Abstract
Cellefrie systemer gir en fleksibel plattform for undersøkelser bestemte nettverk av biologiske reaksjoner isolert fra komplekset ressursdeling (f.eks global genekspresjon, celledeling) oppstått i levende celler. Men slike systemer, som brukes i konvensjonelle makro-skala bulk reaktorer, ofte ikke klarer å vise de dynamiske atferd og effektivitet som er karakteristiske for sine levende mikro-skala kolleger. Forstå effekten av intern celle struktur og skala på reaksjons dynamikk er avgjørende for å forstå komplekse genet nettverk. Her rapporterer vi en microfabricated enhet som begrenser cellefrie reaksjoner i cellulære skala volumer samtidig som fleksibel karakterisering av vedlagte molekylære systemet. Dette flerlags poly (dimetylsiloksan) (PDMS) enhet inneholder femtoliter stilt reaksjonskamrene på en elastomer membran som kan aktiveres (åpen og lukket). Når den er aktivert, kamrene begrense Cell-Free proteinsyntese reaksjoner (CFPS)uttrykker en fluorescerende protein, noe som åpner for visualisering av reaksjonskinetikk over tid ved hjelp av time-lapse fluorescerende mikroskopi. Her viser vi hvordan denne anordningen kan benyttes for å måle støy strukturen av CFPS reaksjoner på en måte som er direkte analog med dem som anvendes for å karakterisere cellulære systemer, for derved å muliggjøre bruk av støy biologiske teknikker som brukes i celledelte systemer til å karakterisere CFPS genet kretser og deres interaksjon med cellefritt miljø.
Introduction
Cellefrie systemer tilbyr en forenklet og fleksibel plattform for visning av biologiske reaksjoner fri fra kompliserende faktorer som fitness, divisjon, og mutasjon som er uunngåelig i studiet av levende celler. Slike fremgangsmåter er blitt anvendt for å studere cellulære systemer, inkludert karakterisering av membranproteiner 1, den sondering av protein interaksjoner 2, og utforskning av de grunnleggende aspekter av oversettelses 3-7. Nylig cellefrie systemer har begynt å få fotfeste som levedyktig plattformer for syntetisk biologi 8-10. Anken av slike tilnærminger er at de gratis syntetisk biologi fra ressursdeling og 'ytre støy "som påvirker reaksjons dynamikk i levende celler. Imidlertid forblir spørsmål med hensyn til hvordan det fysiske miljø som er innleiret cellefrie reaksjoner påvirker utviklingen og utfall av reaksjonen. Cellefrie reaksjons miljøer - spesielt begrenset environmentene som nærmer celle-relevant volum - er fortsatt dårlig karakterisert. Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) er konvensjonelt tenkte på som "skala-fri, 'stille tilsvarende kinetikk tvers av en rekke mikroliter til liter skala reaksjonsvolumer 11. Likevel har avgrensa reaksjoner på cellulære skala volumer blitt vist å påvirke protein ekspresjonshastigheter 12.
Den stokastiske natur cellefrie reaksjoner - spesielt da disse systemene tilnærming eller selv gå under femtoliter volumer - kan være av særlig betydning. Støy i genekspresjon er en egenskap sterkt påvirket av innesperring som små cellevolum og høye tettheter av komponentene tvinger mange av de viktige molekyler for svært små populasjonsnivå - f.eks, Escherichia coli rammen innenfor et 1 fl volum så mange som 4.300 forskjellige polypeptider i henhold den induserbare kontroll av flere hundre forskjellige promotorer 13. Denne iboende støy har vært innblandet som en sentral drivkraft i mange biologiske prosesser, inkludert kjemotaksis 14, HIV beslutning mellom aktiv replikering og ventetid 15, den λ fag beslutning mellom lyse og lysogeni 16,17, og Bacillus subtillus beslutning mellom kompetanse og sporulering 17. Celle-free syntetisk biologi gir da både en mulighet til å utforske de stokastiske egenskapene til cellulære genet kretser og ledningsnett, og manipulere disse atferd for å oppnå konkrete teknologiske mål. Mens støy oppførsel av cellulære systemer har blitt godt undersøkt 18 til 27, har det vært liten utforskning av den grunnleggende virkemåten til støy cellefrie systemer 8, spesielt på celle skala.
Her presenterer vi en plattform for studiet av stokastiske effekter i celle-free syntetisk biologi. Dette microfabricated plattform inneholder femtoliter-skala reaksjon cHambers som kan være raskt overført mellom åpen (fri diffusjon inn og ut av kammeret) og lukkede (reaktanter trange innenfor kammeret) stater. I lukket tilstand, nøyer vi Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reagenser som uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP), og følg genuttrykk ved bruk av time-lapse fluorescens mikros 28 (figur 1). Vi karakteriserer denne cellefritt miljø ved måling av strukturen av den stokastiske variasjoner i genekspresjon på en måte som er direkte analog med dem som anvendes for å karakterisere 25 celler. Ikke-microfabrication metoder for å avgrense cellefrie reaksjoner omfatter vesikler og liposomer 29-32, vann-i-olje-emulsjoner 12 og porøse media 33. Men mens disse metodene kan gi kontroll over størrelsesfordelingen av de lukkede volumene 34, microfabrication metoder lage svært kopierbare funksjoner med tett angitte dimensjoner, selv på nanoskala.Videre kan disse stive strukturer lett spores over tid uten å bli utsatt for fordampning eller endringer i det ytre miljø. Microfabricated container design brukes i tidligere arbeid 8,35 kan ikke raskt forsegle reaksjonskamrene følgende reaksjon initiering, kompliserer den klare oppdrag av tiden når reaksjonen ble initiert (tid null). Ved hjelp av fremgangsmåten som presenteres her, er kun 4-5 min nødvendig mellom initiering og visualisering av reaksjonen på anordningen, for derved å tilveiebringe en veldefinert "tid null". Følgende protokoller beskriver metoder for fabrikasjon og testing av denne enheten, inkludert optisk litografi, enhets montering, testing av enheten, og metoder for bildeanalyse.
Protocol
1. Optisk Litografi av Enhets Masters
- Dehydrere rene silisiumskiver på en varm plate ved ~ 250 ° C i minst 1 time.
MERK: Det er god praksis å bruke mer enn én wafer når du forbereder en mester, i tilfelle av brukerfeil. - Forbered fotoresistmaterialer tilsetningene. Forberede prøver av både SU-8 2015 fotoresist og en utvanning av SU-8 2015 fotoresist i forholdet 2: 1 ved hjelp av SU-8 tynnere som fortynningsmiddel.
MERK: Omtrent 1 ml av fotoresist er nødvendig for spin-belegg en wafer. - Forbered tre maske mønstre for å produsere disse mestere. For Membrane Master, forberede to masker: en mønstring membranen kanalen og den andre mønster reaksjonskamrene. For reguleringsventil master, forberede bare én maske mønster.
MERK: For mer informasjon om litografiske teknikker, inkludert maske mønster, se Ito og Okazaki, 2000. 36 Se Fowlkes og Collier, 2013 for en mer detaljert beskrivelse av enhet utforming 37. - Klargjør Membran Master
- Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 fotoresist fortynning på wafere på 1000 rpm i 45 sek.
- Myke bake wafere ved 95 ° C i 2 min. Ved hjelp av en kontakt aligner, eksponere wafere med membran kanal mønster i 10 sek, og utføre en post-eksponering bake i 2 min ved 95 ° C.
- Utvikle wafere i SU-8 fremkaller 1 min, eller inntil fotoresist rester fjernes. Skyll wafer med isopropanol, flytte fra topp til bunn. Tørr wafer med nitrogen, igjen beveger seg fra topp til bunn. Bake wafere ved 180 ° C i 4 min.
- Spin-coat mønstrede wafere igjen med 2: 1 SU-8 fortynning ved 2000 rpm i 45 sek.
- Soft bake mønstret wafere i 2 min ved 95 ° C. Ved hjelp av kontakt aligner, justere mønstrede wafere med reaksjonskammer mønster, og utsett for 10 sek. Utføre post-eksponering bake i 2 min ved 95 ° C.
- Utvikle wafere som beskrevet i trinn 1.4.3. Etter å ha utviklet og tørking skiver, bake wafere ved 180 ° C i 4 min.
MERK: wafere kan utvikles i den samme utvikleren som ble brukt i forrige trinn.
- Forberede reguleringsventil Master
- Spin-coat ufortynnet SU-8 fotoresist på rene wafere ved 2000 rpm i 45 sek.
- Myk bake platen ved 95 ° C i 6 min. Ved hjelp av en kontakt aligner, eksponere wafere med reguleringsventil mønster i 10 sek. Utføre en post-eksponering bake ved 95 ° C i 6 min.
- Utvikle wafere i SU-8 Developer i 2 minutter, eller inntil rester fjernes. Skyll med isopropanol, flytte fra topp til bunn. Tørr wafer med nitrogen og stek ved 180 ° C i 4 min.
2. PDMS enheten fabrikasjon
- Silanize alle mestere med ~ 0,2 ml trimetylklorsilan via damp deponering.
- Raskt legge master i en lufttett beholder ved RT med noen dråper av silanizing agent.
MERK:. Andre silanizing protokoller kan være akseptabelt 38 Hvis utført properly, vil PDMS være lett å fjerne.
- Raskt legge master i en lufttett beholder ved RT med noen dråper av silanizing agent.
- Blande en kommersiell poly (dimetylsiloksan) (PDMS) base og herder i forskjellige forhold for både membranen og styreventil lag av anordningen, som er vist i tilsvarende flerlagsventil 39 motiver. Bruke 20: 1 og 5: 1 forhold av basen: herdemiddel for membranen og styreventil formene, respektivt.
- For membranformen, bland 10 g av basen med 0,5 g av herdemiddel.
MERK: Dette volumet vil bli spin-belagt på membranen mester. - For reguleringsventilen formen, bland base og herder i et 5: 1 forhold. Mengden av PDMS er nødvendige for å forme styreventilen vil avhenge av den beholder som brukes for å holde styreventilen hoved; fylle beholderen slik at skipsføreren er belagt med ~ 1 cm av PDMS.
- For membranformen, bland 10 g av basen med 0,5 g av herdemiddel.
- Bland begge PDMS forberedelser, og de-gass dem i et vakuumkammer inntil ingen luftbobler er synlige. Plassere kontrollventilen master i et varmebestandigbeholder, for eksempel en glassform. Hell forsiktig 5: 1 forhold PDMS enn master, og de-gass i beholderen en gang.
- Mens reguleringsventilen PDMS container blir de-gasset, spin-coat de 20: 1 ratio PDMS på membranen mester etter nøye helle PDMS blandingen på membranen mester for å minimere luftbobledannelse, deretter spinne-belegg mester på 1000 rpm for 45 sek.
- Delvis herde begge ledere i en ovn ved 80 ° C i 6 minutter for membranen master og 15 min for styreventilen masteren.
MERK: Når delvis herdet, bør PDMS holde sin form, men materialet vil være litt klebrig. Hvis PDMS ennå ikke er kurert, bake igjen i trinn på noen få minutter av gangen inntil materialet holder sin form når den trykkes. - Skjær rektangulære PDMS muggsopp fra reguleringsventil master, peeling formene vekk forsiktig. Punch inntaks hull gjennom den støpte komponent med en 0,75 mm hull.
MERK: Hullet kan rengjøres ved å sette inn en 23 måler blunt spiss nål, og den ytre formen kan vaskes med cellofantape, om nødvendig. - Bruke en optisk mikroskop for å finne reaksjonskamrene på membranen master, justere reguleringsventilen mold komponent med funksjonene i reaksjonskammeret membran og plassere kontrollventilen komponent direkte på toppen av membranen mester. Orientere kontrollventil innløpet til nedre venstre hjørne av enheten, og sikre at reaksjonskamrene og kanal av membranen mester er synlig inne i rektangulære reguleringsventil.
- Bake de innrettede formkomponentene ved 80 ° C i 2 timer.
MERK: Membran og reguleringsventil muggsopp vil nå bli beseglet, og manipuleres som en mold. - Skjær den lagdelte PDMS mold bort fra membranen master, peeling formen bort fra master veldig forsiktig for ikke å perforere membranen.
- Punch innløp og utløp hull for celleekstrakt input ved hjelp av en 0,75 mm hull. Lage hull gjennom begge lag,og rense dem på samme måte som beskrevet i trinn 2.6.
- Ved hjelp av et induktivt koblet plasma renere, plasma godbit både formen (membransiden opp) og en No. 0 glass dekkglass på 10,5 W for 20 sek. Umiddelbart fjerne dekkglass og mugg fra plasma renere og lag komponentene, membran side mot glasset, forsøker å minimere luftlommer mellom glasset og formen. Ikke trykk direkte på membranen inngangskanalen, eller membranen kan bindes til glass, noe som gjør det vanskelig å fylle kanalen med reaktantene.
- Vær spesielt forsiktig når du håndterer den sammensatte enheter for å unngå å bryte glasset laget. Bruk tynne dekkglass som enheten skal avbildes gjennom glass dekkglass ved hjelp av høy forstørrelse olje-immersion mål - hvis glasset er for tykk, kan enhetens funksjoner ikke være synlig.
- Endelig kurere de ferdige enheter ved 80 ° C i 2 timer.
3. Forsøksoppsett for Cell-free Protein Synthesis Reaction
- Hydratisere en enhet ved å koke det i avionisert vann i 1 time.
MERK: Enhet bør ha en skyet utseende når du er helt hydrert. Anordningen kan også stå O / N i sterilt vann ved romtemperatur for å fukte den. - Ved hjelp av en invertert mikroskop med en inkubasjonstid kammer, setter temperaturen til 30 ° C.
MERK: Denne temperaturen ble valgt for å optimalisere uttrykk for GFP med en T7 promoter, så optimale temperaturer for andre reaksjoner kan variere 40. - Mount enhet mikroskop scenen holder med cellofan tape og pakk kantene av enhet med våt silkepapir for å opprettholde lokal hydrering.
- Bruk to høy presisjon closed loop spennings trykktransducere å modulere nitrogengasstrykk for reguleringsventil aktivering og reagenser innspill.
MERK: Denne protokollen er bare testet med lav renhet nitrogen, selv om andre inerte gasser kan brukes.- Koble den første Giver24-gauge PTFE rør til en vannbeholder som ble holdt i en 4 ml hetteglass med et septum lokk. Kobler reservoaret til kontrollventilinnløpet ved hjelp av et andre rør avsluttes av en 23 måler butt tupp kanyle.
MERK: Begge rør trenge reservoaret septum med to skarpe 23 måle nåler. - Koble den andre svinger med 24-gauge PTFE slange koblet til en hann-til-hann Luer-lok kontakt. Fest dette til en Luer-lok 23 gauge nål koblet med slange med en annen 23 måler sløv spiss nål, som er satt sammen individuelt for hver enhet. Denne nål er koblet til membranen reaksjonskanalen; bruke det til å tømme vann fra reaksjonskanalen og inngangs reagenser.
- Koble den første Giver24-gauge PTFE rør til en vannbeholder som ble holdt i en 4 ml hetteglass med et septum lokk. Kobler reservoaret til kontrollventilinnløpet ved hjelp av et andre rør avsluttes av en 23 måler butt tupp kanyle.
- Ved hjelp av en celle-fri protein expression system, montere komponentene for CFPS reaksjon på is, i henhold til produsentens instruksjoner. Minimere tiden brukt holder CFPS reagenser på is og sett reaksjonen inn i enheten umiddelbart etter montering.
MERK: Dette utstyret har værtbrukes sammen med en kommersiell E. coli trekke protein uttrykk kit og et plasmid konstitutivt uttrykker GFP. Det totale reaksjonsvolumet ble redusert til 25 mikroliter - det kan være mulig å anvende en enda lavere volum for reaktantene, hvis det er ønskelig. Som CFPS reagenser har en tendens til å være følsomme overfor fryse-tine-sykluser, kan det være nyttig å lage porsjoner av reagensene ved den passende volum før forsøket. Andre reagenser kan bli tilsatt til reaksjonsblandingen, men reaksjonen må være satt sammen før blir påført anordningen.- Montere reaksjonen, og legger til DNA-inngang sist.
MERK: Når samlet i en Eppendorf rør, vil CFPS reaksjon begynne hvis ikke holdt på is. Siden den tiden det tar å bruke reagenser til enheten og begynne eksperimentet kan variere, er det nyttig å starte en timer når reaksjonen er samlet og blandet - dette vil holde tidsskalaen mellom eksperimenter konsistente, og hjelp i feilsøking.
- Montere reaksjonen, og legger til DNA-inngang sist.
- Brukekateter og nål-kontakt er beskrevet i trinn 3.4.2 trekke den monterte reaksjons inn i røret ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Sett butt tupp kanylen inn i reaksjonskammeret innløpet. Løsne nål kontakten fra sprøyten og fest den til hann-til-hann-kontakten brukes til reaksjonskammeret svinger.
- Anvende trykk (<10 kPa) til CFPS reaktantene for å fylle kanalen. Fjern nålen når reaksjonen er fylt.
- Sett butte røret fra den andre transduseren i styreventilinnløpet. Må ikke utsettes for trykk regulatoren ennå.
- Plasser montert enhet på scenen. Ved hjelp av lysfelt bildebehandling, finn reaksjonskamrene med en 100X olje-nedsenking objektiv.
- Trykk styreventilen ved trykksetting av styreventilen transduseren til 20 psi; en synlig endring i membranen vil være tydelig når kontrollventilen er aktivert. Fokus på bunnen av reaksjonskamrene.
- Begynn image oppkjøpet; vekst i fluorescens will være synlig i det indre, og rundt det ytre av reaksjonskamrene, selv om det trolig vil være tydelig i de tidlige stadier av reaksjonen. Ta bilder hver 1-3 min inntil reaksjonen har nådd en stabil tilstand fluorescens. Dersom en automatisk fokuseringstrinn ikke er tilgjengelig, kort refokusere hvert bilde før bildene blir tatt.
MERK: Mens noen fotobleking vil inntreffe, kan virkningene på relativ fluorescens på grunn av fotobleking gjøres rede for, så lenge frekvensen av fotobleking er kjent. Denne fotobleking hastigheten kan bli estimert ved å utsette en standard fluoriserende, slik som en kjent konsentrasjon av GFP eller en fluorofor blanding, til konstant fotobleking i løpet av en tidsperiode. - Spill medgått tid fra reaksjonen forsamlingen til det første bildet ervervet.
MERK: Dette tar vanligvis 4-5 min.
4. bildeanalyse og databehandling
- Ved hjelp av et bildeanalyse programvare som ImageJ, velgInteriøret av reaksjonskamrene som en ROI. Erverve gjennomsnittlig fluorescens intensitet verdien av ROI for alle bilder.
MERK: Dette er den rå fluorescens intensitet spor.- Utføre denne oppgaven i ImageJ hjelp av Time Series Analyzer og ROI manager plugins - Bruk Time Series Analyzer å velge områder av interesse rundt det indre av hvert reaksjonskammeret. Still "AutoROIProperties" til et område som tilsvarer det indre av hvert reaksjonskammeret, sjekk "Legg Ved klikk", og velg hvert kammer.
MERK: Dette trinnet kan også gjøres ved hjelp av ellipse verktøyet til å tegne en ROI rundt fluorescerende kammeret. Denne ROI størrelse svarer vanligvis til en 30 x 30 piksel ellipse for en 10 um diameter kammeret på en 100X objektiv. - Markere alle ROIs i ROI Manager. Bruk "Multi Mål" funksjon for å bestemme den midlere fluorescensintensitet av hver ROI gjennom hele bildestabelen.
MERK: En plugin som heter StackReg kan brukes til å justere bildestabel, hvis det er nødvendig.
- Utføre denne oppgaven i ImageJ hjelp av Time Series Analyzer og ROI manager plugins - Bruk Time Series Analyzer å velge områder av interesse rundt det indre av hvert reaksjonskammeret. Still "AutoROIProperties" til et område som tilsvarer det indre av hvert reaksjonskammeret, sjekk "Legg Ved klikk", og velg hvert kammer.
- Etter å skaffe den rå fluorescensintensitet spor for alle kamrene i et eksperiment, bestemme den deterministiske komponent i reaksjonen ved å ta en inter-eksperimentell gjennomsnitt over alle spor, og å subtrahere gjennomsnittet fra individuelle rå spor. Bruk dataanalyse programvare som IGOR eller MS Excel for denne analysen.
MERK: Dette gir støy spor for hver reaksjonskammeret. - Analysere genuttrykk støy fra disse reaksjonskamrene som bruker de samme metodene som brukes til å analysere genuttrykk støy avledet fra celler 25.
Representative Results
Den klare fordelen av denne microfabricated plattformen er i anvendelsen av den styrbare elastomere "styreventil" som er uavhengig aktiveres for å begrense CFPS reaksjoner (figur 2A). Når enheten er aktivert, blir membrankamrene presset mot objektglasset for å begrense fluorescerende reagenser i en matrise av reaksjonskamrene (figur 2C). For å verifisere at kamrene på en pålitelig måte begrense reaksjonen gjennom varigheten av forsøket, ble en grunnleggende FRAP (Fluorescence Recovery Etter fotobleking) test utført 37. En fluorophore (AF 555) ble brukt til enheten, og reguleringsventilen ble aktivert; ved å bruke lukkeråpningen av mikroskopet, en enkelt brønn avgrense fluoroforen ble isolert og photobleached individuelt (figur 2D). Den valgte vel ble mørkt og ikke komme i lysstyrke til reguleringsventilen ble trykkavlastet 20 min60; senere frigjøring av kammeret fra glasset. Denne testen bekrefter at disse reaksjonskammere forblir godt forseglet for varigheten av eksperimentet.
Under optimale forhold, en CFPS reaksjon som uttrykker en lett visualisert protein (for eksempel GFP eller luciferase) uttrykker detekterbart protein i løpet av få minutter for å bli anvendt på denne enheten. I løpet av levetiden til reaksjonen, er proteinsyntese i det indre og ytre av reaksjonskamrene avbildet og kvantifisert ved å måle enheter av fluorescens-intensitet innen hvert kammer (figur 3A). Fluorescens-intensitet, tilsvarende proteinkonsentrasjon, kan kartlegges over tid for hvert reaksjonskammer (figur 3D).
Genekspresjon er en iboende stokastisk prosess som introduserer svingninger (støy) på hver molekylære trinn (syntese, nedbrytning, protein-DNA binding, etc.) 20. En gren av støy biologi fokuserer påavtrykkene verdi av genet krets støy 41. Uttrykk i cellefrie systemer vil ha ytre støy effekter som oppstår fra interaksjoner mellom den molekylære maskineri av uttrykk og overflatene som definerer grensene for reaksjonsbeholdere. Disse ytre effekter vil trolig bli mer uttalt som cellefrie reaksjoner er begrenset i enda mindre reaksjonskamrene. Evnen til å utføre time-lapse avbildning av flere trange CFPS reaksjoner gjør så grundig analyse av støy struktur (magnitude og dynamikk) i trange cellefrie systemer på en måte direkte analogt til metoder som er rapportert for cellulære systemer 25. Figur 3C og 3D viser tidsforløp av konstitutiv ekspresjon av GFP en T7-promoter i et standard 384-brønns mikroplate med et brønnvolum på 15 ul, i forhold til i PDMS reaksjonskamrene 10 um i diameter, tilsvarende volum av bare ca. 300 fl, ca. syv ordres av størrelsesorden mindre. Variabiliteten i proteinekspresjon rater i de 10 um reaksjonskamrene er mye høyere enn i de godt plate målinger, nærmer seg de man ser i cellene.
Multipleksede reaksjoner utført på anordningen oppvise lignende kinetikk til CFPS reaksjoner som utføres i bulk på en mikroplateleser (figur 3B), hvor det er en hurtig økning i fluorescens som platåer, ofte antatt å være forårsaket av ressursbegrensning inne i reaksjonsvolumet 42,43 . Denne deterministisk vekst oppførsel, skjønt varierende, er generelt i overensstemmelse tvers av alle reaksjonskamre, og mellom eksperimenter - ved gjennomsnitt spor mellom kamrene på tvers av eksperimenter, kan det deterministiske trend trekkes fra spor verdier, slik at bare de støykomponentene i reaksjonen (Figur 4A) Fig. 4B viser GFP uttrykk støy etter fjerning av den deterministiske, transient komponent (topp), Og autokorrelasjon av støy (på undersiden), mens figur 4A viser de tilsvarende spor i de 10 um reaksjonskamrene. Fordelingen i halv-tider på autokorrelasjons traser gir frekvensavhengighet av støy, mens null-forsinkelsestiden av autokorrelasjons traser gir størrelsene av støy, som variansen.
Figur 1. cellefri proteinsyntese reaktanter er begrenset i femtoliter skala reaksjonskamrene for det formål å måle genekspresjon støy. Reagenser fra en kommersiell cellefritt protein-ekspresjonssystem er brukt til å konstitutivt uttrykke GFP inne begrenset PDMS reaksjonskamrene. En oppstilling av disse kammere kan bli visualisert med intervall fluorescens mikroskopi for å karakterisere protein ekspresjon og genekspresjon støy. Fluorescensintensiteten of hvert reaksjonskammeret over tid kan plottes som en individuell spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fabrikasjon av to-lags microfluidic enhet med lukkbar femtoliter-skala kamre. (A) Layout og eksploderte visning av enhets lag. Anordningen er sammensatt av to PDMS lag og et dekkglass. PDMS membran, forseglet mellom glasset og styreventil lag, holder reaksjonskamrene. (B) SEM-bilde av PDMS reaksjonskammeret. Interiøret diameter er 10 mikrometer. (C) Skjematisk inngangskanaler i enheten. Cellefri proteinsyntese (CFPS) reagenser er strømmet gjennom reaksjonskanalen. Vann blir satt under trykk i styreventil for å komprimere reaksjonskamrene mot glass-slide som forsegler kamrene 37. Gjengitt fra Ref. 37 med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry. (D) Fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP) test på en enkelt brønn med FITC indikerer kammeret er godt forseglet mot ytre miljø. Fluoroforen ble fanget i kamrene (øvre bilde) og en enkelt brønn ble photobleached (nedre bilde). Ingen fluorescensgjenvinning ble sett i photobleached kammer til reguleringsventilen ble utgitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. EGFP Expression i trange Cell-Free reaksjon. (A) Fluorescens bilder av forseglet reaksjon c Hambers ved valgte tidspunkter i reaksjonen. Proteinproduksjon kan sees både i reaksjonskamrene og utenfor kamrene i hovedkanalen. (B) EGFP ble klonet inn i en vektor Pet3a, som gir en T7-polymerase-promoter og terminator og et sterkt ribosombindende sete (RBS). (C) Normalisert fluorescensmålinger av konstitutiv ekspresjon av EGFP i et bulkcellefritt reaksjonen utføres i en mikroplateleser. CFPS reaksjoner vanligvis produserer protein raskt før bremse til en "steady state" fluorescens - dette er forbundet med ressurs begrensning 43. Sorte streker viser gjennomsnitts spor. (D) Normalisert fluorescens av 51 rå fluorescensintensitet spor lest fra 51 reaksjonskammere i flere eksperimenter. Sorte streker indikerer den gjennomsnittlige trase over flere eksperimenter som illustrerer den deterministisk komponent av proteinekspresjon./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Individuelle Støy Traces og Noise Autokorrelasjon av en Cellular og Cell-Free System. (A) Fra Austin et al., 2006. Støy i GFP uttrykk (øverst) og normaliserte autokorrelasjonsfunksjoner (nederst) ervervet fra å spore GFP produksjon i levende bakterier 25. Gjengitt med tillatelse fra Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), opphavsrett (2006). (B) Støy i GFP uttrykk (øverst) og normaliserte autokorrelasjonsfunksjoner (nederst) ervervet fra GFP produksjon i celle-free system, spores i microfluidic enhet reaksjonskamrene. Vennligst klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Genuttrykk i celler er iboende støyende på grunn av små cellulære volumer og lave kopi antall viktige reagenser. Støy biologi fokuserer ofte på kildene, foredling og biologiske konsekvenser av svingninger i bestandene, konsentrasjoner, posisjoner eller tilstander av molekyler som styrer genet kretser og ledningsnett 44. De aller fleste av dette arbeidet har blitt utført i cellulære systemer, som har fordelen av å se på støy av et gen krets innenfor den naturlige sammenheng med de genetiske nettverk innenfor cellen. Imidlertid cellefrie systemer tillater karakterisering av de iboende variasjoner i individuell gen krets uten samtidig andre ytre effekter 18 som ikke kan unngås i cellulære systemer. Analyse av støy kan tilby viktige fysiske innsikt i hvordan genetiske kretser er bygget opp og hvordan de fungerer, og har vært brukt i celledelte systemer til å karakterisere negative og 25 positive
Nøkkelen som muliggjør funksjon av utformingen er integreringen av matriser av femtoliter-volum (mikrometer-skala) reaksjonskamrene som brukes til å avgrense reaktantene i et cellefritt protein-ekspresjonssystem, med en elastomer "styreventil" membran i PDMS som fanger reaktanter ved en veldefinert, "tid null" for reaksjonsstart (figur 1). Denne kontrollen tillater kinetikken til reaksjonene som er involvert i proteinsyntese som skal Follskyldte i sanntid med høy presisjon. Som sådan, er det viktig å behandle cellefrie reaktanter slik at inter-eksperimentell variabilitet minimaliseres så mye som mulig. Denne kontrollen gjør det mulig å evaluere støy strukturen av cellefrie genetiske kretser på en måte som er analog til teknikker som tidligere er brukt til å evaluere genekspresjon i levende celler.
Som reaktanter som brukes i CFPS systemer kan være følsomme overfor fryse-tine-sykluser, er det viktig å holde reaktantene kaldt og minimere tiden reaktantene bruker på å tine på is. Det er god praksis å periodisk å teste ekspresjonen av CFPS systemet i bulk for å identifisere endringer i ekspresjon nivåer over tid - dette kan bli gjort i en 10-15 pl reaksjon i et Eppendorf-rør, eller i en enhet som en mikroplateleser , som utfører flere lyder over tid for å ta opp reaksjonskinetikken. Opplyse alder og tine tider av reagenser for hvert eksperiment vil hjelpe når lav uttrykk l feilsøkingevels. Videre, ved montering CFPS reagenser, er det viktig å merke seg at reaksjonen vil starte når den er ferdig montert og fjernet fra isen. For å opprettholde en konsistent "tid null", er det nyttig å registrere tiden etter initiering av CFPS reaksjonen etter den endelige tilsetningen av DNA-inngang, og å anvende reaksjonsblandingen så hurtig som mulig til den inkuberte enheten. Denne prosessen tar omtrent 4-5 min, og fluorescens bør likevel ikke være synlig i løpet av reaksjonskamrene. Denne kontroll sikrer at den tilgjengelige tiden for å visualisere veksten delen av reaksjonskurven blir maksimert.
Før du kjører CFPS reaksjoner på enheten, er det tilrådelig å kjøre kvalitetskontroll tester for å bekrefte det er ingen lekkasje fra kamrene. En FRAP test kan utføres (som i figur 2D) ved å bruke en Fluoroforen til enheten og utsette en enkelt brønn før brønnen er helt bleket. Hvis kamrene ergodt forseglet, ingen utvinning skal være synlig i brønnen - det bør være en sterk kontrast mellom veggene i kupé og interiør og eksteriør mellomrom. Hvis fluorescens utvinning er åpenbar eller veggene i reaksjonskammeret er ikke godt definert, bør trykket på styreventilen skal økes eller enheten bør kontrolleres for lekkasje eller delaminering av glass-slide.
Denne protokollen har blitt testet med CFPS reagenser fra en kommersiell E. coli cellefritt protein ekspresjon kit (skalert til 25 ul), selv om andre robust CFPS systemer kan benyttes. Det er mulig å bruke mye mindre volumer enn 25 pl ved anvendelse av reaksjoner på enheten, noe som kan være nyttig når reagens kostnaden er en begrensende faktor i eksperimentene. Når reaktantene blir tilsatt til enheten og reaksjonskamrene er forseglet, er det ikke mulig å tilsette reagenser til oppløsningen uten at de-aktivering av styreventilen - således denne anordning er ikke egnet påle for reaksjoner som krever tilsetning av reagenser i løpet av reaksjonen. Denne enheten er heller ikke optimalisert for å observere CFPS reaksjoner som kan kjøre lenger enn tre timer - virkningene av dehydrering og tørking av enheten etter denne tidsperioden har ikke blitt evaluert. Ved lengre reaksjonstider er ønsket, kan disse effektene reduseres ved å forsegle enheten for å hindre fordampning, endring av inkubasjonstemperaturen, eller ved å bruke et fuktighetskammer. Modifikasjoner på utstyret utforming, for eksempel nanoporøse strukturer i kammerveggene 49,50 eller inkludering av en porøs membran lag, representerer noen metoder som kan tillate reagent utveksling og dermed forlenge reaksjonstidsrammer.
Microfabricated reaksjons avdelinger av uniform volum er verdifulle for å opprettholde konsistente dimensjoner på tvers av eksperimenter og godt egnet for gransking "side reaksjoner" med seksjonsvegger. I motsetning til metoder ved hjelp av ingenn-microfabricated teknikker, disse reaksjonene må vurderes i et lite antall, og gir ikke dimensjonale fleksibilitet under forsøkene. Imidlertid er den styrbare konstruksjon for disse reaksjonskamrene godt egnet for intervallmikroskopi, og kan være en opplysende supplement til en high-throughput metode for innesperring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
References
- Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
- Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Karig, D. K., Jung, S. -Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production - a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
- Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
- Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
- Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
- Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
- Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetics. 149, 1633-1648 (1998).
- Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
- Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
- Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
- Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
- Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
- Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
- Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
- Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
- Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
- Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
- Nomura, S. iM., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
- Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
- Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
- Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
- Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
- Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
- Herold, K. E., Rasooly, A. Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, Horizon Scientific Press. (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
- Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
- Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
- Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
- Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
- Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
- Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
- Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).
