Abstract
Бесклеточных системах обеспечивают гибкую платформу для зондирования конкретных сети биологических реакций, выделенных из сложного совместного использования ресурсов (например, выражение глобального гена, деление клеток) встречается в живых клетках. Тем не менее, такие системы, используемые в традиционных макромасштабе объемных реакторов, часто не обладают динамические модели поведения и эффективности характерные их живых микромасштабных аналоги. Понимание влияния внутренней структуры клеток и масштаба на динамику реакции имеет решающее значение для понимания сложных генных сетей. Здесь мы приводим микроизготовленном устройство, ограничивающей реакции клеток без объемов сотовых масштаба, позволяя гибко характеристику закрытом молекулярной системы. Такой многоуровневый поли (диметилсилоксан) (PDMS) Устройство содержит femtoliter масштаба реакционные камеры на эластомерной мембраны, которая может быть приведен в (открытый и закрытый). При приведении в действие, камеры ограничиться Cell-Free синтез белка (СЛТ) реакциивыражая флуоресцентный белок, позволяющий для визуализации кинетики реакции во времени с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Здесь показано, как это устройство может быть использовано для измерения структуру шума CFPS реакций в манере, которая является непосредственно аналогичны тем, которые используются для описания сотовых систем, тем самым позволяя использование методов шум биологии, используемых в сотовых системах охарактеризовать ген цепи CFPS и их взаимодействия с окружающей средой бесклеточной.
Introduction
Системы Бесклеточные предлагают упрощенную и гибкую платформу для просмотра биологические реакции свободной от осложняющих факторов, таких как фитнес, разделения, и мутации, которые неизбежны при изучении живых клеток. Такие подходы были использованы для изучения клеточных систем, включая характеристики мембранных белков, 1 зондирования белковых взаимодействий 2 и разведки основных аспектов перевода 3-7. Недавно клеточные системы без начали закрепиться в качестве жизнеспособных платформ для синтетической биологии 8-10. Привлекательность таких подходов является то, что они освобождают синтетической биологии из совместного использования ресурсов и «внешней шумы", которые влияет на динамику реакции в живых клетках. Однако остаются вопросы о том, как физическая среда, в которой реакции бесклеточные встроены влияет на течение болезни и исход реакции. Бесклеточные реакции среды - в частности, ограничивается environmЭнты, которые приближаются объемы ячейки актуальных - остаются слабо изучен. Cell-Free синтез белков (СЛТ) является условно мысль как "масштаб-Free" выставляется эквивалентные кинетики по целому ряду мкл на литр масштаба реакционных объемов 11. Тем не менее, ограничивающие реакции на объемах сотовых масштабе было показано, значительно влиять на темпы экспрессии белка 12.
Стохастический характер реакций клеток-бесплатно - особенно когда это системный подход или даже пойти ниже femtoliter объемов - может иметь особое значение. Шум в экспрессии генов недвижимости сильно зависит от содержания в качестве небольших объемах клеток и высокой плотностью компонентов заставить многих важных молекул до очень низкого уровня населения - например, кишечной палочки ограничивается в пределах объема 1 эт аж 4300 различных полипептидов индуцируемый контроль нескольких сотен различных промоторов 13. Это собственный шум был вовлечен в качестве центрального движущей силой во многих биологических процессах, включая хемотаксис 14, решение ВИЧ между активной репликации задержки 15, решение λ фага между лизиса и лизогении 16,17, и решение Bacillus subtillus между компетенции и спороношение 17. Бесклеточный синтетическая биология затем обеспечивает как возможность исследовать стохастические свойства клеточных генов цепей и сетей, а также управлять эти поведения для достижения конкретных технологических целей. В то время как поведение шум сотовых систем была хорошо изучены 18-27, было мало изучение фундаментальной поведения шума бесклеточных системах 8, в частности, на клеточном уровне.
Здесь мы представляем платформу для изучения стохастических эффектов в бесклеточной синтетической биологии. Это микроизготовленном платформа содержит femtoliter масштаба реакции Chambers, которые могут быть быстро перенесенные между открытой (свободной диффузии в и из камеры) и закрытые (реагентов, заключенных внутри камеры) государств. В закрытом состоянии, мы ограничимся бесклеточной синтез белков (СЛТ) реагентов с экспрессией зеленого флюоресцентного белка (GFP) и следуйте экспрессию генов с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии 28 (рисунок 1). Мы характеризуем это бесклеточной среду, измерения структуры стохастических колебаний в экспрессии генов таким образом, непосредственно аналогичных тем, которые используются для характеристики клеток 25. Методы Номера микроструктур для ограничения распространения реакции клеток без включают пузырьки и липосомы 29-32, вода-в-масле 12 и пористой среды 33. Однако, хотя эти методы могут обеспечить контроль над распределением по размерам ограниченных объемах 34, методы микротехнологий создания высоко тиражируемых черты с плотно заданных размеров, даже на наноуровне.Кроме того, эти жесткие структуры можно легко проследить во времени, не будучи подвержены испарению или изменения во внешней среде. Микроизготовленном конструкции контейнера, используемого в предыдущей работе 8,35 не может быстро герметизации реакционных камер следующие реакции инициирования, усложняя четкое распределение времени, когда Реакцию инициируют (время ноль). С помощью метода, представленный здесь, только 4-5 мин необходимы между началом и визуализации реакции на устройстве, тем самым обеспечивая четко определенный "времени ноль". Следующие протоколы описываются методы изготовления и испытания этого устройства, в том числе оптической литографии, собраний устройства, тестирования устройств и методов для анализа изображений.
Protocol
1. оптической литографии мастеров устройств
- Дегидрировать чистые кремниевые пластины на горячей плите при ~ 250 ° C в течение по крайней мере 1 час.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая практика, чтобы использовать более одной пластины при подготовке учителя, в случае ошибки пользователя. - Подготовка фоторезиста аликвот. Подготовка аликвоты как СУ-8 2015 фоторезиста и разведении SU-8 2015 фоторезиста в соотношении 2: 1 с использованием SU-8 тоньше в качестве разбавителя.
Примечание: Приблизительно 1 мл фоторезиста необходимо для спин-покрытие одной пластины. - Подготовка три модели Маска для получения этих мастеров. Для мембраны Учителя, подготовить две маски: одну паттерна канала мембраны и другие паттерна реакционные камеры. Для мастера регулирующий клапан, подготовить только один шаблон маски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробной информации о литографических методов, в том числе маски рисунка, см Ито и Окадзаки, 2000. 36 См Fowlkes и Кольер, 2013 для более подробного описания конструкции прибора 37. - Подготовка мембраны Мастер
- Спин-пальто 2: 1 SU-8 2015 фоторезиста разбавления на пластинах в 1000 оборотов в минуту в течение 45 сек.
- Мягкие выпекать вафли на 95 ° С в течение 2 мин. Использование контактную выпрямитель, подвергать вафли с рисунком мембранного канала в течение 10 сек, а также выполнять запекать после экспозиции в течение 2 мин при 95 ° С.
- Разработка не пластин в СУ-8 разработчика в течение 1 мин, или до тех пор, фоторезист остаток удален. Промыть пластины с изопропанола, двигаясь сверху вниз. Сухой пластины с азотом, снова движется сверху вниз. Выпечка пластины при 180 ° С в течение 4 мин.
- Спин-покрытие с рисунком пластин снова 2: 1 СУ-8 разбавлении в 2000 оборотов в минуту в течение 45 сек.
- Мягкие выпекать пластины с рисунком в течение 2 мин при 95 ° С. Использование контактную выпрямитель, совместите узорные вафли с реакционной камеры модели, и выставить на 10 сек. Выполните запекать после экспозиции в течение 2 мин при 95 ° С.
- Разработка пластин, как описано в шаге 1.4.3. После разработки и сушки пластин, испечь вафли на 180 ° С в течение 4 мин,
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины могут быть разработаны в то же разработчика, который был использован в предыдущем шаге.
- Подготовка регулирующий клапан Мастер
- Спин-пальто в неразбавленном виде СУ-8 фоторезиста на чистые пластин в 2000 оборотов в минуту в течение 45 сек.
- Мягкие выпекать пластины при температуре 95 ° С в течение 6 мин. Использование контактную выпрямитель, подвергать вафли с шаблон элемента управления клапана в течение 10 сек. Выполните запекать после экспозиции при 95 ° С в течение 6 мин.
- Разработка пластин в СУ-8 Developer в течение 2 мин, или пока остаток не будет удален. Промыть изопропанола, двигаясь сверху вниз. Сухой пластины азотом и выпекать при температуре 180 ° С в течение 4 мин.
2. PDMS изготовления приборов
- Silanize всех мастеров с ~ 0,2 мл триметилхлорсилана через осаждения из паровой фазы.
- Быстро заключить мастер в герметичном контейнере при комнатной температуре с несколькими каплями silanizing агента.
ПРИМЕЧАНИЕ:. Другие протоколы silanizing может быть приемлемым 38 Если выполняется properlу, PDMS будет легко удалить.
- Быстро заключить мастер в герметичном контейнере при комнатной температуре с несколькими каплями silanizing агента.
- Смешайте коммерческую поли (диметилсилоксан) (PDMS) основы и отвердителя в различных соотношениях для обоих мембраны и контрольных слоев клапана устройства, как это было продемонстрировано в подобной многослойной конструкции клапана 39. Использование 20: 1 и 5: 1 соотношение основание: отвердителя для пресс-форм мембраны и регулирующий клапан, соответственно.
- Для мембраны формы, смешать 10 г основания с 0,5 г отвердителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем будет спин-покрытием на мастер мембраны. - Для клапана плесени управления, смешать основы и отвердителя в соотношении 5: 1. Количество PDMS, необходимых для формования регулирующий клапан будет зависеть от используемого контейнера для хранения мастер регулирующего клапана; заполнить контейнер таким образом, что мастер с покрытием ~ 1 см PDMS.
- Для мембраны формы, смешать 10 г основания с 0,5 г отвердителя.
- Тщательно перемешайте и PDMS подготовку и дегазации их в вакуумной камере, пока пузырьки воздуха не видны. Поместите мастер регулирующего клапана в термостойкиеКонтейнер, например, стеклянную посуду. Осторожно залейте соотношении 5: 1 PDMS над мастером, и де-газа контейнеров второй раз.
- В то время как регулирующий клапан PDMS контейнер отключением газом, спин-пальто в 20: 1 соотношение PDMS на мастер мембраны тщательно выливая смесь PDMS на мастер мембраны для минимизации образования пузырьков воздуха, а затем спин-покрытия мастер на 1000 оборотов в минуту в течение 45 сек.
- Частично излечить обе мастеров в печи при 80 ° С в течение 6 мин в мастера мембраны и 15 мин для мастера регулирующего клапана.
ПРИМЕЧАНИЕ: При частично затвердела, PDMS должны держать свою форму, но материал будет немного липким. Если PDMS еще не вылечили, испечь снова с шагом в несколько минут, в то время, пока материал не проводит свою форму при нажатии. - Разделите прямоугольную PDMS формы от мастера регулирующего клапана, пилинг пресс-формы от нежно. Удар входные отверстия через формованной компоненту с использованием 0,75 мм дырокол.
ПРИМЕЧАНИЕ: отверстие может быть очищен путем введения 23 калибра blunт кончик иглы, а форма его внешний вид могут быть очищены с целлофановой лентой, если это необходимо. - С помощью оптического микроскопа, чтобы расположить реакционные камеры на мастер мембраны, выровнять регулирующего клапана компонент формы с особенностями реакционной камере мембраны и поместить компонент клапана управления непосредственно поверх ведущего мембраны. Расположите вход регулирующего клапана в нижнем левом углу устройства, и убедитесь, что реакционные камеры и канала мастера мембраны могут видеть внутри прямоугольного клапана управления.
- Выпекать выровненных компонентов плесени при 80 ° С в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: мембранные и контроля формы клапанов теперь будет герметично соединены вместе, и обрабатываются как одной формы. - Отрежьте слоистую PDMS плесень от мастера мембраны, пилинг форму от мастера очень аккуратно, чтобы не перфорировать мембраны.
- Удар входе и выходе отверстия для клеточного экстракта вход на 0,75 мм дырокол. Пробивки отверстий через оба слоя,и очистить их таким же образом, как описано в стадии 2,6.
- Использование индуктивно-связанной очиститель плазмы, плазменный лечения как формы (мембрана стороной вверх) и № 0 покровного стекла на 10,5 Вт для 20 сек. Немедленно снять покровное и плесени от пылесоса плазмы и слой компоненты, мембраны по направлению к стороне стекла, попытки свести к минимуму воздушные карманы между стеклом и плесени. Не нажимать непосредственно на входном канале мембраны или мембраны может отжига к стеклу, что затрудняет, чтобы заполнить канал с реагентами.
- Соблюдайте особую осторожность при обращении с собранным устройства, чтобы избежать нарушения слой стекла. Используйте тонкие покровные стекла, как устройство должно быть отображены через покровного стекла с использованием высоких увеличениях целей масло погружения - если стекло является слишком толстым, особенности устройства могут быть не видны.
- И, наконец, вылечить заполненные устройства при 80 ° С в течение 2 ч.
3. Экспериментальная установка FOR Бесклеточный Синтез белка Реакция
- Гидрат А устройства путем кипячения его в деионизированной воде в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство должно иметь мутный вид, когда полностью увлажненной. Устройство также может быть оставлен O / N в стерильной воде при комнатной температуре, чтобы его гидрат. - Использование инвертированного микроскопа с инкубационной камере, установить температуру окружающей среды до 30 ° С.
Примечание: Эта температура была выбрана для оптимизации экспрессии GFP с Т7 промотора, так что оптимальные температуры для других реакций могут изменяться в 40. - Крепление устройства к микроскопу держателя стадии с целлофановой лентой и обернуть края устройства с папиросной бумаги мокрой, чтобы поддерживать локальное увлажнение.
- Используйте два высокоточных замкнутого контура преобразователей напряжения давления, чтобы модулировать давление азота на газ для контроля срабатывания клапана и ввода реагента.
Примечание: Этот протокол был протестирован только с азотом с низким уровнем чистоты, хотя могут быть использованы другие инертные газы.- Подключите первый датчик на24-го калибра PTFE трубки с резервуаром воды, состоявшейся в стеклянном флаконе 4 мл с перегородкой крышкой. Подключение резервуара к входному отверстию клапана управления с использованием второго трубку, заканчивающуюся в 23 калибра тупой конец иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: обе трубки проникают в водохранилище перегородку с двумя острыми 23 иглами. - Подключите второй датчик на 24-го калибра PTFE трубки, подключенного к мужчине мужчины к Luer-Lok разъема. Прикрепите это к Luer-Lok 23 иглы присоединены при помощи трубок с другом 23 калибра тупой конец иглы, который собран индивидуально для каждого устройства. Эта игла соединяется с мембранной реакционной канала; использовать его для очистки воды из канала реакции и исходных реагентов.
- Подключите первый датчик на24-го калибра PTFE трубки с резервуаром воды, состоявшейся в стеклянном флаконе 4 мл с перегородкой крышкой. Подключение резервуара к входному отверстию клапана управления с использованием второго трубку, заканчивающуюся в 23 калибра тупой конец иглы.
- Использование системы экспрессии белка бесклеточной сборки компонентов для реакции СЛТ на льду, в соответствии с инструкциями изготовителя. Сведите к минимуму время, затрачиваемое проведения СЛТ реагенты на льду и поместить реакцию в устройство сразу же после сборки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это устройство былоиспользоваться с коммерческой E. палочка белковый экстракт комплект экспрессии и плазмиды конструктивно, выражая GFP. Общий объем реакционной смеси был сокращен на 25 мкл - это может быть возможно использовать еще более низкий объем для реагентов, если это необходимо. Как CFPS реагенты, как правило, чувствительны к замораживанию-оттаиванию циклов, это может быть полезно, чтобы аликвоты реагентов в соответствующем объеме до эксперимента. Другие реагенты могут быть добавлены к реакционной смеси, но реакция должна быть полностью собран перед нанесением на устройстве.- Соберите реакцию, добавив, вход ДНК в прошлом.
Примечание: После того, как собран в пробирке Эппендорфа реакционную CFPS начнет, если не держали на льду. С время, необходимое для применения реагентов в устройство и начать эксперимент может меняться, это полезно запустить таймер сразу реакция собраны и смешаны - это будет держать временные рамки между экспериментами, последовательной, и помощь в устранении неполадок.
- Соберите реакцию, добавив, вход ДНК в прошлом.
- Использованиетрубки и иглы разъем описано в шаге 3.4.2, снять собранный реакции в трубку с помощью шприца на 1 мл. Вставьте тупым кончиком иглы во впускной реакционной камеры. Отсоедините разъем иглы из шприца и прикрепите его к разъему мужчины к мужчине, используемого для датчика реакционной камеры.
- Подайте давление (<10 фунтов на квадратный дюйм) к реагентам СЛТ для заполнения канала. Удалить иглу, когда реакцию заполнено.
- Вставьте тупой трубы с другой преобразователя во входное отверстие регулирующего клапана. Не давление регулирующий клапан еще.
- Поместите устройство, установленное на сцене. Использование изображений светлое, найдите реакционные камеры с 100X нефти погружения цели.
- Нажать регулирующий клапан от давления регулирующего клапана датчика до 20 фунтов на квадратный дюйм; видимое изменение в мембране будет видно, когда регулирующий клапан приводится в действие. Сосредоточьтесь на дне реакционных камер.
- Начните сканирование изображения; рост флуоресценции Wплохо видны в интерьере и вокруг внешней реакционных камер, хотя это, скорее всего, не будет видно, на ранних стадиях реакции. Захват изображений каждые 1-3 мин, пока реакция не достигает стабильного состояния флуоресценции. Если этап автоматически фокусировка не доступна, кратко переориентировать каждое изображение до изображения принимаются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, будет происходить некоторые фотообесцвечивание, влияние на относительной флуоресценции за счет фотообесцвечивания может быть объяснено так долго, как скорость фотообесцвечивания известно. Это фотообесцвечивание скорость может быть оценена путем воздействия флуоресцентный стандарт, например, в известной концентрации GFP или флуорофором смеси, в постоянном фотовыцветания течение периода времени. - Запишите время, прошедшее с реакционной сборки на первое изображение получено.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обычно занимает 4-5 мин.
Анализ 4. Изображение и обработка данных
- Использование программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ, выберитеВнутренняя часть реакционных камер в качестве ROI. Приобретать среднее значение интенсивности флуоресценции ROI для всех изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это сырье след интенсивность флуоресценции.- Выполните эту задачу, в ImageJ с помощью плагинов Время анализатор серии и ROI Manager - использовать время анализатор серии, чтобы выбрать интересующие участки вокруг интерьера каждой реакционной камере. Комплект "AutoROIProperties" области, которая соответствует внутренней стороне каждой из реакционной камеры, проверьте "Add On Click" и выберите каждую камеру.
Примечание: Этот шаг также может быть сделано с помощью инструмента Эллипс нарисовать ROI вокруг флуоресцентного камеры. Этот размер ROI обычно соответствует 30 х 30 пикселей эллипса при диаметре 10 мкм камеры смотреть с целью 100X. - Выделите все трансформирования в диспетчере ROI. Используйте функцию "Мульти мерой" в целях определения интенсивности флуоресценции среднее каждого ROI, пронизывающих всю пачку изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: плагин по имени StackReg могут быть использованы для выравнивания стека изображений, если это необходимо.
- Выполните эту задачу, в ImageJ с помощью плагинов Время анализатор серии и ROI Manager - использовать время анализатор серии, чтобы выбрать интересующие участки вокруг интерьера каждой реакционной камере. Комплект "AutoROIProperties" области, которая соответствует внутренней стороне каждой из реакционной камеры, проверьте "Add On Click" и выберите каждую камеру.
- После получения исходных следы интенсивности флуоресценции для всех камер в эксперименте, определить детерминированную компоненту реакции, принимая между экспериментальной среднем по всем трассам, и вычитанием среднего от отдельных сырьевых следов. Использование программного обеспечения для анализа данных, например, как Игорь или MS Excel для анализа.
Примечание: Это обеспечивает шума для каждого следы реакционной камере. - Анализ шума экспрессии генов из этих реакционных камер, использующих одни и те же методы, используемые для анализа экспрессии генов шума, полученные из клеток 25.
Representative Results
Явное преимущество этого микроизготовленном платформы в применении контролируемого эластомерного "регулирующего клапана", который независимо приводимого для удержания CFPS реакции (фиг.2А). Когда устройство приводится в действие, мембранные камеры прижаты к стеклу, чтобы ограничить флуоресцентные реагенты в массив реакционных камер (фиг.2с). Для того, чтобы убедиться, что камеры надежно ограничить реакцию через время эксперимента, основной FRAP (флуоресценция восстановления после фотообесцвечивания) было проведено испытание 37. Флуорофор (AF 555) был применен к устройству, и регулирующий клапан приводили в действие; с помощью диафрагмы затвора микроскопа, один также ограничивая флуорофор был выделен и photobleached отдельности (фиг 2D). Хороший выбор стало темно и не восстановится в яркости до регулирующий клапан не продувается 20 мин60, а позже, выпуская камеру из стекла. Этот тест подтверждает, что эти реакционные камеры остаются хорошо запечатаны в течение всего срока эксперимента.
В оптимальных условиях, реакционную CFPS выражения легко визуализировать белок (например, GFP или люциферазы) выражает детектируемый белок в течение нескольких минут, применяемых к этому устройству. За время существования реакции, синтез белка в интерьере и экстерьере реакционных камер визуализируется и количественно единицах измерения интенсивности флуоресценции в каждой камере (рис 3а). Интенсивность флуоресценции, соответствующий концентрации белка, может быть отображен в течение долгого времени для каждой реакционной камере (рис 3D).
Экспрессии генов сути стохастический процесс, который вводит колебания (шум) на каждом молекулярной стадии (синтез, разложение связывания белок-ДНК, и т.д.) 20. Одна ветвь шума биологии фокусируется надоказательная сила шума в линии гена 41. Экспрессия в клеточных системах без придется примесные шумовые эффекты, которые возникают из взаимодействий между молекулярных машин выражения и поверхностей, которые определяют границы реакционных сосудов. Эти внешние эффекты, вероятно, станет более выраженной, как реакции бесклеточные приурочены на еще более мелкие реакционных камер. Способность выполнять замедленную съемку нескольких ограниченных реакций CFPS затем позволяет тщательный анализ структуры шума (величина и динамика), в закрытом бесклеточных системах таким образом, непосредственно аналогичной методов, которые были зарегистрированы для сотовых систем 25. 3в и 3D показывают временное изменение конститутивной экспрессии GFP из промотора Т7 в стандартном 384-луночный микропланшет с объемом также 15 мкл, по сравнению с в PDMS реакционных камер 10 мкм в диаметре, соответствующих объемов всего около 300 FL, о семь порядокс магнитудой меньше. Изменчивость в скорости экспрессии белка в реакционных камерах 10 мкм гораздо выше, чем в измерениях хорошо пластины, приближаясь тем, которые наблюдаются в клетках.
Мультиплексные реакции, выполняемые на устройстве, имеют одинаковую кинетику чтобы CFPS реакций, выполненных в объеме на микропланшет-ридера (фиг.3В), где есть быстрые увеличение флуоресценции, которые плато, часто предполагается, что обусловлено ограничением ресурсов в объеме реакционной 42,43 , Это поведение детерминированной роста, хотя флуктуирующей, как правило, соответствует во всех реакционных камер, и между экспериментами - путем усреднения следы между камерами по экспериментах, детерминированной тенденция может быть вычтены из значений следовых, оставив только шума компоненты реакционной (фиг.4А) . Фиг.4В показывает шум экспрессии GFP после удаления детерминированного, переходного элемента (верхний), И автокорреляции шума (внизу), в то время как фиг.4А показаны соответствующие следы в реакционных камерах 10 мкм. Распределение в полу времена автокорреляции следов дает частотную зависимость шума при нулевой момент времени запаздывания автокорреляцион- следов дает величины шума, как дисперсия.
Рисунок 1. бесклеточной синтез белка реагенты заключен в femtoliter камер масштаба реакции с целью измерения экспрессии генов шума. Реагенты из системы экспрессии белков коммерческого бесклеточной используются для конститутивно экспрессируют GFP внутри ограничивается PDMS реакционных камер. Массив таких камер может быть визуализированы с покадровой флуоресцентной микроскопии для характеристики экспрессии белка и экспрессии генов шум. Интенсивность флуоресценции оF друг реакционную камеру с течением времени может быть построена в качестве индивидуального следа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Изготовление двухслойного микрожидкостных устройства с закрывающемся femtoliter масштаба камер. () Верстка и в разобранном виде слоев устройства. Устройство состоит из двух PDMS слоев и покровного стекла. ПДМС мембраны, запечатаны между стеклом и контрольных клапанов слоев, имеет реакционных камер. (В) СЭМ-изображение PDMS реакционной камере. Внутренний диаметр 10 мкм. (С) Схема входных каналов в устройстве. Cell-Free синтез белка (СЛТ) реагенты летал через канал реакции. Вода под давлением в контролеклапан для сжатия реакционных камер против стекло, герметизации камеры 37. Воспроизводится из работы. 37 с разрешения Королевского химического общества. (D) флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания тест (FRAP) на одной скважины с использованием FITC указывает камеру хорошо защищена от внешней среды. Флюорофор был захвачен в камерах (верхняя изображения) и одной скважины был photobleached (низкий рисунок). Нет восстановление флуоресценции не был замечен в photobleached камеры до регулирующий клапан не был выпущен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. EGFP выражение в ограниченном бесклеточной реакции. () Флуоресцентные изображения герметичном реакционном с hambers в выбранных временных точках в реакции. Продуцирование белка можно рассматривать как внутри реакционной камеры и за пределами камер в основном канале. (В) EGFP был клонирован в вектор рЕТ3а, обеспечивая промотор Т7 полимеразы и терминатор и сильный сайт связывания рибосом (RBS). (С) нормализованной измерения флуоресценции конститутивной экспрессии EGFP в объемном бесклеточной реакции, проводимой на микропланшет-ридера. CFPS реакции обычно производят белок быстро, прежде чем замедление флуоресценцию "устойчивом состоянии" - это связано с ограничением ресурсов 43. Черные штрихи показывают среднюю след. (D) Нормализованная флуоресценции 51 сырьевых следов интенсивности флуоресценции, считанных из 51 реакционных камер в течение нескольких экспериментов. Черные черточки указывают среднюю след в течение нескольких экспериментов, которые иллюстрируют детерминированную компоненту экспрессии белка./52616/52616fig3large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Отдельные следы шума и шума автокорреляции и клеточном бесклеточной системе. () Из Остина и др., 2006 Шум в GFP выражения (вверху) и нормированных функций автокорреляции (внизу), полученных из отслеживания производства GFP в живых бактерий 25. Печатается с разрешения Macmillan Publishers Ltd: [природы] 25 (. Vol 439), авторское право (2006). (B) Шум в GFP выражения (вверху) и нормированных функций автокорреляции (внизу), полученных из производства GFP в бесклеточной системе, отслеживаются в микрофлюидных реакционных камер устройство. Пожалуйста, нажмите здесьдля просмотра большего размера этой цифры.
Discussion
Экспрессия генов в клетках по своей сути шумно из-за небольших клеточных объемов и низких числа копий важных реагентов. Шум биологии часто фокусируется на источниках, обработки и биологических последствий колебаний в популяциях, концентрации, положения, или состояний молекул, которые контролируют ген цепей и сетей 44. Подавляющее большинство этой работы была выполнена в системах сотовой связи, который имеет преимущество просмотра шум гена цепи в естественных условиях генетических сетей в клетке. Тем не менее, бесклеточных системах позволяют характеристику собственных колебаний отдельной цепи гена без мешающих внешних эффектов 18, что невозможно избежать в сотовых системах. Анализ шума может предложить важные физические понимание того, как генетическая схемы структурированы и как они функционируют, и был использован в системах сотовой связи, чтобы охарактеризовать отрицательный 25 и положительным
Ключ позволяет особенность конструкции является интеграция массивов femtoliter-объема (микронных) реакционных камер, используемых для удержания реагентов из системы экспрессии белка бесклеточной, с эластомерным "регулирующего клапана" мембраны в PDMS, что захватывает Реагенты на четко определенной, "нулевого времени" для инициирования реакции (Рисунок 1). Эта настройка позволяет кинетика реакций, участвующих в синтезе белка, чтобы быть Follзадолженность в режиме реального времени с высокой точностью. Таким образом, важно, чтобы управлять бесклеточных реагентов так, чтобы между экспериментальной вариабельность сведена к минимуму, насколько это возможно. Этот контроль позволяет оценить структуру шума генетических цепей бесклеточных таким образом, который аналогичен ранее методы используются для оценки экспрессии генов в живых клетках.
Как реагенты, используемые в системах CFPS могут быть чувствительны к замораживанию-оттаиванию циклов, важно, чтобы реагенты холодной и минимизировать время реагенты проводят Оттаивание на льду. Это хорошая практика, чтобы периодически проверять выражение системы CFPS навалом в целях выявления изменений в уровне экспрессии с течением времени - это может быть сделано в реакции 10-15 мкл в пробирку Эппендорф, или в устройства, как микропланшетного , который выполняет несколько операций чтения в течение долгого времени, чтобы захватить кинетики реакции. Отметив, возраст и оттаивания раз реагентов для каждого эксперимента поможет при устранении неполадок низкой экспрессией лevels. Кроме того, при сборке CFPS реагенты, важно отметить, что реакция начнется, когда он полностью собран и удален из льда. Для того чтобы поддерживать последовательную "времени" ноль, это полезно для записи времени после начала реакции CFPS после окончательного добавлени на вход ДНК, и применять реакцию настолько быстро, насколько это возможно, к инкубировали устройства. Этот процесс должен занять около 4-5 мин, и флуоресценции должно быть еще не видны в реакционных камерах. Этот контроль гарантирует, что время, доступное для визуализации часть роста кривой реакции максимальна.
Перед запуском CFPS реакции на устройстве, желательно, чтобы запустить тесты контроля качества, чтобы проверить нет утечки из камер. Тест FRAP могут быть выполнены (как показано на рисунке 2D), применяя флуорофор к устройству и подвергая отдельной скважины до тех пор, а не полностью отбеленной. Если палатыхорошо запечатаны, никакого восстановления не должна быть видна внутри хорошо - там должно быть разительный контраст между стенками отсека и внутренних и внешних пространств. Если восстановление флуоресценции видно или стенки реакционной камеры не очень хорошо определена, давление на регулирующем клапане должна быть увеличена или устройство должны быть проверены на предмет утечки или отслаивания от стекло.
Этот протокол был испытан с СЛТ реагентов с коммерческой Е. палочка бесклеточного набора экспрессии белка (в масштабе 25 мкл), хотя могут быть использованы другие системы надежной CFPS. Можно использовать объемы значительно ниже, чем 25 мкл при применении реакции на устройстве, которое может быть полезным, когда стоимость реагентов является ограничивающим фактором в экспериментах. После того, как реагенты добавлены к устройству и реакционные камеры запечатаны, это не возможно, чтобы добавить реагентов в растворе, не де-приведения в действие регулирующего клапана - таким образом, это устройство не подходящие,ле реакций, которые требуют добавления реагентов в ходе реакции. Это устройство также не оптимизированы для наблюдения СЛТ реакций, которые могут работать дольше, чем 3 часа - эффекты обезвоживания и сушки устройства истечении этого периода времени не были оценены. Если более длительные времена реакции желательно, эти эффекты могут быть уменьшены путем герметизации устройства, чтобы предотвратить испарение, изменение температуры инкубации, или с помощью влажной камере. Изменения в конструкции прибора, такие как нанопористых структур в стенках камеры 49,50 или включения пористого слоя мембраны, представляют несколько методов, которые позволили бы обмен реагентов и, таким образом удлиняют временные рамки реакции.
Микроизготовленном реакции отсеки с одинаковой громкостью ценны для поддержания согласованных размеров всей экспериментов и отлично подходит для расследования "побочных реакций» с стенок отсека. В отличие от методов, использующих нен-микроизготовленном методы, эти реакции должны быть оценены в небольших количествах, и не обеспечивают размерную гибкость в ходе экспериментов. Тем не менее, управляемый конструкция для этих реакционных камер является очень подходящим для покадровой микроскопии, и может быть освещения дополнением к способу высокой пропускной родов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
References
- Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
- Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Karig, D. K., Jung, S. -Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production - a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
- Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
- Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
- Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
- Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
- Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetics. 149, 1633-1648 (1998).
- Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
- Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
- Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
- Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
- Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
- Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
- Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
- Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
- Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
- Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
- Nomura, S. iM., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
- Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
- Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
- Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
- Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
- Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
- Herold, K. E., Rasooly, A. Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, Horizon Scientific Press. (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
- Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
- Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
- Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
- Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
- Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
- Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
- Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).
