있다. 선택된 용해 버퍼는 선택된 STR-DNA 증폭 키트와 호환된다. 적합한 대안 용해 버퍼가있을 수 있지만, 다운 스트림 분석 세포 용해 및 호환성 측면에서 효율성은 사용자가 검증되어야한다. 또한,이 프로토콜에 설명 STR 증폭 키트 및 증폭 사이클 수는 단일 또는 소수의 bioparticles 함께 사용하기 위해 최적화되었다. 보고 증가 견고성과 감도 차세대 STR 증폭 키트는 선택한 단일 또는 몇 bioparticles에서 높은 품질의 STR 프로파일의 회복이 발생할 것으로 입증되었습니다. 동안 다양한 추천의 앰프와 수많은 다른 STR 키트,양이온 사이클 번호들은 적절한 감도를 가질 수 없으며, 따라서 적절하게 이러한 프로토콜에 사용하기 전에 평가 될 필요가 가능하다.
단일 또는 몇 bioparticles에서 복구 STR 프로파일에 대한 설명 방법의 성공적인 사용에도 불구하고, 프로필 회복의 성공률은 100 %되지 않습니다. 따라서 일부 샘플에 대한 제한된 부분 DNA 프로파일 또는 전혀 프로필을 관찰 할 수있다. 이것은 결론적으로 인해 시각적으로 다공질 재료로서 가장 bioparticles를 식별 할 무능력 피할 수없고, 반응 용기에 전달하기 전에 수집 bioparticles 또는 접착제의 샘플 재료의 손실이 핵 물질의 잠재적 인 성능 저하 상태. 따라서, 각 터치 DNA 항목에 대한 하나의 bioparticle 샘플의 분석은하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 자주 개인 겔 필름 샘플 20 샘플 세트를 수집하고 적합한 STR 프로필을 얻을 수없는 경우 필요에 따라 추가 샘플 세트를 수집합니다. 티microvolume 반응이 (하나의 표준 반응 부피와 유사한 또는 더 낮은 비용의 추가 샘플을 수집 할 수있는 기회를 제공하지만 모음 그가 유일한 제한은, 겔 필름 샘플 (분석의 예상 비용에 존재하는 생물학적 물질의 양 예를 들어, 25 μL).
개발 된 DNA 프로파일 링 방법은 여기에 설명하는 특성, 분석 및 터치 DNA 샘플에서 발견 추적 생물학적 재료의 해석에 분자 기반의 접근 방식을 제공합니다. 그러나, 생체 물질의 도너의 도너 (즉, STR 프로파일)의 판정에 더하여 회수 bioparticles로부터 획득 될 수있는 추가의 유전 정보가 존재한다. 기원 조직 또는 체액 소스 (예, 타액 대 피부)가 범죄 수사에 결정적 콘텍스트 정보를 제공 할 수있다. 이러한 판정없이 기원 조직 공급원의 모호함 수 EXPLO범죄의 대안 상황으로 한정된 범위 (예를 들어, 체액이 퇴적되었을 수있는 방법을) 제안 할 수있다. 여기에 설명 bioparticle 수집 및 분리 프로토콜 (예를 들면, 구강, 질) 조직 소스 식별에 사용하기위한 마이크로 볼륨 전사 (RT)를 역방향 포함 전략 (mRNA를 21-30 프로파일) bioparticles 또는 다른 세포를 수집하기 위해 사용될 수 있고 증폭 반응. 상기 최적화는 또한 터치 DNA 증거로부터 bioparticles 포함 동일한 시료로부터 세포 유형 식별 (RNA) 및 STR 프로파일을 허용하는 DNA / RNA 공동 분리 전략을 개발하는 것이 가능할 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
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