Abstract
Sistemas libres de células proporcionan una plataforma flexible para sondear las redes específicas de las reacciones biológicas aisladas de la puesta en común de recursos complejos (por ejemplo, la expresión génica global, la división celular) se encontró dentro de las células vivas. Sin embargo, tales sistemas, utilizados en reactores en masa a escala macro convencionales, a menudo fracasan para exhibir los comportamientos dinámicos y eficiencias característicos de sus homólogos micro-escala de vida. Comprender el impacto de la estructura interna de la célula y la escala en la dinámica de reacción es crucial para entender las complejas redes de genes. Aquí mostramos un dispositivo microfabricado que confina reacciones libres de células en los volúmenes celulares escala al tiempo que permite la caracterización flexible del sistema molecular cerrado. Este poli multicapa (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivo contiene cámaras de reacción escala femtoliter sobre una membrana elastomérica que puede ser accionado (abierto y cerrado). Cuando se acciona, las cámaras se limitan proteínas libre de células de síntesis (CFP) Reaccionesque expresa una proteína fluorescente, lo que permite la visualización de la cinética de reacción con el tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Aquí demostramos cómo este dispositivo puede ser usado para medir la estructura de ruido de reacciones CFP en una manera que es directamente análoga a los utilizados para caracterizar los sistemas celulares, permitiendo así el uso de técnicas de biología de ruido utilizados en sistemas celulares para caracterizar los circuitos de genes y CFP sus interacciones con el medio ambiente libre de células.
Introduction
Sistemas libres de células ofrecen una plataforma simplificada y flexible para la visualización de las reacciones biológicas libre de factores de complicación, tales como gimnasio, la división y la mutación que son inevitables en el estudio de las células vivas. Se han empleado Tales enfoques para estudiar los sistemas celulares, incluyendo la caracterización de proteínas de la membrana 1, el sondeo de las interacciones proteína 2, y la exploración de aspectos fundamentales de la traducción 3-7. Recientemente sistemas libres de células han empezado a hacerse un hueco como plataformas viables para la biología sintética 8-10. El atractivo de estos enfoques es que liberan la biología sintética a partir de la puesta en común de recursos y "ruido extrínseca 'que afecta a la dinámica de reacciones en las células vivas. Sin embargo sigue habiendo dudas en cuanto a cómo el entorno físico en el que se incrustan reacciones libres de células afecta a la progresión y el resultado de la reacción. Entornos de reacción libres de células - biente limitados específicamentepadres que se acercan a los volúmenes de células relevantes - siguen siendo mal caracterizado. Proteínas libre de células de síntesis (CFPA) es el pensamiento convencional en como siendo "libre de escala", que exhibe cinética equivalente a través de una gama de microlitro a volúmenes de reacción litros escala 11. Sin embargo, las reacciones que confinan a los volúmenes celulares escala se ha demostrado que afecta significativamente las tasas de expresión de proteínas 12.
La naturaleza estocástica de reacciones de células libres - especialmente ya que estos sistemas de enfoque o incluso ir a continuación femtoliter volúmenes - pueden ser de particular importancia. El ruido en la expresión génica es una propiedad muy influenciado por confinamiento como volúmenes de células pequeñas y altas densidades de componentes de fuerza muchas de las moléculas importantes a niveles muy bajos de población - por ejemplo, Escherichia coli confines dentro de un volumen de 1 fl tantos como 4.300 polipéptidos diferentes bajo el control inducible de varios cientos de promotores diferentes 13. Este ruido inherente ha sido implicado como una fuerza motriz fundamental en numerosos procesos biológicos, incluyendo la quimiotaxis de 14, la decisión del VIH entre la replicación activa y la latencia de 15, la decisión del fago λ entre lisis y lisogenia 16,17, y la decisión de Bacillus subtilis entre competencia y la esporulación 17. Biología sintética libre de células entonces ofrece tanto una oportunidad para explorar las propiedades estocásticas de circuitos de genes celulares y redes, y manipular estos comportamientos para lograr los objetivos tecnológicos específicos. Mientras que el comportamiento del ruido de los sistemas celulares se ha estudiado bien-18-27, ha habido poca exploración del comportamiento del ruido fundamental de los sistemas libres de células 8, en particular a escala celular.
Aquí presentamos una plataforma para el estudio de los efectos estocásticos en biología sintética libre de células. Esta plataforma contiene microfabricada escala femtoliter reacción cHambers que pueden ser transicionaron rápidamente entre abierto (libre difusión dentro y fuera de la cámara) y cerrados (reactivos confinados dentro de la cámara) estados. En el estado cerrado, limitamos la síntesis de proteínas (CFPA) reactivos libres de células que expresan una proteína fluorescente verde (GFP), y seguimos la expresión génica utilizando time-lapse microscopía de fluorescencia 28 (Figura 1). Caracterizamos este entorno libre de células mediante la medición de la estructura de las fluctuaciones estocásticas en la expresión génica de una manera directamente análoga a los utilizados para caracterizar las células 25. Los métodos no microfabricación para confinar reacciones libres de células incluyen vesículas y liposomas 29-32, emulsiones de agua en aceite 12, y medios porosos 33. Sin embargo, aunque estos métodos pueden proporcionar control sobre la distribución del tamaño de los volúmenes reducidos 34, los métodos de microfabricación crean características altamente reproducibles con dimensiones bien especificados, incluso en la nanoescala.Además, estas estructuras rígidas pueden ser fácilmente rastreados con el tiempo sin ser susceptible a la evaporación o cambios en el ambiente externo. Diseños de contenedores Microfabricated utilizados en anteriores 8,35 obra no puede sellar rápidamente las cámaras de reacción después de la iniciación de reacción, lo que complica la clara asignación de la época en que se inició la reacción (tiempo cero). Utilizando el método que aquí se presenta, se necesitan sólo 4-5 minutos entre el inicio y la visualización de la reacción en el dispositivo, proporcionando así un "tiempo cero" bien definido. Los siguientes protocolos se describen los métodos para fabricar y probar este dispositivo, incluyendo la litografía óptica, el montaje del dispositivo, las pruebas del dispositivo, y los métodos para el análisis de imagen.
Protocol
1. La litografía óptica de Maestros de dispositivo
- Deshidratar las obleas de silicio limpias en una placa caliente a ~ 250 ° C durante al menos 1 hora.
NOTA: Es recomendable utilizar más de una oblea en la preparación de un maestro, en caso de error del usuario. - Preparar alícuotas de fotoprotección. Preparar alícuotas de ambos SU-8 2015 fotorresistente y una dilución de SU-8 2015 fotorresistente en proporción 2: 1 usando SU-8 más delgada como diluyente.
NOTA: Aproximadamente se necesita 1 ml de resina fotosensible para spin-coating una oblea. - Prepare tres patrones de máscara para la producción de estos maestros. Para el Maestro de membrana, preparar dos máscaras: una modelar el canal de membrana y el otro patrón de las cámaras de reacción. Para el maestro de la válvula de control, preparar sólo un modelo de máscara.
NOTA: Para más detalles sobre las técnicas litográficas, incluyendo patrones de máscara, consulte Ito y Okazaki, 2000. 36 Véase Fowlkes y Collier, 2013 para una descripción más detallada del diseño del dispositivo 37. - Preparar el Maestro Membrana
- Spin-capa 2: 1 SU-8 dilución 2015 fotoprotector sobre obleas a 1.000 rpm durante 45 segundos.
- Obleas de pasteles suaves a 95 ° C durante 2 min. El uso de un alineador de contactos, exponer obleas con patrón de canales de membrana durante 10 segundos, y le realizará un horneado posterior a la exposición durante 2 minutos a 95 ° C.
- Desarrollar obleas en SU-8 desarrollador durante 1 min, o hasta que los residuos fotorresistente se elimina. Enjuague oblea con isopropanol, moviéndose de arriba a abajo. Oblea en seco con nitrógeno, de nuevo en movimiento de arriba a abajo. Obleas Hornee a 180 ° C durante 4 min.
- Spin-capa modelada obleas de nuevo con 2: 1 SU-8 dilución a 2000 rpm durante 45 segundos.
- Hornear suave modelado obleas durante 2 minutos a 95 ° C. Utilizando contacto alineador, alinee obleas estampadas con motivos cámara de reacción, y exponer durante 10 segundos. Realizar hornear posterior a la exposición durante 2 minutos a 95 ° C.
- Desarrollar obleas como se describe en el paso 1.4.3. Después del revelado y secado obleas, barquillos Hornee a 180 ° C durante 4 minutos.
NOTA: Las obleas se pueden desarrollar en el mismo desarrollador que se utilizó en el paso anterior.
- Prepare la válvula maestra de control
- Spin-capa sin diluir SU-8 fotoprotector en obleas limpias a 2.000 rpm durante 45 segundos.
- Oblea hornear suave a 95 ° C durante 6 minutos. El uso de un alineador de contacto, exponer obleas con patrón de válvula de control para 10 seg. Realice una hornear post-exposición a 95 ° C durante 6 minutos.
- Desarrollar obleas de SU-8 Developer durante 2 minutos, o hasta que se retire de residuos. Enjuague con isopropanol, moviéndose de arriba a abajo. Oblea seco con nitrógeno y hornear a 180 ° C durante 4 min.
2. PDMS la fabricación del dispositivo
- Silanizar todos los maestros con ~ 0,2 ml de trimetilclorosilano a través de la deposición de vapor.
- Encerrar rápidamente el maestro en un recipiente hermético a temperatura ambiente con unas gotas del agente silanizante.
NOTA:. Otros protocolos silanizantes pueden ser aceptables 38 Si properl realizadoY, el PDMS será fácil de eliminar.
- Encerrar rápidamente el maestro en un recipiente hermético a temperatura ambiente con unas gotas del agente silanizante.
- Mezclar un poli comercial (dimetilsiloxano) (PDMS) de base y agente de curado en diferentes proporciones para ambas capas válvula de membrana y de control del dispositivo, como se ha demostrado en la válvula de múltiples capas diseños similares 39. Usa 20: 1 y 5: 1 proporciones de la base: agente de curado para los moldes de membrana y control de válvulas, respectivamente.
- Para el molde de membrana, mezclar 10 g de base con 0,5 g de agente de curado.
NOTA: Este volumen será recubierto girar hacia el maestro membrana. - Para el molde de válvula de control, mezclar la base y agente de curado en una relación de 5: 1. La cantidad de PDMS necesarias para moldear la válvula de control dependerá del recipiente utilizado para mantener la válvula de control maestro; llenar el recipiente de tal manera que el maestro está recubierta con ~ 1 cm de PDMS.
- Para el molde de membrana, mezclar 10 g de base con 0,5 g de agente de curado.
- Mezclar bien tanto PDMS preparativos y desgasificar en una cámara de vacío hasta que no haya burbujas de aire son visibles. Coloque la válvula de control maestro en un resistente al calorrecipiente, tal como un plato de cristal. Vierta cuidadosamente 5: 1 relación de PDMS sobre el maestro, y desgasificar el contenedor una segunda vez.
- Mientras se desgasifica el contenedor PDMS válvula de control, efecto de bata las 20: 1 relación de PDMS en el maestro membrana vertiendo cuidadosamente la mezcla de PDMS en el maestro de membrana para minimizar la formación de burbujas de aire, y luego girar-recubrir el maestro a 1.000 rpm durante 45 segundos.
- Parcialmente curar ambos maestros en un horno a 80 ° C durante 6 minutos para el maestro de membrana y 15 min para el maestro de la válvula de control.
NOTA: Una vez curado parcialmente, el PDMS celebrara su forma, pero el material será ligeramente pegajosa. Si PDMS aún no se cura, hornear de nuevo en incrementos de unos pocos minutos a la vez hasta que el material mantiene su forma cuando se presiona. - Cortar PDMS rectangulares moldes de maestro válvula de control, pelar los moldes de distancia con cuidado. Perforar agujeros de entrada a través del componente moldeado usando una perforadora 0,75 mm.
NOTA: El agujero se puede limpiar mediante la inserción de un Blun calibre 23t aguja de punta, y el exterior del molde se pueden limpiar con cinta adhesiva, si es necesario. - Usando un microscopio óptico para localizar las cámaras de reacción en el maestro de la membrana, alinear el componente del molde válvula de control con las características de la membrana cámara de reacción y colocar el componente de válvula de control directamente en la parte superior de la membrana principal. Oriente la entrada de la válvula de control en la esquina inferior izquierda del dispositivo y asegúrese de que las cámaras de reacción y el canal del maestro membrana son visibles en el interior de la válvula de control rectangular.
- Hornee los componentes del molde alineados a 80 ° C durante 2 horas.
NOTA: Los moldes válvula de membrana y de control serán ahora selladas entre sí, y se manipulan como un molde. - Cortar el molde de PDMS capas de distancia desde el maestro de la membrana, descamación el molde lejos de la principal muy suavemente para no perforar la membrana.
- Perforar orificios de entrada y de salida para la entrada de extracto celular utilizando una perforadora 0,75 mm. Hacer agujeros a través de ambas capas,y limpiar ellos de la misma manera como se describe en el paso 2.6.
- El uso de un limpiador de plasma acoplado inductivamente, tratamiento de plasma tanto en el molde (lado de la membrana hacia arriba) y un cubreobjetos de vidrio No. 0 a 10,5 W durante 20 s. Retirar inmediatamente el cubreobjetos y el molde desde el filtro de plasma y la capa de los componentes, lado de la membrana hacia el vidrio, se intenta minimizar bolsas de aire entre el vidrio y el molde. No presione directamente sobre el canal de entrada de la membrana, o la membrana puede hibridar con el vidrio, lo que hace difícil para llenar el canal con reactivos.
- Tenga especial cuidado al manipular los dispositivos montados para evitar romper la capa de vidrio. Utilice cubreobjetos de vidrio delgadas como el dispositivo debe ser reflejado a través de la cubreobjetos utilizando alta magnificación objetivos de inmersión en aceite - si el cristal es demasiado gruesa, las características del dispositivo no pueden ser visibles.
- Por último, curar los dispositivos terminados a 80 ° C durante 2 horas.
3. Configuración Experimental for proteínas libre de células reacción de síntesis
- Hidratar un dispositivo hirviéndola en agua desionizada durante 1 hr.
NOTA: El equipo debe tener un aspecto turbio cuando está completamente hidratado. Dispositivo también puede dejarse O / N en agua estéril a temperatura ambiente con el fin de hidratar la misma. - Utilizando un microscopio invertido con una cámara de incubación, ajustar la temperatura ambiente a 30 ° C.
NOTA: Esta temperatura fue elegido para optimizar la expresión de GFP con un promotor T7, así que las temperaturas óptimas para otras reacciones pueden variar 40. - Dispositivo de montaje al microscopio titular de la etapa con cinta de celofán y envolver bordes de dispositivo con papel de seda húmedo con el fin de mantener la hidratación local.
- Utilice dos de alta precisión de circuito cerrado transductores de tensión-presión para modular la presión de gas nitrógeno para el accionamiento de la válvula de control y de entrada de reactivos.
NOTA: Este protocolo sólo se ha probado con nitrógeno baja pureza, aunque otros gases inertes pueden ser utilizados.- Conecte el primer transductor24 de calibre tubo de PTFE a un depósito de agua contenida en un vial de vidrio de 4 ml con una tapa de septo. Conectar el depósito a la entrada de la válvula de control utilizando un segundo tubo terminado por una aguja de punta roma de calibre 23.
NOTA: Ambos tubos penetran el tabique depósito con dos afilados 23 agujas de calibre. - Conecte el segundo transductor de tubo de PTFE de calibre 24 conectada a un macho macho a Luer-lok conector. Adjuntar a un Luer-lok aguja de calibre 23 unida por tubos con otra aguja de punta roma de calibre 23, que se monta de forma individual para cada dispositivo. Esta aguja se conecta al canal de reacción de la membrana; usarlo para limpiar el agua del canal de reacción y reactivos de entrada.
- Conecte el primer transductor24 de calibre tubo de PTFE a un depósito de agua contenida en un vial de vidrio de 4 ml con una tapa de septo. Conectar el depósito a la entrada de la válvula de control utilizando un segundo tubo terminado por una aguja de punta roma de calibre 23.
- El uso de un sistema de expresión de proteínas libre de células, montar los componentes para la reacción CFPS en hielo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Reducir al mínimo el tiempo dedicado celebración reactivos CFP en hielo y colocar la reacción en el dispositivo inmediatamente después del montaje.
NOTA: Este dispositivo ha sidose utiliza con un E. comercial coli extraer kit expresión de la proteína y un plásmido que expresa constitutivamente GFP. El volumen total de reacción se redujo a 25 l - puede ser posible utilizar un volumen aún más baja para reactivos, si se desea. Como reactivos CFP tienden a ser sensibles a los ciclos hielo-deshielo, puede ser útil hacer alícuotas de los reactivos en el volumen apropiado antes del experimento. Otros reactivos se pueden añadir a la mezcla de reacción, pero la reacción deben ser completamente ensamblados antes de ser aplicada al dispositivo.- Montar la reacción, añadiendo la entrada de ADN pasado.
NOTA: Una vez montado en un tubo Eppendorf, la reacción CFPS comenzará si no se mantuvo en hielo. Dado que el tiempo necesario para aplicar los reactivos para el dispositivo y comenzar el experimento puede variar, es útil para iniciar un temporizador una vez se monta la reacción y mezcla - esto mantendrá la escala de tiempo entre los experimentos consistentes, y la ayuda en la solución de problemas.
- Montar la reacción, añadiendo la entrada de ADN pasado.
- Utilizando elconector del tubo y la aguja se describe en el paso 3.4.2, retirar la reacción montado en el tubo con una jeringa de 1 ml. Inserte la aguja punta roma en la entrada de la cámara de reacción. Separe el conector de la aguja de la jeringa y adjuntarlo al conector macho a macho utilizado para el transductor cámara de reacción.
- Aplique presión (<10 psi) a los reactivos CFP para llenar el canal. Retire la aguja cuando se llena la reacción.
- Introducir el tubo romo desde el otro transductor en la entrada de la válvula de control. No presurizar la válvula de control todavía.
- Coloque el dispositivo montado en el escenario. Utilizando imágenes de campo claro, localizar las cámaras de reacción con un objetivo de inmersión en aceite 100X.
- Accionar la válvula de control mediante la presurización del transductor a la válvula de control de 20 psi; un cambio visible en la membrana será evidente cuando se acciona la válvula de control. Enfoque en el fondo de las cámaras de reacción.
- Comience la adquisición de imágenes; el crecimiento de la fluorescencia wenfermo ser visible en el interior y alrededor del exterior de las cámaras de reacción, aunque es probable que no será evidente en las primeras etapas de la reacción. Captura de imágenes cada 1-3 min hasta que la reacción alcanza un estado estacionario de fluorescencia. Si una etapa enfocar automáticamente no está disponible, vuelva a enfocar brevemente cada imagen antes de las imágenes tomadas.
NOTA: Mientras que algunos fotoblanqueo ocurrirá, los efectos sobre la fluorescencia relativa debido a photobleaching pueden ser contabilizados por el tiempo que se conoce la tasa de photobleaching. Esta tasa photobleaching se puede estimar mediante la exposición de un estándar fluorescente, tal como una concentración conocida de GFP o una mezcla de fluoróforo, a photobleaching constante durante un periodo de tiempo. - Registre el tiempo transcurrido desde el conjunto de reacción a la primera imagen adquirida.
NOTA: Esto suele tardar 4-5 min.
Análisis 4. Imagen y Procesamiento de Datos
- El uso de un software de análisis de imágenes como ImageJ, seleccione lainterior de las cámaras de reacción como una ROI. Adquirir el valor medio de intensidad de fluorescencia del retorno de la inversión para todas las imágenes.
NOTA: Esta es la huella intensidad de fluorescencia en bruto.- Realice esta tarea en ImageJ utilizando los plugins de serie temporal del analizador y ROI Manager - Usar Series Analyzer para elegir las regiones de interés por el interior de cada cámara de reacción. Establezca "AutoROIProperties" a un área que corresponde al interior de cada cámara de reacción, marque "Add On Click" y seleccione cada cámara.
NOTA: Este paso también se puede hacer uso de la herramienta elipse para dibujar un retorno de la inversión alrededor de la cámara fluorescente. Este tamaño de ROI por lo general corresponde a una elipse 30 x 30 píxeles para una cámara de 10 m de diámetro se ve con un objetivo de 100X. - Resaltar todos los ROI en el Administrador de retorno de la inversión. Utilice la función "Medida Multi" para determinar la media de intensidad de fluorescencia de cada ROI a través de toda la pila imagen.
NOTA: Un plugin llamado StackReg se puede utilizar para alinear la imagen de pila, si es necesario.
- Realice esta tarea en ImageJ utilizando los plugins de serie temporal del analizador y ROI Manager - Usar Series Analyzer para elegir las regiones de interés por el interior de cada cámara de reacción. Establezca "AutoROIProperties" a un área que corresponde al interior de cada cámara de reacción, marque "Add On Click" y seleccione cada cámara.
- Después de la adquisición de las huellas de intensidad de fluorescencia primas para todas las cámaras en un experimento, determinar la componente determinista de la reacción tomando un promedio inter-experimental a través de todos los restos, y restando la media de las trazas primas individuales. Uso de software de análisis de datos como IGOR o MS Excel para este análisis.
NOTA: Esto proporciona ruido traza para cada cámara de reacción. - Analizar el ruido de la expresión génica de estas cámaras de reacción usando los mismos métodos utilizados para analizar la expresión génica de ruido derivado de las células 25.
Representative Results
La clara ventaja de esta plataforma microfabricado está en la aplicación de la elastomérico "válvula de control" controlable que se acciona de manera independiente con el fin de limitar las reacciones de los CFP (Figura 2a). Cuando se acciona el dispositivo, las cámaras de membrana se presionan contra la lámina de vidrio para confinar reactivos fluorescentes en una matriz de cámaras de reacción (Figura 2C). Con el fin de verificar que las cámaras se limitan de forma fiable la reacción a través de la duración del experimento, una FRAP básica (fluorescencia de recuperación después de Photobleaching) prueba se realizó 37. Un fluoróforo (AF 555) se aplica al dispositivo, y la válvula de control se acciona; usando la abertura del obturador del microscopio, un solo pozo confinar el fluoróforo se aisló y se photobleached individualmente (Figura 2D). El bien elegido convirtió oscuro y no se recuperó en el brillo hasta que la válvula de control se despresurizó 20 min60; después, la liberación de la cámara desde el cristal. Esta prueba verifica que estas cámaras de reacción se mantienen bien sellados para la duración del experimento.
En condiciones óptimas, una reacción CFPS expresar una proteína fácilmente visualizado (como GFP o luciferasa) expresa la proteína detectable dentro de unos pocos minutos de ser aplicado a este dispositivo. Durante la vida útil de la reacción, la síntesis de proteínas en el interior y el exterior de las cámaras de reacción se forma la imagen y se cuantificó mediante unidades de medición de la intensidad de fluorescencia dentro de cada cámara (Figura 3A). La intensidad de fluorescencia, correspondiente a la concentración de proteína, se puede asignar en el tiempo para cada cámara de reacción (Figura 3D).
La expresión de genes es un proceso intrínsecamente estocástico que presenta fluctuaciones (ruido) en cada paso molecular (síntesis, la degradación, la unión proteína-ADN, etc.) 20. Una rama de la biología de ruido se centra enel valor probatorio de ruido del circuito gen 41. Expresión en sistemas libres de células tendrá efectos de ruido extrínsecos que surgen de la interacción entre la maquinaria molecular de expresión y las superficies que definen los límites de los recipientes de reacción. Estos efectos extrínsecos probablemente serán más pronunciados como reacciones libres de células están confinados en cámaras de reacción aún más pequeños. La capacidad de realizar time-lapse de múltiples reacciones CFP confinados luego permite que el análisis cuidadoso de la estructura de ruido (magnitud y dinámica) en sistemas libres de células cerradas de manera directamente análoga a los métodos que han sido reportados por los sistemas celulares 25. Figura 3C y 3D muestran la evolución temporal de la expresión de GFP constitutiva de un promotor T7 en una microplaca de 384 pozos de serie con un volumen de bodegas de 15 l, en comparación con los de las cámaras de reacción PDMS 10 micras de diámetro, lo que corresponde a los volúmenes de sólo alrededor de 300 fl, sobre la orden de sietes de magnitud menos. La variabilidad en las tasas de expresión de proteínas en las 10 micras cámaras de reacción es mucho mayor que en las mediciones de placa de pocillos, acercándose a los observados en las células.
Multiplexados reacciones realizadas en el dispositivo exhiben una cinética similar a las reacciones CFP realizadas a granel en un lector de microplacas (Figura 3B), donde hay un aumento rápido en la fluorescencia que mesetas, asume a menudo que es causada por la limitación de recursos dentro del volumen de reacción 42,43 . Este comportamiento de crecimiento determinista, aunque fluctuante, es generalmente consistente a través de todas las cámaras de reacción, y entre los experimentos - promediando trazas entre las cámaras a través de experimentos, la tendencia determinista puede ser restado de los valores del rastreo, dejando sólo los componentes de ruido de la reacción (Figura 4A) . La Figura 4B muestra el ruido de la expresión de GFP después de la eliminación de la componente determinista transitoria (top), Y la autocorrelación del ruido (inferior), mientras que la Figura 4A muestra las huellas correspondientes de las 10 micras cámaras de reacción. La distribución en los tiempos medios de las trazas de autocorrelación da la dependencia de la frecuencia del ruido, mientras que el tiempo cero lag de las trazas de autocorrelación da las magnitudes de los ruidos, como la varianza.
Figura 1. reactivos de síntesis de proteínas libre de células están confinados en cámaras de reacción escala femtoliter con el propósito de medir el ruido de la expresión génica. Los reactivos de un sistema de expresión de la proteína libre de células comercial se utilizan para expresar constitutivamente GFP dentro confinado cámaras de reacción PDMS. Un conjunto de estas cámaras puede ser visualizado con microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo con el fin de caracterizar la expresión de proteínas y el ruido de la expresión génica. El o la intensidad de fluorescenciaf cada cámara de reacción con el tiempo se puede representar como una traza individual. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La fabricación de dos capas dispositivo de microfluidos con cámaras sellable femtoliter escala. (A) Diseño y vista de capas artefacto explotó. El dispositivo se compone de dos capas de PDMS y un cubreobjetos de vidrio. La membrana de PDMS, sellado entre las capas de vidrio de válvulas y de control, lleva a cabo las cámaras de reacción. (B) Imagen SEM de la cámara de reacción PDMS. El diámetro interior es de 10 micras. (C) Esquema de canales de entrada en el dispositivo. Proteínas libre de células de síntesis (CFPA) los reactivos se vuelan a través del canal de reacción. El agua se presuriza en el controlválvula para comprimir las cámaras de reacción contra el portaobjetos de vidrio, el sellado de las cámaras 37. Reproducido de Ref. 37 con permiso de The Royal Society of Chemistry. (D) La recuperación de fluorescencia Después Photobleaching prueba (FRAP) en un solo pozo utilizando FITC indica cámara está bien sellada contra el ambiente externo. El fluoróforo fue capturado en las cámaras (imagen superior) y un solo pozo fue photobleached (imagen inferior). Sin recuperación de fluorescencia se observó en la cámara hasta que fue liberado photobleached la válvula de control. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. EGFP expresión en reacción libre de células Confinados. (A) Imágenes de fluorescencia de sellado reacción c Hambers en puntos de tiempo seleccionados en la reacción. La producción de proteínas se puede ver tanto en el interior de las cámaras de reacción y fuera de las cámaras en el canal principal. (B) EGFP se clonó en un vector pET3a, proporcionando un promotor T7 polimerasa y el terminador y un sitio de unión fuerte ribosoma (RBS). (C) Mediciones de fluorescencia normalizada de la expresión constitutiva de EGFP en una reacción libre de células mayor realizado en un lector de microplacas. Reacciones CFP normalmente producen proteínas rápidamente antes de disminuir a una fluorescencia 'estado estable' - esto se asocia a la limitación de recursos 43. Guiones negros indican la huella promedio. (D) la fluorescencia normalizada de 51 restos de intensidad de fluorescencia primas leídos de 51 cámaras de reacción durante varios experimentos. Guiones negros indican la traza media de varios experimentos, que ilustran el componente determinista de la expresión de la proteína./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. individuales huellas de ruido y autocorrelación de ruido de un sistema celular y libre de células. (A) De Austin et al., 2006. El ruido en la expresión de GFP (arriba) y funciones de autocorrelación normalizada (abajo) adquiridos desde el seguimiento de la producción de las buenas prácticas agrarias en las bacterias que viven 25. Reproducido con permiso de Macmillan Publishers Ltd: [Naturaleza] 25 (Vol. 439), el derecho de autor (2006). (B) El ruido en la expresión de GFP (arriba) y funciones de autocorrelación normalizada (abajo) adquiridas de la producción de GFP en sistema libre de células, seguido en cámaras de reacción dispositivo de microfluidos. Por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La expresión génica en las células es inherentemente ruidosa debido a los pequeños volúmenes celulares y bajo número de copias de reactivos importantes. Biología ruido suele centrarse en las fuentes, el procesamiento, y las consecuencias biológicas de las fluctuaciones en las poblaciones, las concentraciones, posiciones o estados de moléculas que controlan los circuitos y redes de 44 genes. La gran mayoría de este trabajo se ha realizado en los sistemas celulares, que tiene la ventaja de ver el ruido de un circuito de gen en el contexto natural de las redes genéticas dentro de la célula. Sin embargo, los sistemas libres de células permiten la caracterización de las fluctuaciones intrínsecas de un circuito gen individual sin los efectos extrínsecos de confusión 18 que no se pueden evitar en los sistemas celulares. Análisis de ruido puede ofrecer importantes conocimientos físicos en forma genética circuitos están estructurados y cómo funcionan, y se ha utilizado en los sistemas celulares para caracterizar negativo 25 y positivo
La clave de activar la función del diseño es la integración de los arrays de femtoliter-volumen (a escala micrométrica) cámaras de reacción utilizados para confinar los reactivos de un sistema de expresión de proteínas libre de células, con una membrana elastomérica "válvula de control" en PDMS que atrapa el reactivos a una, "tiempo cero" bien definido para inicio de la reacción (Figura 1). Este control permite la cinética de las reacciones implicadas en la síntesis de proteínas que se Folladeudado en tiempo real con alta precisión. Como tal, es importante para administrar reactivos libres de células de modo que la variabilidad inter-experimental se minimiza tanto como sea posible. Este control nos permite evaluar la estructura de ruido de los circuitos genéticos libres de células de una manera que es análoga a las técnicas utilizadas previamente para evaluar la expresión génica en las células vivas.
Como reactivos utilizados en los sistemas de CFP pueden ser sensibles a los ciclos de congelación-descongelación, es importante para mantener los reactivos frío y minimizar el tiempo de los reactivos pasan de descongelar en hielo. Es una buena práctica para probar periódicamente la expresión del sistema CFPS al por mayor con el fin de identificar los cambios en los niveles de expresión con el tiempo - esto se puede hacer en una reacción de 10-15 l en un tubo Eppendorf, o en un dispositivo como un lector de microplacas , que realiza múltiples lecturas con el tiempo para capturar cinética de la reacción. Tomando nota de los tiempos de la edad y el deshielo de los reactivos para cada experimento ayudará a la hora de solucionar bajo l expresiónevels. Además, cuando el montaje de reactivos CFP, es importante señalar que la reacción comenzará una vez que está totalmente montado y se retira del hielo. Con el fin de mantener un "tiempo cero" consistente, es útil para registrar el tiempo después de la iniciación de la reacción CFPS después de la adición final de la entrada de ADN, y para aplicar la reacción tan rápidamente como sea posible para el dispositivo se incubaron. Este proceso debe tomar aproximadamente 4-5 minutos, y la fluorescencia pero no debe ser visible dentro de las cámaras de reacción. Este control asegura que el tiempo disponible para visualizar la parte de crecimiento de la curva de reacción se maximiza.
Antes de ejecutar reacciones PFP en el dispositivo, es recomendable realizar pruebas de control de calidad para verificar que no hay fugas de las cámaras. Una prueba de FRAP se puede realizar (como en la Figura 2D) mediante la aplicación de un fluoróforo en el dispositivo y la exposición de un pozo individual hasta que el pozo es completamente blanqueada. Si las cámaras estánbien sellado, no hay recuperación debe ser visible en el interior del pozo - no debe haber un fuerte contraste entre las paredes del compartimiento y los espacios interiores y exteriores. Si la recuperación de fluorescencia es aparente o las paredes de la cámara de reacción no están bien definidos, la presión sobre la válvula de control debe ser aumentada o el dispositivo se debe comprobar si hay fugas o delaminación de la lámina de vidrio.
Este protocolo ha sido probado con reactivos CFP de una E. comercial kit coli libre de células de expresión de proteínas (escalado a 25 l), aunque otros sistemas robusta CFP pueden ser utilizados. Es posible utilizar volúmenes muy inferiores a 25 l al aplicar reacciones al dispositivo, que puede ser útil cuando el costo de reactivos es un factor limitante en los experimentos. Una vez que los reactivos se añaden al dispositivo y las cámaras de reacción están sellados, no es posible añadir reactivos a la solución sin la válvula de control de accionamiento de-- por lo tanto este dispositivo no es él apropiadoLe para las reacciones que requieren la adición de reactivos durante el curso de la reacción. Este dispositivo también no está optimizada para la observación de las reacciones de los CFP que puedan circular más de 3 horas - los efectos de la deshidratación y secado del dispositivo después de este período de tiempo no han sido evaluados. Si se desean tiempos de reacción más largos, estos efectos pueden ser mitigados mediante el sellado del dispositivo para evitar la evaporación, el cambio de la temperatura de incubación, o mediante el uso de una cámara de humedad. Las modificaciones en el diseño del dispositivo, tales como estructuras nanoporosos en las paredes de la cámara 49,50 o la inclusión de una capa de membrana porosa, representan algunos métodos que podrían permitir el intercambio de reactivos y así alargar los plazos de reacción.
Compartimientos de reacción Microfabricated de volumen uniforme son valiosas para el mantenimiento de las dimensiones consistentes a través de experimentos y muy adecuado para la investigación en "reacciones secundarias" con las paredes del compartimiento. A diferencia de los métodos que no utilizantécnicas de n-microfabricados, estas reacciones se deben evaluar en pequeñas cantidades, y no proporcionan flexibilidad dimensional durante los experimentos. Sin embargo, el diseño controlable para estas cámaras de reacción es muy adecuado para la microscopía de lapso de tiempo, y puede ser un complemento que ilumina a un método de alto rendimiento para el parto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
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