Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Published: March 11, 2015 doi: 10.3791/52616

Abstract

Celvrije systemen een flexibel platform voor aftasten netwerken van biologische reacties geïsoleerd uit het complex resource sharing (bijv globale genexpressie celdeling) aangetroffen in levende cellen. Echter, dergelijke systemen, gebruikt in conventionele macro-schaal bulk reactoren, vaak niet om het dynamische gedrag en efficiëntie kenmerk van hun levende micro-schaal tegenhangers vertonen. Inzicht in de gevolgen van de interne celstructuur en de schaal op de reactie dynamiek is van cruciaal belang voor het begrijpen van complexe gen-netwerken. Hier beschrijven we een microfabricated apparaat dat cel-vrij reacties opsluit in cellulaire schaal volumes terwijl flexibele karakterisering van de ingesloten moleculair systeem. Deze meerlaagse poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) apparaat bevat femtoliter schaal reactiekamers op elastomeren membraan dat kan worden bediend (geopend en gesloten). Wanneer bediend, de kamers beperken Cell-allergene EiwitSynth (CFPS) reactiesexpressie van een fluorescerend eiwit, waardoor de visualisatie van de reactiekinetiek tijd met time-lapse fluorescentiemicroscopie. Hier laten we zien hoe dit apparaat kan worden gebruikt om het geluid structuur van CFPS reacties op een wijze die direct analoog aan die toegepast om cellulaire systemen karakteriseren, waarbij het gebruik van lawaai biologische technieken gebruikt in cellulaire systemen waarmee aan CFPS gen schakelingen karakteriseren meten en hun interacties met de celvrije omgeving.

Introduction

Celvrije systemen bieden een eenvoudige en flexibel platform voor het bekijken biologische reacties vrij van complicerende factoren zoals fitness, delen en mutatie die onvermijdelijk de studie van levende cellen. Dergelijke benaderingen zijn gebruikt om cellulaire systemen waaronder de karakterisering van membraaneiwitten 1, het sonderen van eiwit interacties 2 en de verkenning van fundamentele aspecten van de vertaling 3-7 bestuderen. Onlangs cel-vrije systemen zijn begonnen om een voet aan de grond als levensvatbare platforms krijgen voor synthetische biologie 8-10. Het beroep van deze aanpak is dat ze vrij van synthetische biologie van het delen van middelen en 'extrinsieke ruis' die reactie dynamiek in levende cellen beïnvloedt. Maar vragen blijven hoe de fysieke omgeving waarin celvrije reacties worden ingebed beïnvloedt de voortgang en het resultaat van de reactie. Celvrije reactie omgevingen - in het bijzonder beperkt Environmenten die cel-relevante volumes te benaderen - blijven slecht gekarakteriseerd. Cell-allergene EiwitSynth (CFPS) is conventioneel gedacht als zijnde 'schaalvrije,' tentoonstellen gelijkwaardig kinetiek in een heel scala van microliter tot liter schaal reactie volumes 11. Toch is het opsluiten van reacties op cellulaire schaal volumes is aangetoond dat significante invloed eiwitexpressie tarieven 12.

De stochastische aard van cel-vrij reacties - vooral omdat deze systemen aanpak of zelfs naar beneden femtoliter volumes - kan zijn van bijzonder belang. Ruis in genexpressie is een eigenschap sterk beïnvloed door opsluiting als kleincellige volume en hoge dichtheden van componenten dwingen vele belangrijke moleculen zeer lage populatie - bijvoorbeeld Escherichia coli beperkt binnen 1 fl volume liefst 4.300 verschillende polypeptiden onder de induceerbare controle van honderden verschillende promoters 13. Dit inherente ruis is betrokken als een centrale drijvende kracht in tal van biologische processen, waaronder chemotaxis 14, de HIV beslissing tussen actieve replicatie en latency 15, de beslissing λ faag tussen lysis en lysogenie 16,17, en de Bacillus subtillus beslissing tussen competentie en sporulatie 17. Celvrije synthetische biologie biedt dan zowel een kans om de stochastische eigenschappen van cellulair gen circuits en netwerken onderzoeken en manipuleren deze gedragingen specifieke technologische doelen. Terwijl het geluid gedrag van cellulaire systemen is goed bestudeerde 18-27, is er weinig onderzoek naar de fundamentele geluid gedrag van cel-vrije systemen 8, met name op het cellulaire schaal.

Hier presenteren we een platform voor de studie van stochastische effecten in celvrije synthetische biologie. Dit microfabricated platform bevat femtoliter schaal reactie chambers die snel kunnen worden overgezet tussen open (gratis diffusie in en uit de kamer) en gesloten (reactanten opgesloten in de kamer) staten. In gesloten toestand, beperken wij celvrije eiwitsynthese (CFPS) reagentia expressie brengen van een groen fluorescerend eiwit (GFP), en volg genexpressie met behulp van time-lapse fluorescentiemicroscopie 28 (figuur 1). Wij kenmerken deze celvrije omgeving door meting van de structuur van de stochastische fluctuaties in genexpressie op een wijze direct analoog aan die toegepast om cellen te 25 karakteriseren. Niet-microfabricage werkwijzen voor het opsluiten celvrije reacties omvatten blaasjes en liposomen 29-32, water-in-olie emulsies 12 en poreuze media 33. Hoewel deze werkwijzen controle kan verschaffen over de grootteverdeling van de beperkte volumes 34, microfabricage werkwijzen maken zeer reproduceerbare eigenschappen met strak specifieke afmetingen, zelfs op nanoschaal.Bovendien kunnen deze starre structuren eenvoudig worden gevolgd in de tijd zonder gevoelig voor verdamping of veranderingen in de externe omgeving. Containerontwerpen microfabricated bij eerdere werk 8,35 niet snel afdichten reactiekamers volgende reactie initiatie, compliceert duidelijke toewijzing van de tijd dat de reactie werd gestart (tijdstip nul). Met de hier voorgestelde methode worden slechts 4-5 minuten nodig tussen initiatie en visualisatie van de reactie op het apparaat, waardoor een goed gedefinieerde "tijdstip nul". De volgende protocollen beschrijven de werkwijzen voor het vervaardigen en testen van het apparaat, waaronder optische lithografie, inrichtingsamenstel, testen apparaat en werkwijzen voor beeldanalyse.

Protocol

1. optische lithografie van Device Masters

  1. Dehydrateer clean silicium wafers op een hete plaat bij ~ 250 ° C gedurende tenminste 1 uur.
    LET OP: Het is een goede gewoonte om meer dan één wafer gebruiken bij het opstellen van een meester, in geval van een fout van de gebruiker.
  2. Bereid fotolak porties. Aliquots van zowel SU-8 2015 fotoresist en een verdunning van SU-8 2015 fotoresist in 2: 1 verhouding met SU-8 dunner verdunningsmiddel.
    Opmerking: Ongeveer 1 ml fotoresist nodig voor spin-coating een wafer.
  3. Bereid drie masker patronen voor het produceren van deze meesters. Voor het Membraan Master, bereiden twee maskers: een patroonvorming het membraan kanaal en de andere patroonvorming de reactiekamers. Voor de regelklep meester, bereiden slechts een masker patroon.
    OPMERKING: Voor meer informatie over lithografische technieken, inclusief masker patronen, zie Ito en Okazaki, 2000. 36 Zie Fowlkes en Collier, 2013 voor een meer gedetailleerde beschrijving van het apparaat ontwerp 37.
  4. Bereid de Membraan Master
    1. Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 fotolak verdunning op wafers bij 1000 rpm gedurende 45 sec.
    2. Soft bak wafers bij 95 ° C gedurende 2 min. Met behulp van een contact aligner, bloot wafers met membraan kanaal patroon voor 10 sec, en het uitvoeren van een post-exposure bakken gedurende 2 min bij 95 ° C.
    3. Ontwikkelen wafers in SU-8 ontwikkelaar 1 minuut of totdat fotolak residu verwijderd. Spoel wafer met isopropanol, het verplaatsen van boven naar beneden. Droge wafer met stikstof, opnieuw verplaatsen van boven naar beneden. Bak wafers bij 180 ° C gedurende 4 min.
    4. Spin-coat patroon wafers opnieuw met 2: 1 SU-8 verdunning bij 2000 tpm gedurende 45 sec.
    5. Zachte bak gevormde wafels gedurende 2 min bij 95 ° C. Met behulp van contact aligner, uitlijnen patroon wafers met reactiekamer patroon, en bloot voor 10 sec. Voeren bakken na belichting gedurende 2 min bij 95 ° C.
    6. Ontwikkelen wafers zoals beschreven in stap 1.4.3. Na het ontwikkelen en drogen wafels, wafels bakken bij 180 ° C gedurende 4 min.
      OPMERKING: De wafels kunnen dezelfde ontwikkelaar die werd gebruikt in de voorgaande stap worden ontwikkeld.
  5. Bereid de regelklep Master
    1. Spin-coat onverdund SU-8 op de schone wafers bij 2.000 rpm gedurende 45 sec.
    2. Soft bak wafer bij 95 ° C gedurende 6 min. Met behulp van een contact aligner, bloot wafers met regelklep patroon voor 10 sec. Voer een bakken na belichting bij 95 ° C gedurende 6 min.
    3. Ontwikkelen wafers in SU-8 Developer gedurende 2 minuten of totdat residu verwijderd. Spoelen met isopropanol, het verplaatsen van boven naar beneden. Droge wafer met stikstof en bak bij 180 ° C gedurende 4 min.

2. PDMS Device Fabrication

  1. Silaniseren alle meesters met ~ 0,2 ml trimethylchloorsilaan via vapor deposition.
    1. Snel omsluiten de meester in een luchtdichte container bij RT met een paar druppels van de silaneren middel.
      OPMERKING:. Andere silaneren protocollen kan aanvaardbaar zijn 38 Indien uitgevoerd properly, de PDMS gemakkelijk te verwijderen.
  2. Meng commerciële poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) basis en verharder in verschillende verhoudingen voor zowel het membraan en regelklep lagen van de inrichting, zoals is aangetoond in soortgelijke meerlaagse klepontwerpen 39. Gebruik 20: 1 en 5: 1 verhoudingen van base: verharder voor het membraan en regelklep matrijzen, respectievelijk.
    1. Voor het membraan mal, meng 10 g basis met 0,5 g verharder.
      LET OP: Dit volume wordt spin-coating op het membraan meester.
    2. Voor de regelklep matrijs, meng de basis en verharder in een 5: 1 verhouding. De hoeveelheid PDMS nodig de regelklep zal afhangen van de verpakking worden gebruikt om de regelklep meester houden vormen; vul de container zodanig dat de master is bedekt met ~ 1 cm van PDMS.
  3. Meng grondig zowel PDMS voorbereidingen, en de-gas ze in een vacuümkamer tot er geen luchtbellen zichtbaar zijn. Plaats de regelklep meester in een hittebestendigehouder, zoals een glazen schaal. Giet 5: 1 verhouding PDMS over de meester, en de-gas de container een tweede keer.
  4. Terwijl de regelklep PDMS container wordt ontgast, spin-coat de 20: 1 verhouding PDMS op het membraan meester door voorzichtig gieten van het PDMS mengsel op het membraan meester luchtbelvorming minimaliseren, dan spin-coating de meester bij 1000 rpm 45 sec.
  5. Gedeeltelijk genezen zowel meesters in een oven bij 80 ° C gedurende 6 minuten voor het membraan meester en 15 minuten voor de regelklep meester.
    OPMERKING: Wanneer gedeeltelijk genezen, moet de PDMS zijn vorm te houden, maar het materiaal zal iets kleverig zijn. Als PDMS nog niet is genezen, bakken weer in stappen van een paar minuten per keer totdat het materiaal houdt zijn vorm wanneer ingedrukt.
  6. Snijd rechthoekige PDMS mallen uit regelklep meester, het schillen van de mallen weg zachtjes. Punch inlaat gaten door de gevormde component met behulp van een 0,75 mm perforator.
    OPMERKING: Het gat kan worden gereinigd door het invoegen van een 23 gauge Blunt tip naald, en de mal buitenkant kan worden gereinigd met plakband, indien nodig.
  7. Met een optische microscoop om de reactiekamers op het membraan meester lokaliseren lijn de regelklep matrijscomponent met de eigenschappen van de reactiekamer membraan en plaats de regelklep component direct op het membraan meester. Richt de regelklep inlaat naar de linkerbenedenhoek van het apparaat, en ervoor zorgen dat de reactiekamers en het kanaal van het membraan meester zijn zichtbaar in de rechthoekige regelklep.
  8. Bak de uitgelijnde vormdelen bij 80 ° C gedurende 2 uur.
    Opmerking: Het membraan en regelklep mallen nu samen verzegeld en gemanipuleerd als een matrijs.
  9. Snijd de gelaagde PDMS mal verwijderd van het membraan meester, pellen de mal verwijderd van de master zeer voorzichtig om niet het membraan perforeren.
  10. Punch inlaat en gaten voor de cel extract ingang met behulp van een 0,75 mm perforator uitlaat. Perforeren door beide lagen,en reinigen op dezelfde wijze als beschreven in stap 2.6.
  11. Met behulp van een inductief gekoppeld plasma schoner, plasma traktatie zowel de mal (membraan naar boven) en een nummer 0 glazen dekglaasje op 10,5 W voor 20 sec. Verwijder onmiddellijk het dekglaasje en schimmel uit het plasma schoner en laag de componenten membraan kant naar het glas, probeert luchtzakken tussen de glasplaat en de matrijs te minimaliseren. Niet direct drukken op het membraan ingangskanaal of het membraan kan hechten aan het glas, waardoor het moeilijk het kanaal reactanten vullen.
    1. Wees extra voorzichtig bij het hanteren van de gemonteerde apparaten om te voorkomen dat het breken van de glaslaag. Gebruik dunne dekglaasjes als het apparaat moet worden afgebeeld door de glazen dekglaasje met behulp van een sterke vergroting olie-immersie doelstellingen - als het glas te dik is, kan de functies van het apparaat niet zichtbaar zijn.
  12. Tenslotte genezen van de voltooide inrichtingen bij 80 ° C gedurende 2 uur.

3. Experimentele Setup for Celvrije EiwitSynth Reactie

  1. Hydrateren een apparaat door het koken in gedemineraliseerd water gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Het apparaat moet een bewolkte verschijning hebben wanneer volledig gehydrateerd. Inrichting kan ook worden overgelaten O / N in steriel water bij kamertemperatuur om het te hydrateren.
  2. Met behulp van een omgekeerde microscoop met een incubatie droogstoof die de omgevingstemperatuur tot 30 ° C.
    Opmerking: Deze temperatuur werd gekozen om expressie van GFP optimaliseren een T7 promoter, zodat optimale temperaturen voor andere reacties kunnen variëren 40.
  3. Mount apparaat naar het podium houder microscoop met plakband en wikkel randen van het apparaat met natte tissue om lokale hydratatie.
  4. Gebruik twee hoge precisie closed-loop voltage-druktransducers naar stikstofgas druk regelklep bediening en reagens ingang moduleren.
    OPMERKING: Dit protocol is alleen getest met lage zuiverheidsgraad stikstof, hoewel andere inerte gassen worden gebruikt.
    1. Sluit de eerste transducer door24-gauge PTFE slang aan een waterreservoir gehouden in een 4 ml glazen flesje met een septum deksel. Sluit het reservoir naar de regelklep inlaat met behulp van een tweede buis beëindigd door een 23 gauge stompe punt naald.
      OPMERKING: Beide buizen dringen het reservoir septum met twee scherpe 23 gauge naalden.
    2. Sluit de tweede transducer van 24-gauge polytetrafluorethyleenslangen aangesloten op een man-naar-male Luer-lok-connector. Bevestig dit naar een Luer-Lok 23 gauge naald verbonden door slangen met een andere 23 gauge stompe punt naald, die individueel wordt samengesteld voor elk apparaat. Deze naald verbindt met het membraan reactiekanaal; gebruiken om water te spoelen uit de reactie kanaal en input reagentia.
  5. Met een celvrij expressiesysteem eiwit, assembleren onderdelen voor de CFPS reactie op ijs, volgens de instructies van de fabrikant. Minimaliseren van de tijd besteed houden CFPS reagentia op ijs en plaats de reactie in het apparaat direct na montage.
    OPMERKING: Dit apparaat is geweestgebruikt met een commercieel E. coli extract eiwitexpressie kit en een plasmide constitutief GFP. Het totale reactievolume werd opgeschaald tot 25 gl - het kan mogelijk een nog lager volume gebruiken reagentia, indien gewenst. Zoals CFPS reagentia neiging gevoelig cycli bevriezen-ontdooien is, kan het nuttig zijn aliquots van de reagentia bij het juiste volume vóór het experiment. Andere reagentia kunnen worden toegevoegd aan het reactiemengsel, maar de reactie moet volledig worden voordat wordt toegepast op het apparaat.
    1. Monteer de reactie, het toevoegen van de DNA-ingang laatste.
      OPMERKING: Als alles in elkaar in een Eppendorf buis, zal de CFPS reactie te beginnen, zo niet op ijs gehouden. Omdat de tijd die de reagentia op het toestel en begint het experiment kan variëren, is het nuttig om een ​​timer te starten nadat de reactie is gemonteerd en gemengd - dit zal het tijdsbestek tussen experimenten consistent en steun probleemoplossing houden.
  6. Debuizen en naald connector in stap 3.4.2 beschreven, trekt de geassembleerde reactie in de buis met behulp van een injectiespuit van 1 ml. Steek de stompe punt naald in de reactiekamer inlaat. Maak de naald los van de spuit en bevestig deze aan de man-naar-male connector gebruikt voor de reactiekamer transducer.
  7. Breng druk (<10 psi) aan de CFPS reactanten om het kanaal te vullen. Verwijder de naald wanneer de reactie wordt gevuld.
  8. Steek de botte buis van de andere transducer in de regelklep inlaat. Laat de regelklep nog niet onder druk.
  9. Plaats het gemonteerde apparaat op het podium. Met behulp van helderveld imaging, zoek het reactiekamers met een 100X olie-immersie objectief.
  10. Bedien de regelklep door het onder druk van de regelklep transducer 20 psi; een zichtbare verandering in het membraan zal duidelijk zijn wanneer de regelklep wordt bediend. Focus op de bodems van de reactiekamers.
  11. Begin het beeld acquisitie; toename in fluorescentie wzichtbaar in het interieur en rond de buitenzijde van de reactiekamers ziek, maar het zal waarschijnlijk niet zichtbaar in de vroege stadia van de reactie. Maak foto's om de 1-3 minuten tot de reactie van een steady state fluorescentie bereikt. Als een automatisch Instelslede niet beschikbaar, kort richten elk beeld voordat de foto wordt genomen.
    OPMERKING: Terwijl sommige photobleaching zal optreden, kan de effecten op de relatieve fluorescentie vanwege fotobleking worden verantwoord zolang de snelheid van fotobleken bekend is. Het fotobleken percentage kan worden geschat door het blootstellen van een fluorescent standaard, zoals een bekende concentratie van GFP of een fluorofoor mengsel constant fotobleken gedurende een tijdsperiode.
  12. Noteer de tijd die is verstreken vanaf de reactie assemblage naar het eerste beeld verkregen.
    OPMERKING: Dit duurt gewoonlijk 4-5 min.

4. Image Analysis en Data Processing

  1. Met behulp van een beeldanalyse software zoals ImageJ, selecteert u deinwendige van de reactiekamers een ROI. Verwerven van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit waarde van de ROI voor alle beelden.
    LET OP: Dit is de ruwe fluorescentie-intensiteit trace.
    1. Voer deze taak uit in ImageJ met behulp van de Time Series Analyzer en ROI Manager plugins - Gebruik Time Series Analyzer om gebieden van belang rond het interieur van elke reactiekamer kiezen. Stel "AutoROIProperties" naar een gebied dat overeenkomt met het interieur van elke reactiekamer, check "Add On Klik op" en selecteer elke kamer.
      OPMERKING: Deze stap kan ook worden gedaan met behulp van de ellips tool om een ​​ROI rond de tl-kamer te trekken. Dit ROI grootte overeenkomt, meestal aan een 30 x 30 pixel ellips voor een 10 micrometer diameter kamer bekeken met een 100X doelstelling.
    2. Markeer alle ROI's in de ROI Manager. Gebruik de functie "Multi Measure" om de fluorescentie-intensiteit gemiddelde van elke ROI te bepalen door het hele beeld stapel.
      OPMERKING: Een plugin genaamd StackReg kunnen worden gebruikt om het beeld stapel uitlijnen, indien nodig.
  2. Na het verkrijgen van het ruwe fluorescentie-intensiteit sporen voor alle kamers in een experiment, bepalen de deterministische component van de reactie door middel van een inter-experimentele gemiddelde over alle sporen, en aftrekken van de gemiddelde individuele ruwe sporen. Met data-analyse software zoals IGOR of MS Excel voor deze analyse.
    LET OP: Dit geeft geluidsoverlast die voor elk reactiekamer.
  3. Analyseer de genexpressie geluid van deze reactiekamers met dezelfde methodes gebruikt om genexpressie lawaai afkomstig van cellen 25 geanalyseerd.

Representative Results

Het duidelijke voordeel van deze microfabricated platform in de toepassing van de regelbare elastomere "control valve" die onafhankelijk bediend om CFPS reacties (figuur 2A) beperken. Wanneer het apparaat wordt bediend, wordt het membraan kamers gedrukt tegen het glaasje om fluorescente reagentia beperken in een array van reactiekamers (figuur 2C). Om te verifiëren dat de kamers op betrouwbare beperken de reactie door de duur van het experiment, een basis FRAP (Fluorescence Recovery Na Fotobleken) test werd uitgevoerd 37. Een fluorofoor (AF 555) werd aangebracht op de inrichting en de regelklep werd bediend; met behulp van de sluiter opening van de microscoop, een enkel goed opsluiten van de fluorofoor werd geïsoleerd en photobleached individueel (figuur 2D). De gekozen goed werd donker en niet te herstellen in de helderheid tot de regelklep werd drukloos 20 min60; later, het vrijgeven van de kamer van het glas. Deze test controleert of deze reactiekamers blijven goed gesloten gedurende de duur van het experiment.

Bij optimale omstandigheden een CFPS reactie expressie een gemakkelijk gevisualiseerd eiwit (zoals GFP of luciferase) expressie detecteerbaar eiwit binnen enkele minuten worden op dit apparaat. Gedurende de levensduur van de reactie wordt de eiwitsynthese in het interieur en exterieur van de reactiekamers afgebeeld en gekwantificeerd door het meten van eenheden van fluorescentie-intensiteit binnen elke kamer (Figuur 3A). Fluorescentie intensiteit, overeenkomend met eiwitconcentratie, worden bijvoorbeeld de tijd voor elke reactiekamer (Figuur 3D).

Genexpressie is een inherent stochastisch proces dat fluctuaties (ruis) bij elke moleculaire stap (synthese, afbraak, eiwit-DNA-binding, etc.) 20 ingevoerd. Een tak van ruis biologie richt zich opde bewijskracht van gen-circuit lawaai 41. Expressie in celvrije systemen extrinsieke geluidshinder die voortvloeien uit interacties tussen de moleculaire machinerie van de expressie en de oppervlakken die de grenzen van de reactievaten definiëren. Deze extrinsieke effecten zullen waarschijnlijk meer uitgesproken worden als cel-vrije reacties worden opgesloten in nog kleinere reactiekamers. De mogelijkheid om time-lapse imaging meerdere beperkt CFPS reacties uitvoeren stelt vervolgens de zorgvuldige analyse van ruis structuur (magnitude en dynamica) in gesloten celvrije systemen een manier direct analoog aan werkwijzen die zijn beschreven voor cellulaire systemen 25. Figuur 3C en 3D tonen het tijdsverloop van constitutieve GFP expressie vanaf een T7 promoter in een standaard 384 microplaat met een goed volume van 15 pl, vergeleken met in PDMS reactiekamers 10 micrometer diameter, overeenkomende met hoeveelheden van slechts ongeveer 300 fl, ongeveer zeven ordes van grootte kleiner. De variabiliteit in eiwitexpressie aanbiedingen in de 10 urn reactiekamers is veel hoger dan in de put plaat metingen benaderen die waargenomen in cellen.

Multiplexed reacties uitgevoerd op het apparaat vertonen vergelijkbare kinetiek CFPS reacties uitgevoerd in massa op een microplaat lezer (figuur 3B), waarbij er een snelle toename in fluorescentie die plateaus, vaak verondersteld te worden veroorzaakt door middel beperking in het reactievolume 42,43 . Deze deterministische groei gedrag, hoewel fluctuerende, is over het algemeen consistent in alle reactiekamers, en tussen de experimenten - door het gemiddelde te sporen tussen de kamers aan de overkant van experimenten, kan de deterministische trend worden afgetrokken van trace waarden, waardoor alleen het lawaai componenten van de reactie (Figuur 4A) . Figuur 4B toont de GFP expressie lawaai na verwijdering van de deterministische, voorbijgaande component (boven) En de autocorrelatie van de ruis (onderste), terwijl figuur 4A toont de overeenkomstige sporen op de 10 urn reactiekamers. De verdeling in de halfwaardetijden van de autocorrelatie sporen geeft de frequentie afhankelijkheid van de ruis, terwijl de nul vertragingstijd van de autocorrelatie sporen geeft de grootten van de ruis, de variantie.

Figuur 1
Figuur 1. celvrije eiwitsynthese reactanten worden opgesloten in femtoliter schaal reactiekamers voor het meten van genexpressie lawaai. Reagentia uit commercieel celvrij eiwit expressiesysteem worden gebruikt om constitutief GFP in afgesloten PDMS reactiekamers. Een array van deze kamers kunnen worden gevisualiseerd met time-lapse fluorescentie microscopie om eiwitexpressie en genexpressie lawaai karakteriseren. De fluorescentie-intensiteit of elke reactiekamer loop van de tijd als een individuele sporen kunnen worden uitgezet. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Fabricage van tweelaags microfluïdische apparaat met afsluitbare femtoliter schaal kamers. (A) Lay-out en exploded view van het apparaat lagen. De inrichting bestaat uit twee PDMS lagen en een glazen dekglaasje. De PDMS membraan, afgesloten tussen het glas en regelklep lagen, heeft de reactiekamers. (B) SEM beeld van PDMS reactiekamer. De inwendige diameter 10 urn. (C) Schematische voorstelling van de input kanalen in het apparaat. Cell-allergene EiwitSynth (CFPS) reagentia worden gevlogen door de reactie kanaal. Water wordt onder druk in de controlegroepklep reactiekamers comprimeren tegen de glasplaatje, het afdichten van de kamers 37. Overgenomen uit Ref. 37 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. (D) Fluorescentie herstel na Photobleaching (FRAP) testen op een enkele goed met behulp van FITC aangeeft kamer is goed afgedicht tegen externe omgeving. De fluorofoor werd gevangen in de kamers (bovenste afbeelding) en een enkele goed was photobleached (onderste afbeelding). Geen fluorescentie herstel werd gezien in de photobleached kamer totdat de regelklep werd uitgebracht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. EGFP expressie in besloten Cell-allergene Reaction. (A) Fluorescentie beelden van verzegelde reactie c Hambers op gekozen tijdstippen tijdens de reactie. Proteïneproductie kan worden gezien zowel in de reactiekamers en buiten de kamers in het hoofdkanaal. (B) EGFP werd gekloneerd in een pET3a vector, die een T7-polymerase promoter en terminator en een sterke ribosoombindingsplaats (RBS). (C) De genormaliseerde fluorescentie metingen van constitutieve expressie van EGFP in een bulk celvrij reactie uitgevoerd in een microplaat reader. CFPS reacties meestal produceren eiwit snel voordat het vertragen van een 'steady state' fluorescentie - dit wordt geassocieerd met resource beperking 43. Zwarte streepjes geven de gemiddelde spoor. (D) De genormaliseerde fluorescentie van 51 rauwe fluorescentie-intensiteit sporen lezen vanaf 51 reactiekamers over meerdere experimenten. Black streepjes geven de gemiddelde spoor over verschillende experimenten, waarbij de deterministische component van de eiwitexpressie te illustreren./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Individuele Noise Sporen en Geluid Autocorrelatie van een Cellulaire en Cell-Free System. (A) van Austin et al., 2006. Noise in GFP-expressie (boven) en genormaliseerde autocorrelatie-functies (onder) verkregen kunnen volgen GFP productie in levende bacteriën 25. Overgenomen met toestemming van Macmillan Publishers Ltd: [Natuur] 25 (Vol. 439), het auteursrecht (2006). (B) Lawaai in GFP expressie (boven) en genormaliseerde autocorrelatiefuncties (onder) overgenomen van GFP productie in de cel-vrij systeem, bijgehouden in microfluïdische apparaat reactiekamers. Klik hierom een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Genexpressie in cellen is inherent luidruchtig te wijten aan kleine cellulaire volumes en lage aantal kopieën van belangrijke reactanten. Noise biologie vaak gericht op de bronnen, verwerking en biologische gevolgen van schommelingen in de populaties, concentraties posities of toestanden van moleculen dat gen circuits en netwerken 44 besturen. Het overgrote deel van dit werk is uitgevoerd in cellulaire systemen, die het voordeel van het bekijken van het geluid van een gen circuit in de natuurlijke context van het genetische netwerken binnen de cel. Echter, celvrije systemen kan de karakterisering van de intrinsieke fluctuaties van een individueel gen circuit zonder verstorende effecten extrinsieke 18 die niet kan worden vermeden cellulaire systemen. Analyse van lawaai kan belangrijke fysische inzichten bieden in hoe genetische circuits zijn gestructureerd en hoe ze functioneren, en is gebruikt in cellulaire systemen te karakteriseren negatieve 25 en positieve 18, en transcriptionele barsten 45,46. Hier beschrijven we de studie van een celvrij expressiesysteem in microfluïdische inrichtingen die de gelijktijdige controle van reactorgrootte en reactietijden initatietijd inschakelen, zodat de rollen die opsluiting en verdringing 47,48 hebben op intrinsieke eiwitexpressie geluid zonder beter te begrijpen complicaties van levende cellen.

De sleuteltechnologieën eigenschap van het ontwerp is de integratie van arrays van femtoliter volume (micron-schaal) reactiekamers gebruikt voor het opsluiten van de reactanten van een celvrij expressiesysteem eiwit met een elastomeer "control valve" PDMS membraan dat vangt de reactanten in een goed gedefinieerde "tijdstip nul" voor reactie opening (figuur 1). Deze controle maakt de kinetiek van de bij eiwitsynthese reacties worden follverschuldigd in real time met hoge precisie. Als zodanig is het belangrijk om celvrije reactanten beheren dat inter-experimentele variabiliteit zoveel mogelijk geminimaliseerd. Deze regeling stelt ons ruis structuur celvrij genetische circuits evalueren op een wijze die analoog is aan die eerder werden gebruikt om genexpressie te evalueren in levende cellen.

Zoals reactanten in CFPS systemen gevoelig cycli bevriezen-ontdooien kan zijn, is het belangrijk dat de reactanten koud en minimaliseren van de tijd de reactanten besteden ontdooien op ijs. Het is een goede gewoonte om periodiek testen van de expressie van het CFPS systeem in bulk met het oog op de veranderingen in expressie niveaus in de tijd te identificeren - dit kan worden gedaan in een 10-15 ul reactie in een Eppendorf buis, of in een apparaat zoals een microplaataflezer , die meerdere uitvoert luidt tijd om reactiekinetiek vangen. Samen met de leeftijd en de dooi tijden van de reactanten voor elk experiment zal helpen bij het oplossen van lage expressie levels. Bovendien, bij het monteren CFPS reagentia, is het belangrijk op te merken dat de reactie begint zodra het volledig is geassembleerd en uit het ijs. Om een ​​consistente "tijdstip nul" handhaven, is het nuttig om de tijd op te nemen na de inleiding van de CFPS reactie na de laatste toevoeging van de DNA-ingang, en de reactie zo spoedig mogelijk worden toegepast op de geïncubeerde apparaat. Dit proces duurt ongeveer 4-5 minuten duren, en fluorescentie mag nog niet zichtbaar in de reactiekamers zijn. Deze regeling zorgt ervoor dat de beschikbare tijd om de groei gedeelte van de reactiekromme visualiseren gemaximaliseerd.

Voordat u CFPS reacties op het apparaat, is het raadzaam om te draaien kwaliteitscontrole testen om te controleren of er geen lekkage uit de kamers. Een FRAP test kan worden uitgevoerd (zoals in figuur 2D) door een fluorofoor aan het apparaat en het blootstellen van een individu goed totdat de put volledig gebleekt. Als de kamers zijngoed afgesloten, geen herstel zichtbaar moet zijn in de put - moet er een schril contrast tussen de wanden van het compartiment en het interieur en exterieur ruimten zijn. Als fluorescentieherstel blijkt of de wanden van de reactiekamer zijn niet duidelijk vastgesteld, moet de druk op de regelklep worden verhoogd of moet worden gecheckt lekkage of delaminatie van het glaasje.

Dit protocol is getest met CFPS reagentia van een commerciële E. coli celvrije eiwitexpressie kit (geschaald tot 25 pl), hoewel andere robuuste CFPS kunnen worden gebruikt. Het is mogelijk hoeveelheid daarvan veel lager dan bij toepassing van 25 ul reacties op het apparaat, dat nuttig kan zijn bij het reagens kosten een beperkende factor experimenten. Als reagentia worden toegevoegd aan de inrichting en de reactiekamers zijn afgedicht, is het niet mogelijk om reactanten aan de oplossing toevoegen zonder-de bediening van de regelklep - dus dit apparaat niet suitable voor reacties die de toevoeging van reagentia tijdens de reactie vereist. Dit apparaat is eveneens niet geoptimaliseerd voor het waarnemen CFPS reacties die langer kan lopen dan 3 uur - de effecten van dehydratatie en drogen van de inrichting na deze periode werden niet onderzocht. Indien langere reactietijden gewenst, kunnen deze effecten worden beperkt door het afdichten van de inrichting om verdamping te voorkomen, veranderen de incubatietemperatuur, of met een vochtige kamer. Wijzigingen in het ontwerp apparaat, zoals nanoporeuze structuren in de kamerwanden 49,50 of het opnemen van een poreuze membraanlaag, vormen een aantal methoden die reagens Exchange kan dus verlengen reactie tijdschema.

Microfabricated reactie compartimenten van uniforme volume zijn waardevol voor het behoud van de dimensies op experimenten en zeer geschikt voor onderzoek naar "nevenreacties" met het compartiment muren. Unlike methoden waarbij geenn-microfabricated technieken, deze reacties moeten in kleine aantallen worden geëvalueerd, en geen dimensionale flexibiliteit biedt tijdens de experimenten. De regelbare ontwerp voor deze reactiekamers is zeer geschikt voor time-lapse microscopie en kan een verhelderende aanvulling van een high-throughput werkwijze opsluiting zijn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 gauge needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100X oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
Sharp 23 gauge needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E. coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexa Fluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
  2. Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
  3. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
  4. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
  5. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  6. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
  7. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  8. Karig, D. K., Jung, S. -Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
  9. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
  10. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  11. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production - a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
  12. Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
  13. Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
  14. Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
  15. Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
  16. Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetics. 149, 1633-1648 (1998).
  17. Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
  18. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  19. McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
  20. Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
  21. Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
  22. Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
  23. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
  24. Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
  25. Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
  26. Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
  27. Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
  28. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
  29. Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
  30. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  31. Nomura, S. iM., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
  32. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
  33. Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
  34. Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
  35. Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
  36. Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
  37. Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
  38. Herold, K. E., Rasooly, A. Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, Horizon Scientific Press. (2009).
  39. Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  40. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
  41. Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
  42. Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
  43. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
  44. Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
  45. Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
  46. So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
  47. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
  48. Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
  49. Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
  50. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).

Tags

Biotechniek Celvrije synthetische biologie microfluidics lawaai biologie zachte lithografie femtoliter volumes
Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Norred, S. E., Caveney, P. M.,More

Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter