Abstract
Djurmodeller som efterliknar mänskliga hjärtsjukdomar har skapats för att testa potentiella terapeutiska strategier. En viktig komponent för att utvärdera dessa strategier är att undersöka deras inverkan på hjärtfunktionen. Det finns flera metoder för att mäta in vivo hjärt mekanik (t.ex. ekokardiografi, relationer tryck / volym, osv). Jämfört med ekokardiografi, är realtidsvänsterkammar (LV) tryck / volym analys via kateterisering mer exakt och insiktsfulla för att bedöma vänsterkammarfunktion. Dessutom ger LV tryck / volym analys förmågan att omedelbart registrera förändringar under manipulationer av kontraktilitet (t.ex. β-adrenerg stimulering) och patologiska förolämpningar (t.ex. ischemi / reperfusionsskada). Utöver den maximala (+ dP / dt) och minimum (-dP / dt) takten tryckändring i LV, en korrekt bedömning av vänsterkammarfunktion via flera lastoberoende index (t.ex. slutsystoliska tryckvolym förhållande och förspänning rekryter stroke arbete) kan uppnås. Pulsen har en signifikant effekt på LV kontraktilitet, så att en ökning av hjärtfrekvensen är den primära mekanismen för att öka hjärtminutvolymen (dvs Bowditch effekt). Således, när man jämför hemodynamiken mellan experimentella grupper, är det nödvändigt att ha liknande hjärtfrekvens. Vidare är ett kännetecken för många kardiomyopati modeller en minskning i kontraktil reserv (dvs minskad Bowditch effekt). Följaktligen kan viktig information erhållas genom att bedöma effekterna av ökad hjärtfrekvens på kontraktilitet. Våra och andra data har visat att den neuronala kväveoxidsyntas (NOS1) knockout-mus har minskad kontraktilitet. Här beskriver vi proceduren för mätning LV tryck / volym med ökande hjärtfrekvens med hjälp av NOS1 knockout musmodellen.
Introduction
Syftet med hjärtat är att pumpa blod genom hela kroppen för att uppfylla de metaboliska kraven hos organismen. Eftersom dessa krav är ständigt fluktuerande (t.ex. under träning), måste hjärtat anpassa (dvs öka hjärtminutvolym). Hjärtat har utarbetat ett stort antal vägar för att uppnå detta konststycke. Det främsta sättet hjärtat uppnår detta är via en ökning av hjärtfrekvensen (dvs Bowditch effekt) 1. Det vill säga, som en hjärtfrekvens ökar resulterar detta i en ökning av kontraktilitet och en ökning i hjärtminutvolym. Således är hjärtfunktion ytterst beroende av hjärtfrekvensen. Tyvärr, hjärtsjukdom (t ex hjärtinfarkt, hypertrofi, etc.) resulterar i dålig hjärtfunktion där hjärtat följaktligen inte kommer att kunna uppfylla de metaboliska kraven på kroppen. Hjärtsjukdom är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet i det västerländska samhället. Djurmodeller som rekapitulera många människors cardiomyopathies används för att undersöka molekylära mekanismer och för att testa potentiella behandlingar. För att urskilja dessa mekanismer och avgöra om en behandling kan vara lönsamt måste utredarna bedömer hjärtfunktion in vivo.
Det finns flera sätt att bedöma hjärtfunktionen in vivo (t.ex. ekokardiografi, MRI, etc.), som rutinmässigt mäta ejektionsfraktion, fraktionerad förkortning, hjärtminutvolym, etc. Men, dessa parametrar är starkt beroende av afterload, förspänning, och hjärtfrekvens förutom kontraktilitet 2. Att mäta kontraktilitet är nödvändig för att förstå de inneboende egenskaperna hos hjärtat i sin naturliga miljö. Den maximala (dP / dt max) graden av tryck utveckling för oss ett steg närmare att förstå kontraktilitet. Tyvärr är dP / dt också beroende av puls- och belastningsförhållanden 3. Därför tekniker har utvecklats för att mäta belastningen (och hjärtfrekvens, se below) oberoende index hjärtkontraktilitet (dvs slutet systoliskt tryck volymförhållande (ESPVR) och förspänning rekryterslagarbete (PRSW)) 4-6. ESPVR beskriver det maximala tryck som kan utvecklas genom ventrikeln vid varje given LV volym. Lutningen på ESPVR representerar slut systoliska elastans (EES). PRSW är den linjära regressionen av stroke arbete (område som avgränsas av PV slinga) med slutdiastoliska volym. Dessa procedurer är en mer noggrann och exakt mätning av kontraktilitet jämfört med hemodynamiska parametrar såsom ejektionsfraktion, hjärtminutvolym och slagvolym. ESPVR och PRSW kan erhållas via den tillfälliga blockeringen av den nedre hålvenen (IVC). Blockering IVC kan utföras med en sluten bröstet för att undvika effekten av att ändra intrapleurala trycket på hjärtfunktionen.
Ökad hjärtfrekvens ökar också sammandragning och avslappning 1. Således, när man jämför hjärtfunktion mellan ExperimentaL-grupper (t.ex. ± dP / dt), hjärtfrekvenser behöver vara likartade. Men liknande hjärtfrekvens vanligtvis inte förekommer i varje djur på grund av olika förhållanden (sjukdom, forskning interventions, etc.). Det bör noteras att anestesi (injicerbar och inhalerade) sänker hjärtfrekvensen. Eftersom hjärtfrekvensen är en viktig faktor för kontraktilitet, kommer narkos avsevärt påverka kontraktiliteten. Av denna anledning är vi beskriver vårt förfarande. Dessutom är ett kännetecken för många kardiomyopatier en minskad kontraktil reserv (dvs en minskad Bowditch effekt). Därför bör hjärtfunktionen mätas över ett intervall av hjärttakter. Här beskriver vi hur du använder en stimulator (med en stängd kista) för att uppnå dessa effekter.
Förutom puls, (NO) är kväveoxid också en viktig modulator av kontraktilitet 7. NO produceras via enzymer benämns NO-syntas (NOS). Vi och andra har visat att möss med knockout av neuronal NOS (NOS1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta djur protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) på The Ohio State University. Detta förfarande kan användas på varje mus i vilken den inre diametern av halspulsådern är tillräckligt stor för att föra in katetern. Använd möss som ligger över 16 g (äldre än ~ 2 månader).
1. Förberedelse Mus för Katetrisering
- Täta alla kirurgiska instrument och tillbehör i en steriliseringspåse. Sterilisera påsen i en autoklav maskin. Upprätthålla ett sterilt område under hela förfarandet och bära sterila handskar.
- Söva möss med ketamin (55 mg / kg) plus xylazin (15 mg / kg) genom intraperitoneal injektion.
OBS: Hela proceduren mäta både tryck / volym vid olika hjärtfrekvenser och ESPRV tar mindre än 20 min. Om det krävs ytterligare tid (dvs mer än 30 min), ger en extra ¼ dos av anestesi var 30 min. - Ta bort håret i främre rEgion av halsen och bröstet med hjälp av hår borttagning lotion (t.ex. Nair) och tejpa benen på musen på skum plattformen. Bekräfta ett tillstånd av djup anestesi med en tå nypa.
- Sätt i en rektal sond för att övervaka kroppstemperaturen (37 ± 1 ° C) och upprätthåller under användning av en termo-reglerad värmedyna (belägen mellan operationslakanet och plattform).
- Förbered en längd av 4-0 sutur (~ 10 cm). Loop sutur runt de övre framtänderna och band till plattform. Detta kommer att hålla nacken rak.
- Sterilisera operationsområdet genom att badda området med Betadine och 75% alkohol tre gånger.
2. Katetrisering
- Förbered katetern genom förblötning spetsen i saltlösning eller destillerat vatten (37 ° C) under minst 30 min före användning (enligt tillverkarens instruktioner) för att acklimatisera membranet trycksensorn för den våta biologiska miljön och för att förhindra trycksignaldrift och negativ tryckregistreringarna.
- Gör en longitudinell 0,8 cm snitt mellan underkäken och bröstbenet i den främre regionen av halsen. Med de fina saxar, separera huden-muskulära bindväv att exponera luftstrupen finns under stemohyoideus muskeln.
- Separera den fett- och muskelvävnaden vid den högra sidan av luftstrupen med böjda pincett för att exponera den högra halspulsådern.
OBS: Den halspulsådern är den största artären i den främre regionen av halsen, innehåller röda blod, och är pulserande. Blanda inte ihop med halsvenen som löper parallellt med halspulsådern. Halsvenen är mörkröd och icke-pulserande. Dessutom, under isoleringen av karotidartären bör användaren vara medveten om inte skada pneumogastric nerv. - Ta bort fett från den högra halspulsådern med böjda pincett. Om det finns förgrening av det fartyg som kommer att hindra detta operativa teknik, skär dem med en Bovie diatermi att dissociera halspulsådern.Separera så mycket av vävnaden som möjligt under halspulsådern med hjälp av böjda pincett.
- Klipp två 5 cm 6-0 silkestrådar. Passera varje silkestråd under högra karotidartären.
- Placering en tråd nära den proximala delen och den andra nära den distala delen av artären. Gör en stram knut på tråden vid den bortre delen, och göra en lös knut på tråden på den proximala delen.
- Blockera blodflödet genom att spänna fast den proximala delen av artären med användning av en liten hemostat Kärlklämma (placera klämman under den proximala gängan). Den tätade området av artären kommer att fyllas med blod vilket gör det enkelt att utföra steg 2,8.
- Punktera ett litet hål i den högra halspulsådern mellan de två trådarna (men närmare den distala gängan) med en 26 G nål. Föra in katetern i halsartären. Något dra åt lös knut vid den proximala delen av halspulsådern på katetern för att hålla på plats.
OBS: Användning av nålstick är att föredra jämförttill sax snitt. Genom att göra en hård knut i den distala delen av artären först, och sedan klämma den proximala delen, kommer artären att vara helt fylld med blod. Detta gör det mycket enkelt att peta genom blodkärlet. Vidare är storleken på nålen (26 G) punkterar artären med ett hål som fint passar storleken av katetern. Vid användning av sax snitt metoden, var det svårare att kontrollera storleken på snittet. Dock bör den valda metoden vara beroende på vilken kirurgen känns mer bekväm med. - Starta inspelningen trycksignaler som i steg 3.
- Lossa hemostat klämman igen och fortsätt att föra in katetern framåt i den vänstra kammaren. Om ett visst motstånd upplevs vid frammatning av katetern, försiktigt dra tillbaka och försöka avancera igen. För en mus som väger ~ 18-25 g, är den beräknade längden av katetern som sitter 18 mm.
OBS: Den arteriella trycksignalen kommer att fluktuera 70-120 mm Hg. När than katetern är på den vänstra kammaren formen av signaltryckändringar och trycket varierar från 0 till 120 mm Hg (visad i fig 1). Hjärtfunktion kommer att stabiliseras inom 2-3 min efter införandet av katetern. - Kontinuerligt övervaka kroppstemperaturen, anestesi nivå, och andningsfrekvens.
3. Data Acquisition
- Använd LabChartPro 7 programvara (eller liknande programvara). Använd WorkFlow möjlighet PV Loop LabChart Module. Med den här modulen, välj standardinställningen tryck och volym loopar.
- Set-up tre kanaler: en kanal för tryck, en kanal för volym, och en kanal för hjärtfrekvensen. Ställ skalområden av ovanstående parametrar som 0-150 mm Hg, 0-100 pl och 0-800 slag / min, respektive.
- Tryck startknappen för att spela in.
4. Bowditch Effekt
- Gör en 1 cm snitt i prekordiet arean parallellt med manubrium. Skär muskellager och expose den interkostalrummet med sax.
- Med hjälp av en fyrkantig puls stimulator, ange följande parametrar: Spänning 2 V, varaktighet 2 ms och aktivera repeteringsläget.
- Håll den negativa elektroden med pincett och för in den genom den fjärde interkostalrummet till den apikala området av hjärtat. Håll den positiva elektroden med pincett och för in den genom den andra revbensmellanrummet till höger förmak regionen av hjärtat.
- Sätt på stimulatorn och ändra frekvensen för att stimulera hjärtat från 4 Hz (240 slag / min) upp till 10 Hz (600 slag / min). Vid varje ny puls, stimulera hjärtat i 1 minut före datainsamling.
5. Generera ESPVR och PRSW
- Skära in i huden och muskelvävnaden vinkelrät manubrium i buken med en sax. Öppna enterocoelia och exponera levern.
- Dra Arcus costarum mot huvudet med hjälp av metall dragkraft.
- Tryck försiktigt levern nedåt meden bomullspinne. Var noga med att inte trycka för mycket för att påverka brösthålan. Detta kommer att ändra hjärtfunktionen.
- Skär falciformligament av levern med en sax för att exponera suprahepatic nedre hålvenen (IVC).
- Använd böjd pincett att snabbt pressa IVC för 5 sek för att blockera återlämnande av blod till det högra förmaket. Den vänsterkammartryck och volym kommer att falla på grund av den minskade inflödet till hjärtat. Vid generering dessa värden, använd inte slingor under 60 mm Hg. Den 60 mm Hg är i förhållande till det systoliska trycket.
OBS: Detta värde sätts till 60 mm Hg, eftersom detta kommer att orsaka en betydande nedgång i perfusionstryck att avsevärt minska koronar perfusion och påverka kontraktilitet.
6. Volume Kalibrering
- Heparinisera musen med 0,1 ml av 1: 5000 heparinlösning (utspädd med normal saltlösning) genom intraperitoneal injektion.
- Ta bort katetern från karotidartären. När katetem dras ut frabout karotidartären kommer hepariniserat blod sippra från hålet där kateter infördes.
- Samla detta blod för volymkalibrering med en 1 ml spruta. Fyll varje brunn i kalibrerings kyvett.
- Ta hjärta att avliva musen via blodtappning.
- Placera katetern i varje brunn och få en stadig relativ volymenhet (RVU) värde. Generera en standardkurva med användning av de olika standardvolymer och RVU värden från varje brunn.
- Omvandla inspelad RVU att il.
7. Data Processing
- För att undersöka Bowditch effekten väljer steady-state tryck / volym spår från varje puls. Klicka baslinjen analys för att erhålla data.
- För ESPVR och PRSW uppgifter, välj den första ~ 15 tryck / volym spår, klicka ocklusion analys i programvaran för att generera ESPVR (lutningen av trycket som utvecklats av LV i slutet diastoliska volymen) och PRSW (den linjära regressionen av stroke arbete med slutdiastoliskavolym) backar.
- Ge uppmärksamhet till formen på slingorna. Se till att slingan är stängd utan vinkel punkter eller vändningar. Detta är ett tecken på felaktig kateterplacering eller onödigt buller. Kontrollera regelbundet slingor under försöket för att säkerställa korrekt tryck- och volymdata som genereras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det korrekta införandet av katetern in i den vänstra ventrikeln är ett viktigt steg för att uppnå lämpliga tryck- och volymvärden. Visas i figur 1, med användning av LabChart Pro 7, är byte av tryckvågformen (form och värden) när katetern går från artären in i ventrikeln.
Efter korrekt införing av katetern in i den vänstra ventrikeln, trycket (P) och volym (V) värden erhållna kommer sedan att användas för att generera de PV slingor (visade i figur 2).
Med hjälp av dessa tryckvärden, kan mekanismer som påverkar kontraktilitet undersökas. Visas i figur 3 är ett exempel på hur trycket och volymen ändras när hjärtfrekvensen ökar. I detta exempel, ökar hjärtfrekvensen från 300 till 600 slag / min, ökade LV tryck 80-100 mm Hg, medan de diastoliska och systoliska LV volymerna minskade. Visas i figur 4 är hjärtfrekvensen beroende av de högsta och lägsta procentandelar tryck utveckling (dP / dt). Som hjärtfrekvensen ökar, så ökar de högsta och lägsta andelen tryckutveckling. Denna typ av dataanalys kan också användas för att undersöka regulatorer av kontraktilitet. Våra data visar att NOS1 - / - möss har minskat högsta och lägsta andelen tryck utveckling jämfört med vildtyp (WT) möss (Figur 4). Följaktligen knockout av NOS1 resulterar i en minskad Bowditch effekt.
Använda tryck- och volymvärden som uppmätts under IVC ocklusion, kan vi också få ett mått på lastoberoende kontraktilitet. Visas i figur 5, är beräknade Ees och PRSW värden (mätt vid 420 slag / min) för WT och NOS1 - / - möss. Dessa data tyder på att NOS1 - / - möss har minskat kontraktilitet jämfört med WT möss.
8 / 52618fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1:. Tryck- och volymsignalerna som detekteras med användning av PV Loop LabChart Modul Signaltryckförändringar när katetern är placerad på LS. Den arteriella trycksignalen (överst) fluktuerade från 80 till 120 mm Hg. När katetern var placerad i vänster kammare, formen av signaltryckändringar och trycket varierade från 0 till 120 mm Hg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Utveckling av PV loopar som använder PV Loop LabChart Module. VÄNSTER) Representativa uppgifter om tryck (överst), volym (mitten) och hjärtfrekvens (botten). Är dessa LV tryck / volymvärden som används för att Generate PV slingan genom att plotta trycket (P) mot volym (V). (Höger) Illustration av slingor som genereras av data på vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:.. Effekt av hjärtfrekvens på LV tryck och volym Representativa data som visar LV tryck- och volymförändringar med ökande hjärtfrekvens med hjälp av PV Loop LabChart Module Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: NOS1 knockout (NOS1 - / -.) Möss har minskat in vivo hjärtfunktion och sammandragande reserv Jämfört med vildtyp (WT) möss, NOS1 - / - möss har signifikant lägre maximal (dP / dt max) och lägsta (dP / dt min) graden av tryck utvecklingen med ökande hjärtfrekvens. Data presenteras som medelvärde ± SD. * P <0,05 vs WT via ANOVA, n = 5 möss / grupp.
Figur 5: NOS1 knockout (NOS1 - / -) möss har minskad kontraktilitet. VÄNSTER) representativ tryck / volymslingor som erhållits under nedre hålvenen ocklusion. Notera den rätta formen för varje slinga. De tjocka linjerna är slutet systoliskt tryck volymförhållande (ESPVR). HÖGER) Jämfört med vildtyp (WT) möss, NOS1 - / - möss har en minskad slutsystoliska elastans (EES) och förspänning rekryterslagarbete (PRSW). Data presenteras som medelvärde ± SD. * P <0,05 vs WT via oparat t-test, n = 5 möss / grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg för denna teknik för att få ett tillförlitligt mått på kontraktilitet är korrekt kateter placering i LV. Om katetern inte är korrekt placerad, när LV kontrakt väggarna kan kontakta katetern vilket resulterar i mycket hög, och inte fysiologiska, tryckvärden orsakar oregelbundet formade PV slingor. Om det behövs, kan katetern roteras för att uppnå rätt placering. En annan viktig steg för denna teknik är att se till att mus erhöll korrekt anestesi. Om musen är över sövd, kommer detta i hög grad minskar hjärtfunktionen. En mus med en hjärtfrekvens mindre än ~ 250 slag / min kan övervägas under sövd. Dessutom är volymen av blod som musen hjärtat pumpar liten vilket gör det svårt att få korrekta volymer. Det är viktigt att kalibrera volymen för varje mus. För volymkalibrering, beskrev vi kyvetten kalibreringsteknik. Det finns ytterligare metoder som också används för att kalibrera volymer (dvs.slagvolym beräkning med en flödessond i fallande bröstaortan) 10.
Det finns många begränsningar för att använda denna metod i mus; allt på grund av sin ringa kroppsstorlek. Till exempel, erfordrar denna teknik noggrann mikrokirurgisk skicklighet. Dessutom resulterar denna teknik i vissa blodförlust, vilket potentiellt skulle kunna ändra hjärtfunktionen. Massiv blodförlust kan undvikas genom att föra fram katetern genom vaskulaturen i jämförelse med andra metoder (t.ex., punkterings den vänstra ventrikeln). Här beskriver vi hela förfarandet i detalj med kritiska detaljer för att undvika dessa problem.
Tryck- / volymanalys är en viktig metod för att undersöka in vivo kontraktilitet. Utförande av denna teknik i möss är betydelsefullt eftersom det finns många fördelar jämfört med andra arter (kostnad, genetisk manipulation, etc.). Eftersom hjärtfrekvensen är en viktig faktor för hjärtfunktion 1 och påverkas av Anesthesia presenterade vi ytterligare steg för att säkerställa att jämförbara hjärtfrekvens uppnås för att möjliggöra en jämförelse mellan grupper. Dessutom använder denna modifierade PV loop teknik, är en utredare möjlighet att direkt testa Bowditch effekt. Av dessa skäl, beskriver vi hur du utför den här tekniken i musen för att få exakta mätningar av in vivo kontraktilitet vid olika hjärtfrekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 silk thread | Surgical specialties | SP102 | |
| 6-0 silk thread | Surgical specialties | MBKF270 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Curve forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vascular clamp | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscope | World precision instruments | PZM-3 | |
| Pressure catheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Pressure and volume system | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperature controller | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Sterile glove | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Betadine surgical scrub | Veterinary | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cautery | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Syringe (26 G needle) | BD | 8017299 |
References
- Janssen, P. M. Myocardial contraction-relaxation coupling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1741-H1749 (2010).
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C. dP/dt(max)--a measure of 'baroinometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 66, 63-65 (2012).
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
