Abstract
無細胞系は、複雑なリソースの共有から単離された生物学的反応の特定のネットワークをプローブするための柔軟なプラットフォームを提供する（ 例えば、グローバルな遺伝子発現、細胞分裂）が生きた細胞内で発生しました。しかしながら、従来のマクロスケールのバルク反応器で使用されるそのようなシステムは、しばしば、彼らの生活のマイクロスケールの対応物の特性の動的挙動及び効率を示すことができない。反応ダイナミクスの内部細胞構造と規模の影響を理解することは、複雑な遺伝子ネットワークを理解するために非常に重要です。ここでは、囲まれた分子系の柔軟な特性評価を可能にしながら、携帯規模なボリュームで無細胞反応を閉じ込める微細加工デバイスを報告します。この多層化ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）装置（オープンとクローズ）を作動させることができるエラストマー膜にフェムトリットル規模の反応チャンバを含んでいる。作動すると、チャンバは、無細胞タンパク質合成（CFPS）反応を閉じ込めるコマ撮り蛍光顕微鏡を用いて時間をかけて反応速度の可視化を可能にする、蛍光タンパク質を発現する。ここでは、このデバイスがCFPS遺伝子回路を特徴付けるために、それによってセルラシステムにおいて使用されるノイズ分子生物学技術の使用を可能にする、セルラーシステムを特徴付けるために使用されるものに直接的に類似した方法でCFPS反応のノイズ構造を測定するために用いることができる方法を示すと無細胞環境との相互作用。
Introduction
無細胞系は、生細胞の研究では避けられないようなフィットネス、除算、突然変異などの複雑な要因から無料で生体反応を見るための簡単かつ柔軟なプラットフォームを提供します。このようなアプローチは、タンパク質の相互作用2、翻訳3-7の基本的な側面の調査のプロービング、膜タンパク質1の特徴付けを含む細胞系を研究するために使用されてきた。最近、無細胞系は、合成生物学8-10のために実行可能なプラットフォームとして足場を得るために始めている。このようなアプローチの魅力は、彼らが生きた細胞内の反応ダイナミクスに影響を与えるリソースの共有と「外因性ノイズ」から合成生物学を解放することである。しかし問題は、無細胞反応が埋め込まれた物理的環境は、反応の進行と結果に影響を与える方法として残る。無細胞反応環境 - 特に限定さenvironm細胞関連のボリュームにアプローチエントは - 特徴付けが乏しいまま。無細胞タンパク質合成（CFPS）リットル規模の反応容量11にマイクロリットルの範囲で同等の動力学を示す」、スケールフリー」であるとしての従来考えられている。それにもかかわらず、細胞のスケール·ボリュームに閉じ込め反応が有意にタンパク質の発現率が12に影響を与えることが示されている。
無細胞反応の確率的性質 - これらのシステムが近づき、あるいはフェムトリットル体積未満になるように、特には - 特に重要であり得る。遺伝子発現におけるノイズ小細胞ボリュームとコンポーネントの高い密度が非常に低い人口レベルに重要な分子の多くを強制としての性質が大幅に閉じ込めによって影響される- 1 FLボリューム内の例えば、 大腸菌（Escherichia coli）を閉じ込めるような多くの4300などの異なるポリペプチドの下で数百の異なるプロモーターの誘導性の制御13。この固有のノイズは、走化性14を含む多数の生物学的プロセスにおいて中心的な原動力として活躍複製および待ち時間15、溶解および溶原16,17の間にλファージの決定、および能力の間バチルスsubtillus意思決定の間にHIVの決定を示唆されているそして胞子形成17。無細胞合成生物学、その後細胞遺伝子回路やネットワークの確率的性質を探求し、特定の技術的目標を達成するために、これらの動作を操作する機会の両方を提供します。セルラーシステムのノイズ挙動は18-27をよく研究してきたが、特に携帯スケールで、無細胞系8の基本的なノイズの挙動の少ない探査があった。
ここでは、無細胞合成生物学における確率的影響の研究のためのプラットフォームを提示する。この微細加工されたプラットフォームは、フェムトリットルスケールの反応cを含んでいるすぐにオープン（自由拡散で、チャンバーの外）と（チャンバ内に閉じ込め反応物）の状態をクローズ間で移行することができるhambers。閉じた状態では、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する無細胞タンパク質合成（CFPS）反応物質を閉じ込めると、タイムラプス蛍光顕微鏡28（ 図1）を用いて遺伝子発現をたどる。我々は、細胞25を特徴付けるために使用されるものに直接的に類似した方法で遺伝子発現の確率変動の構造を測定することによって、この無細胞の環境を特徴づける。無細胞反応を閉じ込めるための非微細加工法は、小胞およびリポソーム29-32、油中水型エマルジ ョン12、及び多孔質媒体33を含む。これらの方法は限られたボリューム34のサイズ分布の制御を提供することができるがしかし、微細加工方法があってもナノスケールで、しっかりと指定された寸法を有する高度に複製可能な機能を作成します。さらに、これらの剛性の構造を簡単に蒸発または外部環境の変化の影響を受けやすいことなく経時的に追跡することができる。前作8,35で用いられる微細加工された容器の設計を迅速に反応が（時間ゼロ）を開始した時点の明確な割り当てを複雑、反応開始後、反応槽を密閉する ことができない。ここに提示された方法を用いて、4-5分だけ、それによって明確に定義された「時間ゼロ」を提供し、装置上の反応の開始との間の可視化に必要とされる。以下のプロトコルは、光リソグラフィ、素子アセンブリ、デバイステスト、および画像解析のための方法を含む、このデバイスの製造および試験するための方法を記載している。
Protocol
デバイスのマスターズの1。光リソグラフィ
- 少なくとも1時間〜250℃のホットプレート上に清浄なシリコンウェーハを脱水する。
注：それはマスターを準備する際、ユーザー·エラーの場合には、複数のウェハを使用することをお勧めします。 - フォトレジストアリコートを準備します。 SU-8希釈剤としてシンナーを使用して1：1の比SU-8 2015レジスト及び2におけるSU-8 2015フォトレジストの希釈の両方のアリコートを準備します。
注：約1ミリリットルのフォトレジストをスピンコーティングする一枚のウェハのために必要とされる。 - これらのマスターを製造するための3のマスクパターンを準備します。 1パターニング膜チャネルおよび他のパターニングの反応室：膜マスターのために、二つのマスクを準備します。コントロールバルブのマスターのために、一つだけのマスクパターンを用意。
注：マスクパターニングを含むリソグラフィ技術、の詳細については、デバイス設計のより詳細な説明については、伊藤と岡崎、2000年36参照Fowlkesとコリアー、2013を参照してください37。 - メンブレンマスターを準備
- スピンコート2：45秒、1,000 rpmでウェーハ上の1 SU-8 2015レジスト希釈。
- 2分間95℃でソフトベークウェハ。コンタクトアライナーを使用して、10秒間、膜チャネルパターンを有するウェハを露出し、95℃で2分間、露光後ベークを行う。
- 1分間のSU-8現像液中でのウエハの開発、またはフォトレジスト残渣が除去されるまで。上から下に移動し、イソプロパノールでウェハをすすぐ。窒素で乾燥したウエハは、再び、上から下に移動する。 4分間180℃でベークウェハ。
- 45秒間、2000rpmで1 SU-8の希釈：スピンコートは2で再びウェーハをパターン化。
- ソフトベークは、95℃で2分間、ウェハをパターン化。コンタクトアライナーを使用して、反応室パターンでパターン化されたウェハを合わせ、10秒間露光する。 95℃で2分間、露光後ベークを行う。
- ステップ1.4.3で説明したようにウェーハを開発する。ウエハを現像し、乾燥した後、4分間180℃でベークウェハ。
NOTE：ウエハは、前のステップで使用したのと同じ現像液で現像することができる。
- コントロールバルブマスターを準備
- スピンコートは、45秒間、2000rpmでクリーンなウエハ上にSU-8フォトレジストを原液。
- 6分間95℃でソフトベークウェハ。コンタクトアライナーを使用して、10秒間の制御弁パターンでウエハを露光する。 6分間95℃で露光後ベークを行う。
- 2分間のSU-8 Developerでウエハーを開発し、または残基が除去されるまで。上から下に移動し、イソプロパノールで洗浄します。 4分間180℃で窒素ベークによるドライウェハ。
2. PDMSデバイスの製造
- 蒸着によって〜0.2ミリリットルトリメチルクロロ持つすべてのマスターをSilanize。
- すばやくシラン化剤を数滴RTで密閉容器にマスターを囲みます。
注：他のシラン化プロトコルは許容できる38場合に実行properl。yは、PDMSは除去するのが容易になります。
- すばやくシラン化剤を数滴RTで密閉容器にマスターを囲みます。
- 同様の多層弁で実証されているように39を設計し 、デバイスの膜及びコントロールバルブ層の両方のために異なる比率で商用ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）ベースと硬化剤を混合する。 1と5：1の塩基の比率：20を使用して膜および制御弁モールドのための硬化剤を、それぞれ。
- メンブレン型の場合は、硬化剤を0.5gと塩基10gを混合する。
注：このボリュームはメンブレンマスター上にスピンコートになります。 - 1：1の比コントロールバルブモールドの場合は、5でベースと硬化剤を混ぜる。制御弁を成形するのに必要なPDMSの量は、制御弁のマスタを保持するために使用されるコンテナに依存するであろう。マスターは、PDMSの〜1センチメートルで被覆されているような容器を満たす。
- メンブレン型の場合は、硬化剤を0.5gと塩基10gを混合する。
- 気泡が見えなくなるまで徹底的に真空チャンバー内に両方PDMSの準備、そして脱ガスそれらをミックス。耐熱性に制御弁マスタを配置容器、ガラス皿など。 1の比率でマスター上PDMS、および脱ガス容器の二回目：慎重5を注ぐ。
- 制御弁PDMS容器は脱気されている間に、スピンコートは20：慎重に気泡の発生を最小限に抑えるために、膜のマスターの上にPDMS混合物を注ぐことにより、膜マスターの1比のPDMSは、その後スピンコートマスターを1000rpmで45秒間。
- 部分的に膜マスター制御弁マスタ15分間、6分間80℃のオーブン中で両方のマスターを治す。
注：部分的に硬化すると、PDMSは、その形状を保持する必要がありますが、材料がわずかに粘着性になります。 PDMSがまだ硬化していない場合は押されたときに、材料がその形を保持するまで、一度に数分刻みで再び焼く。 - そっと離れて金型を剥離、制御弁マスターから長方形のPDMSモールドをカット。 0.75ミリメートル穴パンチを用いて成形コンポーネントを介して注入口の穴をパンチ。
注：穴23ゲージblunを挿入することにより洗浄することができる必要であれば、tの先端針、金型外部は、セロハンテープで洗浄してもよい。 - 膜マスターに反応チャンバを配置すること、光学顕微鏡を用いて、反応室の膜の機能を制御弁モールド部品を整列し、膜のマスターの上に直接コントロールバルブコンポーネントを配置。オリエントデバイスの左下隅に制御弁入口、および膜マスターの反応室とチャンネルが長方形のコントロールバルブの内側に表示されていることを確認してください。
- 2時間80℃で整列モールド部品を焼く。
注：膜および制御バルブの型は今一緒に密封し、1モールドとして操作される。 - 膜を穿孔しないように、非常に静かにマスターから金型を剥離し、離れて膜マスターから層状のPDMSモールドをカット。
- 入口パンチ0.75 mmのパンチを使用して細胞抽出入力の穴出口。両方の層を通って穴を開け、ステップ2.6で説明したのと同じ方法でそれらを清掃してください。
- 誘導結合プラズマクリーナー、プラズマ御馳走両方の型（膜面上）と20秒間10.5 Wで0号カバーガラスを使用した。直ちにプラズマクリーナーからカバースリップやカビを除去し、ガラスと金型との間のエアポケットを最小限にしようとすると、ガラスに向かって、膜側のコンポーネントを層。メンブレン入力チャネルに直接押さないでください、または膜が困難反応物質とのチャネルを埋めるために作り、ガラスにアニールすることができる。
- ガラス層を破損しないように組み立て、部品の取り扱いには特に注意してください。デバイスは高倍率油浸対物レンズを使用してガラスカバースリップを通して画像形成されなければならないような薄いカバーガラスを使用する - ガラスが厚すぎると、デバイスの機能が表示されない場合があります。
- 最後に、2時間80℃で完了したデバイスを硬化させる。
3.実験のセットアップFOrは無細胞タンパク質合成反応
- 1時間脱イオン水中で煮沸することによりデバイスを水和。
注：完全に水和した場合、デバイスは曇った外観を持つ必要があります。デバイスはまた、それを水和させるために、室温で滅菌水にO / Nを残すことができる。 - インキュベーションチャンバーを倒立顕微鏡を用いて、30℃の周囲温度を設定する。
注：この温度は、そのように他の反応のための最適温度は40を変えることができる、T7プロモーターでGFPの発現を最適化するように選択した。 - マウントデバイスは、セロハンテープでステージホルダーを顕微鏡及びローカル水和を維持するために、湿ったティッシュペーパーによるデバイスの縁をラップする。
- 制御弁の作動および試薬入力の窒素ガス圧を調節するために二つの高精度の閉ループ電圧圧力変換器を使用する。
注：他の不活性ガスを用いてもよいが、このプロトコルは、低純度の窒素でテストされている。- によって最初にトランスデューサを接続しますセプタムの蓋、4 mlのガラスバイアル中に保持された貯水槽に24ゲージのPTFEチューブ。 23ゲージの鈍先端針によって終了第二のチューブを使用して制御弁入口にリザーバを接続します。
注：両方のチューブが2鋭い23ゲージの針を持つ貯留隔壁を貫通している。 - オス - オスルアーロックコネクタに接続された24ゲージのPTFEチューブにより、第2の変換器を接続します。デバイスごとに個別に組み立てられた別の23ゲージ鈍先端針とチューブで接続されたルアーロック23ゲージの針にこれを取り付けます。この針は、膜反応流路に接続する。反応チャネル、入力試薬から水をフラッシュするために使用する。
- によって最初にトランスデューサを接続しますセプタムの蓋、4 mlのガラスバイアル中に保持された貯水槽に24ゲージのPTFEチューブ。 23ゲージの鈍先端針によって終了第二のチューブを使用して制御弁入口にリザーバを接続します。
- 無細胞タンパク質発現系を用いて、製造業者の説明書に従って、氷上でCFPS反応のために部品を組み立てる。氷上でCFPS試薬を保持費やす時間を最小限にし、組み立てた直後にデバイスに反応を配置。
注：このデバイスは、されている商用Eで使用大腸菌タンパク質発現キットおよび構成的にGFPを発現するプラスミドを抽出する。総反応容量は25μlにスケーリングされた - それは、所望であれば、反応物のためのさらに低いボリュームを使用することも可能である。 CFPS試薬は、サイクルの凍結融解に敏感である傾向があるように、実験の前に、適切な音量での試薬のアリコートを行うことが有用であろう。他の試薬を反応混合物に添加してもよいが、反応が完全にデバイスに適用される前に組み立てる必要があります。- 最後のDNA入力を追加し、反応を組み立てます。
注：エッペンドルフチューブで組み立てた後、氷上に保持されていない場合には、CFPS反応が開始されます。デバイスに試薬を適用し、実験を開始するのにかかる時間は変更される場合がありますので、反応が組み立てられ、混合された後、タイマーをスタートすることが有用である - これは、一貫性の実験、およびトラブルシューティングを支援間のタイムスケールを維持します。
- 最後のDNA入力を追加し、反応を組み立てます。
- 使い方ステップ3.4.2で説明したチューブと針コネクタ、1mlシリンジを使用してチューブに組み立て反応を引き出す。反応室入口に鈍先端針を挿入します。注射器から針コネクタを外し、反応室トランスデューサに使用するオス - オスコネクタに取り付けます。
- チャンネルを埋めるためにCFPS反応物質に圧力（<10 PSI）を適用します。反応が満たされたとき、針を外します。
- 制御弁入口に他のトランスデューサから鈍いチューブを挿入します。まだ制御弁を加圧しないでください。
- ステージ上に搭載デバイスを配置します。明視野イメージングを使用して、100X油浸対物レンズとの反応チャンバを見つける。
- アクチュエ20 psiまで制御弁トランスデューサを加圧することにより制御弁。制御弁が作動すると、膜中の目に見える変化は明らかであろう。反応チャンバーの底部に焦点を当てる。
- 画像取得を開始します。蛍光の成長のwそれは可能性が高い反応の初期段階では明らかではないでしょうが、病気、内部に、反応室の外側の周りに見えるように。反応が定常状態の蛍光に達するまで、すべての1-3分の画像をキャプチャします。自動的にフォーカスステージが使用できない場合は、簡単に画像が撮影される前に各画像をリフォーカスする。
注：いくつかの光退色が発生しますが、原因退色に対する相対蛍光の影響は限り光退色の速度が知られているように会計処理することがあります。この光退色率は、ある期間にわたって一定の光退色に、そのようなGFPの既知の濃度またはフルオロフォアの混合物のような蛍光標準を露光することによって推定することができる。 - 取得された第1の画像に反応アセンブリからの経過時間を記録します。
注：これは一般的に4〜5分かかります。
4.画像解析とデータ処理
- そのようなImageJのような画像解析ソフトウェアを使用して、選択しROIとして反応チャンバの内部。全画像のROIの平均蛍光強度値を取得する。
注：これは生の蛍光強度トレースです。- 各反応室の内部の周りの関心領域を選択するために使用して時系列分析装置 - 時系列アナライザとROIマネージャープラグインを使用して、ImageJので次の作業を行います。 、各反応室の内部に対応する領域に「AutoROIPropertiesの「設定」をクリックで追加」をチェックし、各チャンバを選択します。
注：このステップは、蛍光室の周りにROIを描画する楕円ツールを使用して行うことができる。このROIのサイズは通常100X目的で閲覧直径10μm室用の30×30ピクセルの楕円に対応している。 - ROIマネージャですべてのROIを強調表示します。全体画像スタックを通して各ROIの蛍光強度の平均値を決定するために、「マルチメジャー」機能を使用してください。
注：STAという名前のプラグインckRegは、必要に応じて、画像スタックを整列させるために使用することができる。
- 各反応室の内部の周りの関心領域を選択するために使用して時系列分析装置 - 時系列アナライザとROIマネージャープラグインを使用して、ImageJので次の作業を行います。 、各反応室の内部に対応する領域に「AutoROIPropertiesの「設定」をクリックで追加」をチェックし、各チャンバを選択します。
- 実験中のすべての室の生の蛍光強度のトレースを取得した後、すべてのトレース間での相互実験的平均を取ること、そして個々の生の痕跡から平均値を減算することにより反応の決定論的構成要素を決定する。この分析のためにそのようなIGORやMS Excelなどのデータ解析ソフトウェアを使用してください。
注：これは各反応室用のノイズトレースを提供します。 - セル25から誘導された遺伝子発現のノイズを解析するために使用したのと同じ方法を使用して、これらの反応チャンバからの遺伝子発現のノイズを解析する。
Representative Results
この微細加工されたプラットフォームの明確な利点は、独立してCFPS反応（ 図2A）を閉じ込めるために作動される制御可能なエラストマー「制御弁」の適用である。装置が作動すると、膜チャンバは、反応チャンバ（ 図2C）の配列に蛍光試薬を閉じ込めるためにスライドガラスに押し付けられる。チャンバが確実に実験期間を通して反応を閉じ込めることを確認するために、基本的なFRAP（退色後の蛍光回復）試験は、37を実施した。フルオロフォア（AF 555）は、デバイスに適用し、制御弁が作動した。顕微鏡のシャッター開口部を使用して、（ 図2D）を単一のウェルフォアを単離し閉 じ込めて個別に退色。暗くなり、制御弁が20分を減圧したまでは明るさで回復しなかっただけでなく、選択60;以降、ガラスからチャンバを解放する。このテストでは、これらの反応室は実験期間中、よく密封されたままであることを確認します。
最適条件では、（例えば、GFPまたはルシフェラーゼなど）を簡単に可視化タンパク質を発現CFPS反応は、このデバイスに適用されて、数分以内に検出可能なタンパク質を発現する。反応の寿命にわたって、反応チャンバの内部と外部でのタンパク質合成は、画像化され、各チャンバ（ 図3A）内の蛍光強度の単位を測定することによって定量した。蛍光強度は、タンパク質濃度に対応し、各反応チャンバー（ 図3D）のための時間をかけてマッピングすることができる。
遺伝子発現は、すべての分子ステップ（結合合成、分解、タンパク質、DNA など ）20における揺らぎ（雑音）を導入し、本質的に確率論的なプロセスである。ノイズ生物学の一つの枝は上に焦点を当て遺伝子回路のノイズ41の証明力。無細胞系での発現は、発現の分子機構と反応容器の境界を画定する表面間の相互作用に起因する外因性のノイズの影響を有するであろう。無細胞反応はさらに小さな反応室に閉じ込められているように、これらの外因の影響はおそらくより顕著になります。複数の閉じ込められたCFPS反応のタイムラプスイメージングを実行する能力は、その後セルラーシステム25のために報告されている方法とは直接類似の方法で閉じ込められた無細胞系でノイズ構造（大きさとダイナミクス）の慎重な分析を可能にします。 図3Cそして3Dは約、わずか約300 flのボリュームに対応する、PDMSの反応チャンバー直径10μmで比較して、15μlのウェル容積を標準384ウェルマイクロプレートにT7プロモーターから構成的GFP発現の時間経過を示す7順小さい大きさの秒。 10μmの反応チャンバーにおけるタンパク質発現率の変動は、細胞に見られるものに近づいて、ウェルプレートの測定よりもはるかに高い。
デバイス上で実行多重化反応は、マイクロプレートリーダープラトーは、しばしば反応容積42,43内のリソース制限に起因すると仮定し、蛍光の迅速な増加があった（ 図3B）上に一括で行わCFPS反応と同様の速度を示す。この決定論的な成長挙動は、変動するものの、全ての反応チャンバを横断し、実験の間、一般的に一致している-の実験にわたってチャンバ間のトレースを平均化することによって、決定論的な傾向は、反応（ 図4A）のノイズ成分のみを残して、トレース値から減算することができる。 図4Bは、決定論的、過渡的成分（上部の除去後にGFP発現ノイズを示し）、ノイズ（下）の自己相関、 図4Aは、10μmの反応チャンバ内の対応するトレースを示している。自己相関波形のゼロ遅延時間分散として、ノイズの大きさを与え、一方自己相関波形の半時間の分布は、ノイズの周波数依存性を与える。
図1の無細胞タンパク質合成反応物は、遺伝子発現のノイズを測定する目的でフェムトリットルスケールの反応チャンバー内に閉じ込められている。商業無細胞タンパク質発現系からの反応物は、閉じ込められたPDMSの反応チャンバの内側を構成的に発現するGFPに使用されている。これらのチャンバのアレイは、タンパク質発現および遺伝子発現雑音を特徴付けるために、経時的蛍光顕微鏡で可視化することができる。蛍光強度oを時間をかけて各反応室は、個々のトレースとしてプロットすることができるF。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
密封可能なフェムトリットルスケールのチャンバを有する二層マイクロ流体デバイスの作製図2（A）のレイアウトとデバイス層の分解斜視図。デバイス二つPDMS層とガラスカバースリップで構成されている。ガラスおよびコントロールバルブ層の間に封入PDMS膜は、反応チャンバを保持する。 （B）PDMS反応チャンバのSEM像。インテリア直径は10μmである。 （C）デバイス内の入力チャンネルの概略図。無細胞タンパク質合成（CFPS）試薬が反応チャネルを流している。水は、コントロールで加圧され弁は、チャンバ37を密封する、スライドガラスに対する反応チャンバを圧縮する。文献からの再生。化学の王立協会から許可を得て37。 FITCを用いて、単一のウェルに（FRAP）テストを退色した後、（D）蛍光回復は、チャンバが外部環境に対して十分に密封されていることを示します。フルオロフォアは、チャンバー（上の画像）で捕獲され、単一のウェルは、（下の画像）退色した。制御弁がリリースされるまで無蛍光回復は退色チャンバー内に見られなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
閉じ込められた無細胞反応図3. EGFP発現。（A）密封された反応cの蛍光画像反応中の選択された時点でのhambers。タンパク質産生は、反応チャンバの内部に主流路におけるチャンバー内外見ることができる。 （B）EGFPはT7ポリメラーゼプロモーター及びターミネーターと強力なリボソーム結合部位（RBS）を提供する、Pet3aベクターにクローニングした。 （C）マイクロプレートリーダーで行うバルク無細胞反応におけるEGFPの構成的発現の正規化蛍光測定。 CFPS反応は、通常、「定常状態」蛍光遅くする前に迅速にタンパク質を産生する-これは、リソースの制限43と関連している。ブラックダッシュは平均トレースを示している。 （D）は、いくつかの実験上の51の反応室から読み出さ51生の蛍光強度トレースの正規化蛍光。ブラックダッシュは、タンパク質発現の決定論的な構成要素を説明するいくつかの実験、全体の平均トレースを示している。/52616/52616fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.個々のノイズトレース·細胞と無細胞系の雑音自己相関 。細菌25生体内GFP産生を追跡から取得したGFP発現（上）でオースティンら 、2006、ノイズ正規化自己相関関数（下）から（A）。 [ネイチャー] 25（。巻439）、著作権（2006）：マクミラン出版社社から許可を得て転載。マイクロ流体デバイスの反応チャンバー内で追跡（B）GFP発現（上）と無細胞系におけるGFPの生産から取得した正規化自己相関関数（下）のノイズ、。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
Discussion
細胞における遺伝子発現に起因小セルラーボリュームと重要な反応物の低コピー数に本質的にノイズが多い。ノイズ生物学は、多くの場合、ソース、処理、および遺伝子回路およびネットワーク44を制御する分子の集団、濃度、位置、または状態の変動の生物学的結果に焦点を当てています。この作業の大部分は、細胞内の遺伝子ネットワークの自然な文脈の中で遺伝子回路のノイズを表示するという利点を有するセルラーシステムで行われた。しかし、無細胞系は、セルラーシステムでは回避することはできません交絡外因の影響18ずに個々の遺伝子回路の本質的な変動の特徴付けを可能にする。ノイズの分析は、それらがどのように機能するか、遺伝的回路構成され、どのように重要な物理的洞察を提供することができ、負と正25を特徴付けるために、セルラーシステムで使用されている
トラップPDMSにおけるフェムトリットル体積（ミクロン規模の）反応チャンバーのアレイの統合は、エラストマーで、無細胞タンパク質発現系の反応物質を閉じ込めるために使用される「制御バルブ」は、膜設計の機能を有効にするキー反応開始のための明確に定義され、「時間ゼロ」は、反応体（ 図1）。この制御は、タンパク質合成に関与する反応の動力学はfollにすることができ高精度でリアルタイムに支払うべき。実験間の変動はできるだけ最小化されるようにこのように、無細胞反応物を管理することが重要である。この制御は、以前に生きた細胞における遺伝子発現を評価するために使用される技術に類似する方法で、無細胞遺伝子回路のノイズ構造を評価することを可能にする。
CFPSシステムで使用される反応物が融解サイクルの凍結に敏感であることができるように、反応物を氷上で解凍費やす時間を冷たい反応物を維持し、最小限に抑えることが重要である。これは、定期的に時間をかけて発現レベルの変化を同定するために、バルクでCFPS系の発現を試験することをお勧めします - これは、エッペンドルフチューブ中で、またはマイクロプレートリーダーなどのデバイス10〜15μlの反応で行うことができる複数の反応速度をキャプチャするために経時的に読み取って実行する。低い発現リットルのトラブルシューティングを行う場合、すべての実験のための反応物の年齢と解凍時間は助けるに注目evels。 CFPS試薬を組み立てる際さらに、それは完全に組み立てられたと氷から除去されると、反応が開始されますことに注意することが重要です。一貫性のある「時間ゼロ」を維持するためには、DNAの入力の最後の添加後CFPS反応の開始後の時間を記録するために、インキュベートデバイスに可能な限り迅速に反応を適用することが有用である。このプロセスは、約4〜5分を取る必要があり、蛍光がまだ反応チャンバー内では表示されません。この制御は、反応曲線の成長部分を視覚化するために利用できる時間が最大化されることを保証する。
デバイス上のCFPS反応を実行する前に、それがチャンバーからの漏れがないことを確認するために品質管理テストを実行することをお勧めします。 FRAP検査装置にフルオロフォアを印加し、ウェルを完全に漂白されるまで、個々のウェルを露光することにより（ 図2Dのように）行うことができる。チャンバーはしている場合よく密封された、全く回復が十分に内側に見えるべきではない - コンパートメントの壁や内部と外部空間の間の著しい対照があるはずです。蛍光回復が明らかであるか、または反応室の壁は十分に定義されていない場合、制御バルブへの圧力が増加するか、デバイスをスライドガラスからの漏れや剥離をチェックすべきである。
このプロトコルは、市販のEからCFPS試薬でテストされています他の堅牢なCFPSシステムが使用され得るが、 大腸菌 （25μlにスケーリングされた）無細胞タンパク質発現キット。これは、試薬コストが実験における制限因子である場合に有用である可能性がある、デバイスへの反応を適用するとき、25μlのよりもはるかに低いボリュームを使用することが可能である。反応物をデバイスに加え、反応チャンバは密封されると、制御弁を非作動することなく、溶液に反応物質を追加することは不可能である - したがって、このデバイスはSUITABはないル反応の過程での試薬の添加を必要とする反応のため。この装置はまた、より長い3時間以上実行することがCFPS反応を観察するために最適化されていない - この期間の後、デバイスの脱水および乾燥の効果が評価されていない。より長い反応時間が必要な場合は、これらの効果は、湿度チャンバを使用することにより、蒸発を防ぐために密封装置インキュベーション温度を変化させることによって軽減され得る。そのようなチャンバ壁49,50または多孔質膜層を含めることで、ナノ多孔質構造のような装置設計への変更は、試薬の交換を可能にし、従って、反応の時間スケールを長くすることができ、いくつかの方法を表す。
均一なボリュームの微細加工反応コンパートメントはコンパートメント壁と「副反応」に実験や調査のために非常に適して全体で一貫した寸法を維持するために価値がある。使用方法とは異なりなしN-、微細加工技術は、これらの反応は、小さな数字で評価されなければならない、と実験中の次元の柔軟性を提供していません。しかしながら、これらの反応チャンバ用の制御設計は、タイムラプス顕微鏡検査のために非常に適しており、閉じ込めのハイスループット方法に照明相補体であってもよい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
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