Summary
Здесь мы опишем оптимизированный и эффективную стратегию удаления для сбора биологических частиц, присутствующих в ощупь ДНК »образцы, вместе с усовершенствованного протокола амплификации с участием один шаг 5 мкл микро-объем лизиса / амплификации СПО, чтобы разрешить восстановление короткие тандемные повторения (STR) профили донором (ами) био-частиц.
Abstract
Профили ДНК может быть получена из "сенсорным ДНК» данных, которая содержит микроскопические следы человеческого биологического материала. Современные методы восстановления след ДНК Наймите ватные тампоны или клейкой лентой, чтобы попробовать области интересов. Однако такое "слепой свабирование 'подход совместно образец клеточного материала из разных людей, даже если клетки физических лиц расположены в географически различных местах по этому пункту. Таким образом, некоторые из смесей ДНК, возникающих в образцах сенсорных ДНК искусственно созданный самой моечные. В некоторых случаях, ДНК жертвы могут быть найдены в значительном превышении таким образом маскируя ДНК любого потенциального преступника.
Для того, чтобы обойти проблемы с помощью стандартных методов восстановления и анализа, мы разработали более низкую стоимость, метод «умный анализ», что приводит к повышению генетического анализа доказательств сенсорный ДНК. Мы описываем оптимизировалид эффективной стратегией восстановления микроманипуляция для сбора биологических частиц, присутствующих в образцах с сенсорным ДНК, а также повышенной стратегии амплификации с участием один шаг 5 мкл усиление микрообъеме лизиса / STR, чтобы обеспечить восстановление профилей STR от донора био-частиц (ы). Использование индивидуальных или несколько (например, "комки") bioparticles результаты в способности получить профили одного источника. Эти процедуры представляют собой альтернативные расширенные методы для выделения и анализа отдельных bioparticles из судебно-медицинской экспертизы сенсорный ДНК. Хотя это и не нужно в каждом судебно-медицинской экспертизы, метод может быть весьма полезным для восстановления источника преступник профиль одном ДНК в случаях, связанных с физическим нападением (например, удушение), что не всегда возможно с использованием стандартных методов анализа. Кроме того, стратегии, разработанные здесь предлагают возможность получить генетическую информацию на одном уровне клетки из различных OTher несудебных след биологический материал.
Introduction
Сенсорный ДНК форма следа биологического доказательств, которые непосредственная передача клеточного материала (например, пролить клеток кожи) от физического лица на объект или другого лица во время физического контакта 1. Возможность получения профилей ДНК из различных затронутых объектов (документов, постельных принадлежностей, обуви, оружия, контейнеров для питья, ручки, портфель ручки) уже сообщалось в литературе 2-9.
Решающим фактором в анализе доказательств сенсорный ДНК является успешное восстановление следа биологического материала, присутствующего. Сенсорный свидетельство ДНК, как правило, собирают моечные проверяемый участок стерильным ватным тампоном (именуемые "слепой-свабирования"). Используя этот подход, природа собранного биологического материала не известна, и выборка обобщенной области выполняется. Наличие поверхностных канавок или щелей могут препятствовать успешное восстановление зачастую уже небольшим количеством бигические материалы присутствует. Кроме того, "слепой швабры» подход обязательно будет со-образец клеточный материал из разных людей, чьи клетки присутствуют по этому вопросу, даже если клетки физических лиц находятся в пространственно различных местах по этому пункту. Восстановление смешанных профилей ДНК, которые часто сложно решить, особенно при образцов ДНК с низким шаблонов, часто наблюдается 8,10,11 и во многих случаях будет косвенные артефакт самого процесса моечные. Если только малое количество материала присутствовала в одном из доноров, стандартные методы экстракции и анализа может не восстановить профиль из малой силы. Кроме того, тип тампона или он используется сухой или влажный (предварительно смоченную стерильной воде), может влиять на количество биологического материала, который собирают из-за различий в поглощающей и адсорбционной и эффективности выпуска биологического материала 12. Standard методы добычи может привести к дополнительным потерям образца из-за обязательного физической манипуляции шагов образец или передачи образца.
Как описано выше, простые методы смывов для восстановления биологического материала может привести к потере следовых количеств биологического образца, а также повышенной частотой возникновения смешанных профилей из-за сбоя в отдельных индивидуальных биологических компонентов. Таким образом, мы стремились разработать более селективные и эффективные стратегии восстановления для сбора клеточных микрочастиц, находящихся на затронутых объектов. Разработана стратегия для анализа биологического материала от дачи показаний сенсорный ДНК (называемый здесь "bioparticles" в связи с тем, что ядро не всегда видны, так как большинство из клеток в наружной эпидермального слоя кожи являются мертвые или умирающие кератиноцитов 13) включает в себя следующее: 1) сбор биологического материала (то есть, bioparticles) через гель-пленки FRом коснулся объекты и поверхности, изношенные предметы одежды или прямой человеческую кожу, 2) микроскопическое исследование извлеченного биологического материала, чтобы обеспечить сбор потенциального биологического материала человека, и 3) Микроманипуляция из одного или нескольких биологических частиц с использованием растворимого в воде кле, и 4) аутосомно-ДНК-STR профилирование, собранных био-частиц с помощью микрообъем (5 мкл) на один шаг лизиса / реакции амплификации.
Эта процедура предлагает многочисленные преимущества по сравнению с традиционно используемыми методами анализа. Восстановление bioparticles с помощью гель-пленку позволяет микроскопическое исследование настоящее биологического материала в образце предварительного анализа. В то время как большинство bioparticles, извлеченных из доказательств сенсорный ДНК не может быть ядерных клеток, что делает его более трудным для определения, какие и сколько био-частицы должны быть выбраны, микроскопическое исследование этих образцов до анализа предоставляет возможность для поиска ядерных клеток Таким образом, maximizчисле вероятность восстановления профиля ДНК. Коллекция bioparticles с использованием растворимого в воде клеем помощь микроманипуляция позволяет прямую передачу целевых bioparticles в реакционных труб. Эта процедура визуализировали под микроскопом, чтобы обеспечить успешную передачу биологического материала. Уменьшается или микрообъема реакционную увеличивает чувствительность при одновременном снижении стоимости анализа на образце. Это позволяет анализировать увеличения количества образцов из отдельной части доказательств. Вследствие разнообразия генетического состояния биологических частиц в контакте свидетельства ДНК, несколько выборок из отдельных элементов рекомендуется.
Здесь мы демонстрируем успешное применение разработанных протоколов для получения высокой доказательственной генетические профили доноров биологического материала в контакте доказательств ДНК. Развитыми сбора bioparticle и ДНК методы профилирования обеспечить всестороннюю проверку на «умные» (то есть, конкретные, измеримые, Аттаобразимой, реалистичными и своевременными) молекулярная подход к характеристике, анализа и интерпретации трассировки биологического материала. В то время как первоначально разработана для применения в судебно-медицинской экспертизы доказательств сенсорный ДНК, стратегии, разработанные здесь могут быть применены к другим источникам биологического материала и дают возможность получить индивидуальные идентифицирующую информацию на одном уровне клетки.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: жидкости тела были собраны у добровольцев с использованием процедуры, утвержденные в университете ведомственного комитета Центральной Флориды. Письменное информированное согласие было получено от каждого донора.
1. Сбор Bioparticles от коснулись объектов и поверхностей
- Вырезать гель-пленку до нужного размера. Убедитесь, что это подходящий размер для предметное стекло микроскопа используется в качестве твердого носителя. Например, для "х 1" стекло 3, использовать размер гель-пленки 2 "х 0,75".
Примечание: длина и ширина материала может быть уменьшена, если это желательно, но не должна превышать этот размер. - Удалите белую подложку с гель-пленку и прикрепите гель-пленки на предметное стекло (рис 1А). Плотно прижмите для обеспечения полного вложение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует ясно верхний защитный слой, который не должен быть удален, чтобы позволить применяемое давление по части гель-филм, не загрязняя поверхность геля-пленки. Приготовленный гель-пленки скользит (с защитным слоем прилагается) можно хранить при комнатной температуре до тех пор, пока это необходимо. - Снимите прозрачную верхнюю защитную пленку с гель-пленки с использованием стерильных пинцетов, когда готов к использованию (рисунок 1b) образец гель-пленки. Поместите поверхность гель-пленки в непосредственном контакте с желаемым объектом или коснулась поверхности (рисунок 2). Нанесите небольшое количество давления, чтобы обеспечить эффективную передачу био-частиц в гель-пленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если слишком много давления применяется, предметное стекло может разбиться.
Примечание: Несколько выборки из того же объекта или поверхности могут быть собраны на одной и той же части гель-пленки. - Подтверждение передачи био-частиц на гель-пленки (фиг.3), поместив слайд на стереомикроскопа (транс или эпи-освещение может быть использовано). Использование Увеличение ~ 20X для лучшего просмотра больших областей гель-пленку, а увеличение в ~ 200X для лучшего VIЮинг отдельные био-частиц.
- Храните образец слайда гель-пленки при комнатной температуре в закрытой коробке слайд или использовать сразу для окрашивания и / или коллекцию био-частиц.
2. Необязательно Окрашивание Bioparticles, чтобы помочь в визуализации
- Поместите образец слайд гель-пленке, полученной на стадии 1 на слайд-окрашивания стойки над раковиной.
- Использование одноразового передачи пипетки, покрывают всю поверхность геля фильм с трипанового синего красителя (рис 4а). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1-2 мин.
- Удалите излишки пятно, наклоняя слайд, чтобы пятно для отвода в раковину (рис 4В).
ПРИМЕЧАНИЕ: слайд можно промыть, осторожно наводнения стерильной воды с использованием одноразового передачи пипетки, если это необходимо (рис 4C). - Разрешить слайд высохнуть на воздухе, прежде чем приступить к изоляции био-частиц. Просмотр слайд с использованием стереомикроскопа (~ 20X для общего просмотра и ~ 200-300X к VМЭН отдельные bioparticles), чтобы обеспечить надлежащее окрашивания (рис 4D-E).
ПРИМЕЧАНИЕ: слайд может храниться при комнатной температуре в закрытой коробке слайдов.
3. Выделение Bioparticles интерес для анализа
- Поместите необходимое количество 0,2 мл ПЦР пробирок в стойку и маркировать трубы надлежащим образом.
- Подготовьте смесь STR усиления (см список материалов) в отведенном для ПЦР-амплификации капотом или биобезопасности кабинета. Vortex мастер хорошо перемешать и кратко центрифуги в мини-центрифуге.
- Объем усиления смеси, необходимого на образце 3,5 мкл; подготовить соответствующий объем основной смеси для требуемого количества образцов.
- Внесите 3,5 мкл усиления смеси в каждую 0,2 мл трубки. Закрывают каждую пробирку свободно.
- Место кусок двойного скотча на чистую предметное стекло микроскопа или непосредственно на стеклянную блока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация будет использоваться для хранения0,2 мл трубки на месте во время отбора проб. - Место кусок двойного скотча на чистую предметное стекло микроскопа. Место кусок водорастворимого волны припоя ленты в верхней части двойного скотча.
Примечание: Этот слайд можно хранить в эксикаторе для использования в будущем. - Поместите первый трубки 0,2 мл на двойной горкой скотч или блока, полученного на стадии 3.4. Установка эту трубку в сторону, пока образец не собирают.
- Поместите водорастворимый волны припоя ленты слайд под микроскопом (малом увеличении). С помощью кончика иглы вольфрама, осторожно очистить поверхность ленты, чтобы собрать небольшое количество (или "мяч") клея на конце иглы (фиг.5А).
Примечание: размер шара может быть малой или большой зависимости от количества bioparticles, которые будут собраны. - Осторожно снимите вольфрамовой иглы с клеем из-под микроскопом, не нарушая кончик иглы. Игла можетбыть место в стойке при желании во время установки образца.
- Поместите подготовленный образец гель-пленка (от шагов 1 и 2) на столик микроскопа. Отрегулируйте фокусировку и увеличение до тех пор, bioparticles не может быть легко просматривать. Определить био-частиц, которые будут собираться.
Примечание: стекло блок может быть использован для поддержки слайд, если это необходимо. - Получить вольфрамовой иглы с клейкой мяч, и поместите иглу на поверхность геля фильм, где био-частицы, представляющие интерес, расположен. Пресс кончик иглы (с клеем) вниз так, что он находится в контакте с био-частиц (фиг.5В). Лифт иглу, чтобы гарантировать, что био-частиц была собрана. Повторите этот процесс, пока нужное количество био-частиц не была собрана.
- Поместите подготовленный 0,2 мл ПЦР-пробирку на столике микроскопа. Регулировка увеличения таким образом, что в нижней части трубки, содержащей смесь амплификации находится в фокусе.
- Осторожно вставьте вольфрама needlе в 0,2 мл ПЦР-пробирку до кончика иглы в смеси амплификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего проводить во время просмотра через микроскоп. - Удерживая иглу в смеси усиления, пока клей не растворится и bioparticles не будут освобождены в раствор (рис 5в). Снимите иглу, положите ее 0,2 мл в вертикальном положении и свободно колпачок трубки.
- Повторите процедуру сбора дополнительных образцов. Очистите вольфрамовой иглы с предварительно увлажненных алкоголя (изопропанол) салфетки между образцами.
4. Комбинированный микрообъем нуклеиновых кислот Выделение (Direct лизис) и аутосомно-Short Tandem Repeat (STR) Профилирование
- Подготовка буфера для лизиса (см материалами), в назначенный ПЦР-амплификации капотом или биобезопасности кабинета. Добавить 1,5 мкл буфера для лизиса в каждую пробирку по 5 мкл общего объема реакционной. Закрыть трубка крышки плотно.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,2 мл трубки уже содержат 3,5 мклусиление смеси и сбора био-частицы с шага 3. - Образцы место в термоциклер и усиливать образцы на основе следующих условий Велоспорт: 75 ° С в течение 15 мин; 95 ° С в течение 11 мин; 34 циклов при 94 ° С в течение 20 сек и 59 ° С в течение 3 мин; 60 ° С в течение 10 мин; и 4 ° C держать.
- Усиления магазин продукты на 4 ° С в течение кратковременного хранения.
5. Обнаружение продуктов - капиллярного электрофореза (CE)
- В 96-луночного планшета, добавить 10 мкл CE работающей смеси (9,7 мкл деионизированной формамида и нормальный размер 0,3 мкл, см Материалы). Добавить 1 мкл продукта амплификации аллелей или лестницы в каждую лунку.
ВНИМАНИЕ: Формамид является потенциал мутагенным и должны быть обработаны в химической капотом, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты. - Используйте электрофоретических условиях, указанных изготовителем в руководстве комплекта усиления или internallу подтверждено условий.
- Анализ исходных данных с программным обеспечением для анализа УЛ.
Representative Results
Характерные изображения от частных лиц и скомканным bioparticles, которые были извлечены из воротника рубашки (100% полиэстер) носили мужчины-донора, показано на рисунке 6 (индивидуальные bioparticles) и рис 7 (скомканным bioparticles). В bioparticles были извлечены из воротника рубашки с использованием протокола, описанного здесь: передача bioparticles от воротника рубашки гель-пленки при непосредственном контакте, окрашивание восстановленных bioparticles с трипановым синим, сбор образцов bioparticle с помощью вольфрамовой иглы и растворимый в воде кле и STR анализ с использованием амплификации 5 мкл микро-объем лизиса / STR. 6 и 7 представляют собой типичный выборки bioparticles, которые будут проанализированы с отдельного элемента сенсорной ДНК (20 одиночных / индивидуальных bioparticles и 20 слипаются bioparticles). Bioparticle (ы), собранный в каждом изображении помечены измерений длины и ширины (в микронах). PERCentage СТО аллелей извлекали из каждой собранной bioparticle (ов) предоставляется по каждой отдельной изображения для демонстрации различной степенью успеха, который может быть как ожидается, будут получены из bioparticles с этим типом данных. В bioparticles, выделенные из образцов сенсорных ДНК в значительной степени мертвы или умирают кератиноциты и, следовательно, Доказательственная профиль STR не получено от каждого bioparticle собранной, как можно видеть на фиг.6 и 7. Для этой футболке образца воротник, профили STR были получены из 14/20 (70%) из отдельных bioparticles и 15/20 (75%), тяжело ступая bioparticles. Тем не менее, каждый из восстановленных профилей колеблется в доказательственной ценности: 3-97% восстановление аллель для отдельных bioparticles профилей и 3-100% восстановления аллеля для скомканным профилей bioparticle. Из-за изменчивости показателей успешности, коллекция многочисленных bioparticles из каждого сенсорного элемента ДНК рекомендуется. Это обеспечивает лучший шанс получения высокой probatiве профиль, ул.
Профиль STR получены из одного из отдельных образцов bioparticle от воротника рубашки показано на фиг.8 (bioparticle, из которого возникла профиль показан слева). Почти полный профиль STR (28 из 30 аллелей, один локус выпадают, точность полученного профиль проверена путем сравнения с опорным профилем) получали из этого отдельного bioparticle. Получены профиль высокого качества с разумной сбалансированных высот пиков между локуса и не аллельный не выпадают. Аллельный выпадают и несбалансированные артефакты высота пика оба часто наблюдается в образцах ДНК, низкая шаблона. Профиль STR получены от одного из скомканным образцов bioparticle из воротника рубашки показано на рисунке 9. А полный профиль STR (30/30 аллели, точность полученного профиль проверяется путем сравнения с эталонным профилем) был получен. Как упоминалось ранее, раздел STR не извлекают из теху bioparticle собираются. Пример неудачного профилирования ДНК одного bioparticle (3% восстановления аллель, 1/30 аллели) показана на рисунке 10 (индивидуальное bioparticle). В то время как этот человек bioparticle не была успешной, высоко доказательную STR профили донора из bioparticles в данном примере, были получены от других bioparticles выделенных из того же образца. Это свидетельствует о необходимости выполнять несколько выборок одной клетки / комок из того же объекта.
Разработанные «умные» методы анализа, описанные здесь для сенсорного анализа ДНК были успешно использованы для восстановления доказательную профили одного источника, из одного и "слипаются" bioparticles из различных коснулся объекты и предметы одежды (например, стул подлокотники, автомобиль рули, сотовые телефоны, кофейные чашки, сигареты, ручки, футболки, шорты, свитера и). Тем не менее, важно, этот подход был также использован для обнаружения и профилирование мужской DОнор ДНК (единственным источником) в моделируемых образцов физический контакт / нападение смеси (например, преступник схватил потерпевшего запястье, шее или одежду, или контакт с постельными принадлежностями жертвы, как и в сексуальных посягательствах).
Рисунок 1: Подготовка гель-пленок слайдов для сбора bioparticle. (А) белый обратно защитный кожух удален с помощью стерильных пинцетов из куска гель-пленки, чтобы обнажить клейкий слой. Гель-пленку затем присоединились к предметное стекло микроскопа с твердым давлением. (B) Если образец гель-пленку готов быть использованы для сбора bioparticle, верхний понятно защитная пленка удаляется с помощью стерильных пинцетов.
Рисунок 2: Bioparticle коллекции, используя гельнитрида тантала из различных субстратов. Гель-пленки скользит может быть использован для сбора bioparticles из множества поверхностей. Гель-пленку помещают в непосредственном контакте с объектом или поверхностью, представляющей интерес. Легкий прикладывают давление с целью передачи bioparticles на поверхность гель-пленки. Коллекция bioparticles из () носили предметы одежды (пальто воротник), (B) коснулся объекты (проезд чашка кофе), и (C) прямое человеческая кожа (мужчина запястье) показаны.
Рисунок 3:. Bioparticles на изношенных предмета одежды (внутри штанины) Bioparticles передаются гель-пленки при непосредственном контакте с поверхностью объекта. Bioparticles можно найти как «сгустки» или отдельных лиц / одиночных bioparticles (указано красными стрелками).
Рисунок 4:. Дополнительное окрашивание bioparticles на гель-пленки слайдов для лучшей визуализации bioparticles образцы гель-пленка может быть окрашивали трипановым синим красителем. Вся поверхность геля-пленки покрыта трипанового синего (A). После 1-2 мин окрашивания, слайд мягко наклонена, чтобы позволить превышение пятно бежать слайд (B). Легкий затопление стерильной водой (C) может быть использован для удаления избытка пятно. После ползун сушат на воздухе, ползун можно рассматривать под микроскопом, чтобы обеспечить надлежащее окрашивание (D, E). Примечание:. Не все bioparticles будет выглядеть окрашенных (т.е. синего цвета) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
OAD / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
Рисунок 5: Bioparticle сбор и анализ. (А) небольшое количество (или "шарик") водорастворимого волны припоя ленты ("клей") собирают на кончик вольфрамовой иглы, осторожно выскабливание. (B) клей, то прикоснулся к гель- поверхность пленки с тем, чтобы собрать bioparticles, представляющих интерес. Индивидуальные или несколько bioparticles может быть собрано с одной липкой шара. (С) После того, как желаемые bioparticles были собраны, кончик иглы помещают в амплификации смеси в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Игла проводится в жидкости, пока она не растворяется и наблюдается выпуск bioparticles в раствор. Все шаги в процессе сбора осуществляется и рассматривается под микроскопом, чтобы обеспечить успешное сбора и передачи bioparticle. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть LARGER версия этой фигуры.
Рис. 6: Отдельные bioparticles в образце воротник Bioparticles были восстановлены с помощью гель-пленку с внутренней стороны воротника рубашки носили мужской донора. В bioparticles окрашивали трипановым синим и изображения двадцати различных индивидуальных bioparticles выявленных в составе выборки показаны. В каждом изображении, bioparticle, что было собрано кружком (красные круги, указывающие bioparticles, в котором профиль восстановлены; черные круги, указывающие bioparticles, в котором профиль не восстановился). Процент извлечения аллель (число наблюдаемых аллелей из возможных 30) отображается над изображением bioparticle, из которого профиль восстановлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: скомканным bioparticles в образце воротник рубашки Bioparticles были восстановлены с помощью гель-пленку с внутренней части воротника рубашки носили мужчины донора.. В bioparticles окрашивали трипановым синим и изображения двадцати различных скомканным bioparticles выявленных в составе выборки показаны. В каждом изображении, bioparticle, что было собрано кружком (красные круги, указывающие bioparticles, в котором профиль восстановлены; черные круги, указывающие bioparticles, в котором профиль не выздоровел восстановление процентов аллель (количество наблюдаемых аллелей из возможных 30). показана для каждой bioparticle, из которого профиль восстановлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8: Профиль аутосомно STR получены из одного bioparticle из мужского воротника рубашки профиль аутосомно STR был получен из одного bioparticle (показанной слева) с использованием 5 мкл прямой лизиса / реакция амплификации.. Точность этого профиля определяли путем сравнения с опорным донор образца. Пятнадцать аутосомно-STR локусов и амелогенин (определение пола) являются одним из усиливается в одной реакции и разделены капиллярного электрофореза. Результаты отображаются здесь в качестве electropherogram. Аллелей цифры обозначение под каждой вершины в каждом локусе. X-ось представляет размер фрагмента (пар оснований, BP) и у-ось представляет интенсивность сигнала (РФС относительно флуоресценции единиц, при условии, под каждым соответствующим номером аллеля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этот показатель.
Рисунок 9: Профиль аутосомно STR получены из слипаются bioparticle из мужского воротника рубашки профиль аутосомно STR получали из слипаются bioparticle (показанной слева) с использованием 5 мкл прямой лизиса / реакция амплификации.. Точность этого профиля определяли путем сравнения с опорным донор образца. Пятнадцать аутосомно-STR локусов и амелогенин (определение пола) являются одним из усиливается в одной реакции и разделены капиллярного электрофореза. Результаты отображаются здесь в качестве electropherogram. Аллелей цифры обозначение под каждой вершины в каждом локусе. X-ось представляет размер фрагмента (пар оснований, BP) и у-ось представляет интенсивность сигнала (РФС относительно флуоресценции единиц, при условии, под каждым соответствующим номером аллеля).PG "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 10:. Пример неспособности получить профиль аутосомно-STR, полученный из собранного bioparticle индивидуальный bioparticle показано на левом была собрана из воротника рубашки образца гель-пленки. Как видно из полученного профиль STR (показанной справа), был получен только один аллель (из 30 возможных). Аллелей цифры обозначение под каждой вершины в каждом локусе. X-ось представляет размер фрагмента (пар оснований, BP) и у-ось представляет интенсивность сигнала (РФС относительно флуоресценции единиц, при условии, под каждым соответствующим номером аллеля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
Здесь мы описали методы сбора и повышения генетического анализа bioparticles оправился от сенсорного анализа ДНК. Разработанный подход включает в себя следующее: 1) сбор биологического материала (то есть, bioparticles) через гель-пленки от затронутых объектов и поверхностей, которые носят предметы одежды или прямого человеческой кожи, 2) микроскопическое исследование извлеченного биологического материала с целью обеспечения сбора потенциал биологического материала человека, и 3) микроманипуляция из одного или нескольких bioparticles использованием растворимого в воде кле, и 4) аутосомно-ДНК-СТР профилирование собранных bioparticles использованием микрообъем (5 мкл) на один шаг лизиса / реакция амплификации. Использование одностадийной реакции в закрытой трубе снижает вероятность загрязнения и образца потери от дополнительных манипуляций или передачи другим реакционных труб образца. Усиливается один шаг микрообъема (5 мкл) лизис / реакции амплификации STR позволяет восстановление полностью или probativе STR профили донора одного или нескольких bioparticles. Этот подход был разработан для получения однократной профили источник STR из одно- и мульти-источника Нажмите на ДНК доказательств (например, изношенные предметы одежды и другие предметы домашнего обихода, коснулся / хранении объектов и поверхностей, смеси кожа / кожа). Это было успешно использовано для обнаружения мужского донора в моделируемых физических образцов нападение смеси.
Этот подход может быть дополнительно оценена в дополнительных сценариев смеси жидкости организма / ткани, такие как жертвы царапин его / ее зачинщика, в котором только несколько bioparticles от нападающего будет присутствовать среди подавляющего количества биологического материала от жертвы. Кроме того, поскольку это подход, разработанный в данном исследовании позволяет провести анализ на одном уровне bioparticle, она может быть использована для лучшего понимания природы и степени вторичного переноса 14-19, в котором посредник передает профиля ДНК на surfaCE, предмет или человек с другим объектом поверхности или лица, 20. Слепой швабры подход к анализу вторичного переноса может не выявить следовые количества материала из вторичного донора. Развитый подход позволяет анализировать одного или нескольких bioparticles и поэтому результаты не смешаны в присутствии подавляющего количества биологического материала от первичного донора. Методики, разработанные в этой работе может также иметь последствия для анализа следов биологического материала в сексуальном насилии таких случаях, как те, с участием цифровой проникновение во влагалище, где положительная идентификация следовых количеств клеток кожи от виновного может иметь решающее значение для установления, что сексуальные контакты произошло.
В то время как коллекция bioparticles от образца гель-пленки не включает в себя сложные и сложные манипуляции, есть критические шаги в этой процедуре, которые должны быть выполнены с большой осторожностью, чтобы обеспечить Суccessful передача bioparticles к потоку реакционного сосуда. Сбор bioparticles с растворимого в воде кле следует рассматривать под микроскопом (например, стереомикроскоп при большом увеличении (~ 200-300X), чтобы гарантировать, что только bioparticles интересных собраны. В зависимости от размера клеевой "мяч", используемого, существует это потенциал для сбора дополнительной окружающего материала, который может включать в себя как биологические и не биологический материал (например, волокна, другой мусор). Коллекция нежелательной дополнительных bioparticles может привести к восстановлению смешанных профилей ДНК. Коллекция небиологических материалов может ввести ингибиторы в микро-объема лизиса / STR реакции. Если несколько bioparticles собирают с той же клеем "мяч", существует возможность для ранее собранные bioparticles стать привязан с клеем. Это не часто наблюдается, но может произойти когда большее число bioparticlES собраны (например, более 50) с одной липкой "мяч". Если большое количество bioparticles ориентированы, рекомендуется, чтобы несколько сборников меньшим bioparticles сделаны но все переносили в одной и той же трубке 0,2 мл. После bioparticles были собраны, необходимо соблюдать осторожность во время удаления гель-пленки слайд из столике микроскопа и размещения 0,2 мл трубки таким образом, что кончик иглы не нарушается. При размещении кончика иглы в смеси амплификации в нижней части 0,2 мл трубки, кончик иглы не должны вступать в контакт с боковых сторон трубки, чтобы избежать потери материала на сторонах трубы. В то время как растворение клея, как правило, быстро (~ 30 сек или меньше в зависимости от размера клеевой "шарик"), и может контролироваться при микроскопическом исследовании, кончик иглы должен быть постепенно удален из смеси амплификации чтобы гарантировать, что полное растворениеклея была достигнута. Если клей не полностью растворен, игла может быть возвращен в жидкости, чтобы позволить полное растворение.
Протоколы, описанные здесь, были оптимизированы для использования с bioparticles и клеток человека из судебно-биологических доказательств. Буфер для лизиса выбран совместим с выбранным набором амплификации ДНК-STR. Хотя, возможно, приемлемых альтернативных буферов лизиса, их эффективность с точки зрения лизиса клеток и совместимость с последующей анализа должны быть проверены пользователем. Кроме того, STR усиление комплект и усиление количество циклов описано в данном протоколе были оптимизированы для использования с одним или несколькими bioparticles. Следующее поколение STR усиление комплект с сообщений о повышении надежности и чувствительности был выбран и было продемонстрировано в результате восстановления высококачественных профилей STR от одного или нескольких bioparticles. В то время как многие другие наборы STR, с разной рекомендованной усилителемчисло катионов цикла, доступны, у них может не соответствующую чувствительность и, следовательно, должны быть должным образом оценены перед использованием в этих протоколах.
Несмотря на успешное использование описанных методов для восстановления STR профилей из одного или нескольких bioparticles, вероятность успеха восстановления профиля не будет 100%. Таким образом, для некоторых образцов может наблюдаться ограниченное частичное профиль ДНК или нет профиль. Это не может быть предотвращено за счет неспособности окончательно визуально определить наиболее bioparticles как клеточного материала, потенциал ухудшается состояние ядерного материала в собранных bioparticles или потери материала образца от клея до передачи в реакционный сосуд. Таким образом, анализ одного образца bioparticle для каждого сенсорного элемента ДНК не рекомендуется. Мы часто собирают 20 наборы образцов из отдельного образца гель-пленки, и собрать дополнительные наборы образцов по мере необходимости, если подходящий профиль STR не получается. TОн только ограничение для коллекций это количество биологического материала присутствует на образец гель-пленки (и, вероятно стоимости анализа, хотя реакции микрообъем обеспечить возможность собрать дополнительные образцы для аналогичной или более низкой стоимости в качестве одной стандартной реакционного объема ( например, 25 мкл).
Разработанные методы ДНК профилирования описать здесь обеспечить молекулярную подход к характеристике, анализа и интерпретации трассировки биологического материала, извлеченного из образцов сенсорных ДНК на основе. Тем не менее, существует дополнительное генетической информации, которые могут быть получены из восстановленных bioparticles в дополнение к определению донора (т.е., STR профиль) донора биологического материала. Ткань или орган источник жидкости происхождения (например, кожа по сравнению с слюны) может предоставить важную контекстную информацию расследования уголовного дела. Без такого определения, неоднозначность источника ткани происхождения могут быть EXPLOITED в качестве альтернативных обстоятельств преступления (например, как, возможно, были депонированы жидкости тела) можно предположить. Протоколы сбора bioparticle и изоляции, описанные здесь, могут быть использованы для сбора bioparticles или другие клетки (например, буккальное, вагинальное) для использования в идентификации источника ткани (мРНК профилирования 21-30) стратегии, которая включает микро-объем обратной транскрипции (RT) и Реакции амплификации. С дальнейшей оптимизации также может быть возможным разработать ДНК / РНК стратегию сотрудничества изоляции для идентификации типа клеток (РНК) и STR профилирования из того же образца, в том числе bioparticles от дачи показаний сенсорный ДНК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767 (1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
