Abstract
Dyremodeller, der efterligner menneskelige hjertesygdomme er blevet skabt for at teste potentielle terapeutiske strategier. Et centralt element til at evaluere disse strategier er at undersøge deres virkninger på hjertefunktionen. Der er flere teknikker til at måle in vivo kardiale mekanik (f.eks ekkokardiografi, relationer tryk / volumen, etc.). Sammenlignet med ekkokardiografi, real-time venstre ventrikel (LV) tryk / volumen-analyse via kateterisation er mere præcis og indsigtsfulde ved vurderingen LV funktion. Derudover LV tryk / volumen analyse giver mulighed for at registrere ændringer går under manipulationer af kontraktilitet (fx β-adrenerg stimulation) og patologiske fornærmelser (f.eks iskæmi / reperfusion skade). I tillæg til den maksimale (+ dP / dt) og minimum (-dP / dt) på trykændring i LV, en præcis vurdering af LV-funktion via flere load-uafhængige indeks (f.eks ende systoliske trykvolumen forhold og preload recruitable slagtilfælde arbejde) kan opnås. Puls har en signifikant effekt på LV kontraktilitet, således at en forøgelse af hjertefrekvensen er den primære mekanisme til at øge minutvolumen (dvs. Bowditch effekt). Således når man sammenligner hæmodynamik mellem forsøgsgrupper, er det nødvendigt at have lignende puls. Endvidere et kendetegn for mange kardiomyopati modeller er en nedgang i kontraktil reserve (dvs. nedsat Bowditch effekt). Derfor kan vigtige oplysninger fås ved bestemmelse af virkningerne af stigende puls på kontraktilitet. Vores og andres data har vist, at den neuronale nitrogenoxidsynthase (NOS1) knockout mus er faldet kontraktilitet. Her beskriver vi proceduren måle LV tryk / volumen med stigende puls ved hjælp af NOS1 knockout musemodel.
Introduction
Formålet med hjertet er at pumpe blod i hele kroppen for at imødekomme de metaboliske krav organismen. Da disse krav hele tiden svingende (fx under træning), skal hjertet tilpasse (dvs. øge minutvolumen). Hjertet har udtænkt mange veje til at opnå dette kunststykke. Den primære måde hjertet opnår dette er via en stigning i hjertefrekvens (dvs. Bowditch effekt) 1. Dvs. som ens puls stiger, resulterer dette i en forøgelse af kontraktilitet og en stigning i minutvolumen. Således hjertefunktion er overordentlig afhængig af hjertefrekvens. Desværre, hjertesygdomme (f.eks, myokardieinfarkt, hypertrofi, etc.) resulterer i dårlig hjertefunktion, hvor hjertet følgelig ikke vil være i stand til at opfylde de metaboliske krav fra kroppen. Hjertesygdom er den væsentligste årsag til sygelighed og dødelighed i vestlige samfund. Dyremodeller, der rekapitule- mange humane cardiomyopathies anvendes til at undersøge molekylære mekanismer og til at teste potentielle terapier. At skelne disse mekanismer og afgøre, om en behandling kan være levedygtig, må efterforskerne vurderer hjertefunktion in vivo.
Der er flere måder at vurdere hjerte funktion in vivo (f.eks ekkokardiografi, MRI, osv), der rutinemæssigt måler ejektionsfraktion, fraktioneret afkortning, minutvolumen, etc. Men disse parametre er stærkt afhængige af afterload, forbelastning, og hjertefrekvens foruden kontraktilitet 2. Måling kontraktilitet er nødvendig for at forstå de iboende egenskaber i hjertet i sin oprindelige miljø. Den maksimale (dP / dt max) sats for pres udvikling bringer os et skridt tættere på at forstå kontraktilitet. Desværre, dP / dt er også afhængig af puls og belastningsforhold 3. Derfor er der blevet udviklet teknikker til at måle belastningen (og puls, se below) uafhængige indekser for myokardie kontraktilitet (dvs. ultimo systoliske tryk volumen forhold (ESPVR) og forbelastning recruitable slagtilfælde arbejde (PRSW)) 4-6. ESPVR beskriver den maksimale tryk, der kan udvikles af ventriklen ved enhver given LV volumen. Hældningen af ESPVR repræsenterer den endelige systoliske elastans (EBS). PRSW er den lineære regression af slagtilfælde arbejde (afgrænses af PV sløjfe) med slutdiastoliske volumen. Disse procedurer er en mere nøjagtig og præcis måling af kontraktilitet i forhold til hæmodynamiske parametre som ejektionsfraktion, minutvolumen og slagvolumen. ESPVR og PRSW kan fås via den midlertidige blokering af ringere vena cava (IVC). Blokering af IVC kan udføres med et lukket bryst at undgå effekten af at ændre intrapleural pres på hjertefunktionen.
Stigende puls øger også sammentrækning og afslapning 1. Således når hjertefunktion sammenligner mellem Experimental grupper (fx ± dP / dt), behøver hjerte satser at være ens. Men lignende puls normalt ikke forekommer i hvert dyr på grund af forskellige forhold (sygdom, forskning interventionspriser, etc.). Det skal bemærkes, at anæstesi (injicerbar og inhalerede) sænker hjertefrekvensen. Da puls er en vigtig faktor for kontraktilitet, vil anæstesi betydeligt påvirke kontraktilitet. Derfor er vi beskriver vores procedure. Derudover en kendetegnende for mange cardiomyopatier er en nedsat kontraktil reserve (dvs. en nedsat Bowditch effekt). Derfor hjertefunktion skal måles, over en række af hjerte satser. Her beskriver vi, hvordan man bruger en stimulator (med lukket bryst) for at opnå disse virkninger.
I tillæg til puls, nitrogenoxid (NO) er også en vigtig modulator af kontraktilitet 7. NO produceret via enzymer betegnes NO syntase (NOS). Vi og andre har vist, at mus med knockout af neuronal NOS (NOS1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Dette dyr protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på The Ohio State University. Denne procedure kan anvendes på enhver mus, hvor den indre diameter af halspulsåren er stort nok til at indsætte kateteret. Brug mus, der er over 16 g (ældre end ca. 2 måneder).
1. Forberedelse Mouse for kateterisation
- Forsegl alle kirurgiske instrumenter og forsyninger i en sterilisering pose. Sterilisere posen i en autoklave maskine. Oprethold et sterilt felt under hele proceduren og slid sterile handsker.
- Bedøver mus med ketamin (55 mg / kg) plus xylazin (15 mg / kg) ved intraperitoneal injektion.
BEMÆRK: Hele proceduren måler både tryk / volumen ved forskellige puls og ESPRV tager mindre end 20 minutter. Hvis der kræves ekstra tid (dvs. mere end 30 min), giver en ekstra ¼ dosis af anæstesi hver 30 min. - Fjerne hår i den forreste rEgion af hals og bryst område ved hjælp hår fjerner lotion (f.eks Nair) og tape lemmer musen på skum platform. Bekræft en tilstand af dyb anæstesi ved en tå knivspids.
- Indsæt en rektal probe til overvågning af kropstemperatur (37 ± 1 ° C), og opretholder under anvendelse af en termo-reguleret varmepude (placeret mellem det kirurgiske afdækningsstykke og platform).
- Forbered en længde på 4-0 sutur (~ 10 cm). Loop sutur omkring de øverste fortænder og tape til platform. Dette vil holde halsen lige.
- Sterilisere det kirurgiske område ved pensling området med Betadine og 75% alkohol tre gange.
2. kateterisation
- Forberede kateteret ved forgennemvædning spidsen i saltvand eller destilleret vand (37 ° C) i mindst 30 min før anvendelse (ifølge producentens anvisninger) at akklimatisere tryksensoren membran til den våde biologiske miljø og for at forhindre tryksignal afdrift og negative tryk optagelser.
- Foretag en langsgående 0,8 cm incision mellem den nedre kæbe og brystbenet i den forreste region af halsen. Med de fine sakse, adskille huden-muskulære bindevæv at blotlægge trachea placeret under stemohyoideus muskel.
- Adskil fedt og muskelvæv i højre side af luftrøret med buede pincet for at eksponere den højre carotidarterie.
BEMÆRK: halspulsåren er den største arterie i den forreste region af halsen, indeholder lyse rødt blod, og er pulserende. Ikke at forveksle med halsvenen der løber parallelt med halspulsåren. Halsvenen er mørkerød og ikke-pulserende. Desuden i isoleringen af halspulsåren, skal brugeren være opmærksom på ikke at beskadige pneumogastric nerve. - Fjerne fedt fra højre halspulsåre med de buede pincet. Hvis der findes forgrening af fartøjet som vil hindre denne operationelle teknik, skære dem med en Bovie kautering at dissociere halspulsåren.Adskille så meget af det væv som muligt under halspulsåren hjælp buet pincet.
- Skær to 5 cm 6-0 silketråde. Gå hvert silketråd under højre halspulsåre.
- Position en tråd nær den proximale del og den anden nær den distale del af arterien. Lav en stram knude på tråden i den distale del, og gøre en løs knude på tråden ved den proximale del.
- Blokere blodstrømmen ved at fastspænde den proximale del af arterien ved hjælp af en lille hæmostat vaskulær klemme (placere klemmen under den proksimale gevind). Den forseglede region af arterien vil blive fyldt med blod, hvilket gør det let at udføre trin 2.8.
- Punktere et lille hul i den højre carotidarterie mellem de to tråde (men tættere på den distale gevind) med en 26 G nål. Indsætning af kateteret ind i halspulsåren. Lidt stram løs knude ved den proximale del af halspulsåren på kateteret til at holde på plads.
BEMÆRK: Brug nålen punktering foretrækkes sammenlignettil saks indsnit. Ved at lave en stram knude i den distale del af arterien først, og derefter fastspænde den proximale del, vil arterien udfyldes helt med blod. Dette gør det meget nemt at stikke gennem blodkarret. Endvidere størrelsen af nålen (26 G) punkterer arterien med et hul, der passer pænt størrelsen af katetret. Ved brug af saks indsnit metode, var det mere vanskeligt at styre størrelsen af snittet. Den valgte metode, bør dog være afhængig af, hvilken en kirurgen føles mere komfortabel med. - Start optagelsen tryksignaler som i trin 3.
- Løsn hæmostat klemme og fortsætte indsætte kateteret frem ind i venstre hjertekammer. Hvis nogle modstand opleves, når fremføre kateteret, forsigtigt trække det tilbage og prøv fremrykkende igen. For en mus der vejer ~ 18-25 g, den anslåede længde af kateteret, der er indsat er 18 mm.
BEMÆRK: arterietryk signal vil svinge fra 70 til 120 mm Hg. Når than kateter i den venstre ventrikel formen af tryk- signalændringer og trykket vil svinge 0 til 120 mm Hg (vist i figur 1). Hjertefunktionen vil stabilisere inden 2-3 min efter indsættelse af kateteret. - Løbende overvåge kropstemperatur, anæstesi niveau, og vejrtrækning.
3. Data Acquisition
- Brug LabChartPro 7 software (eller lignende software). Brug WorkFlow mulighed for PV Loop LabChart Module. Ved hjælp af dette modul, skal du vælge tryk og vandmængde Loops standardindstillingen.
- Set-up tre kanaler: en kanal til tryk, en kanal for volumen, og en kanal for hjertefrekvens. Fastsat skala intervaller af ovennævnte parametre som 0-150 mm Hg, 0-100 pi og 0-800 slag / min.
- Tryk på start-tasten for at optage.
4. Bowditch Effect
- Lav en 1 cm incision i prækordiet område parallelt med manubrium. Skær lag af muskel og expose den interkostalrum med en saks.
- Ved hjælp af en firkantet puls stimulator, indstille følgende parametre: Spænding på 2 V, varighed af 2 ms, og aktivere gentagelsestilstand.
- Hold den negative elektrode med en pincet og indsætte det gennem den fjerde interkostale mellemrum til den apikale region af hjertet. Hold den positive elektrode med pincet og indsætte det gennem den anden interkostale mellemrum til højre atrium område af hjertet.
- Tænd stimulatoren og ændre frekvensen til at pace hjertet fra 4 Hz (240 slag / min) på op til 10 Hz (600 slag / min). Ved hver ny puls, stimulere hjertet i 1 min før dataindsamling.
5. Generering af ESPVR og PRSW
- Skære huden og muskelvæv vinkelret manubrium i abdominale område med en saks. Åbn enterocoelia og eksponere leveren.
- Træk arcus costarum mod hovedet hjælp metalliske trækkraft.
- Skub forsigtigt leveren nedad meden vatpind. Vær forsigtig med ikke at presse for meget til at påvirke brysthulen. Dette vil ændre hjertefunktionen.
- Skær falciforme ligament af leveren med en saks for at eksponere suprahepatic inferior vena cava (IVC).
- Brug buet pincet til hurtigt at klemme IVC i 5 sek at blokere tilbagevenden af blod til højre atrium. Den venstre ventrikel tryk og volumen vil falde på grund af den reducerede tilstrømning til hjertet. I at generere disse værdier, skal du ikke bruge løkker under 60 mm Hg. 60 mm Hg er i reference til systoliske tryk.
BEMÆRK: Denne værdi er fastsat til 60 mm Hg, fordi dette vil medføre et betydeligt fald i perfusionstryk til betydeligt mindske koronar perfusion og påvirke kontraktilitet.
6. Volume Kalibrering
- Heparinize musen med 0,1 ml 1: 5000 heparin-opløsning (fortyndet med normalt saltvand) ved intraperitoneal injektion.
- Fjerne kateteret fra halspulsåren. Når kateteret trækkes ud frabout halspulsåren, vil hepariniseret blod siver fra hullet, hvor kateteret blev indsat.
- Indsamle disse blod for volumen kalibrering ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Fyld hver brønd i kalibrering kuvette.
- Fjern hjerte til aflive musen via afblødning.
- Positionere kateteret i hver brønd og få en stabil relativ volumenenhed (RVU) værdi. Danne en standardkurve ved anvendelse af de forskellige faste mængder og RVU værdier fra hver brønd.
- Konverter indspillet RVU til pi.
7. Databehandling
- For at undersøge Bowditch effekten, skal du vælge steady state tryk / volumen spor fra hver puls. Klik baseline analyse for at indhente data.
- For ESPVR og PRSW data, skal du vælge de første ~ 15 tryk / volumen spor, skal du klikke på okklusion analyse i softwaren til at generere ESPVR (hældningen af det tryk udviklet af LV ultimo diastoliske volumen) og PRSW (den lineære regression af slagtilfælde arbejde med slutdiastoliskvolumen) skråninger.
- Give opmærksomhed til formen af løkkerne. Sørg for, at løkken er lukket uden kantede punkter eller snoninger. Dette er et tegn på forkert kateter placering eller overskydende støj. Kontrollér med jævne sløjfer under eksperimentet for at sikre ordentlige tryk og volumen data bliver genereret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den korrekte indføring af kateteret ind i venstre hjertekammer er et vigtigt skridt for at opnå passende tryk og volumen værdier. Vist i figur 1 ved anvendelse LabChart Pro 7, er ændringen af trykket bølgeform (form og værdier), når kateteret går fra arterien ind i ventriklen.
Efter korrekt indsætning af kateteret ind i den venstre ventrikel, tryk (P) og volumen (V) opnåede værdier vil derefter blive anvendt til at generere PV sløjfer (vist i figur 2).
Ved anvendelse af disse trykværdier, kan mekanismer, der ændrer kontraktilitet undersøges. Vist i figur 3 er et eksempel på, hvordan tryk og volumen ændringer som puls stiger. I dette eksempel, at øge hjertefrekvensen 300-600 slag / min, LV trykket steg fra 80 til 100 mm Hg, medens diastoliske og systoliske LV volumener faldt. Vist i figur 4 er den puls afhængighed af de maksimale og minimumssatser for pres udvikling (dP / dt). Som puls stiger, så gør de maksimale og minimumssatserne for pres udvikling. Denne type data analyse kan også anvendes til at undersøge regulatorer af kontraktilitet. Vores data viser, at NOS1 - / - mus er faldet maksimale og minimumssatser for pres udvikling sammenlignet med vildtype (WT) mus (figur 4). Derfor knockout af NOS1 resulterer i en nedsat Bowditch virkning.
Brug af tryk og volumen værdier opnået under IVC okklusion, kan vi også få et mål for belastning-uafhængig kontraktilitet. Vist i figur 5, beregnes EBS og PRSW værdier (målt ved 420 slag / min) i WT og NOS1 - / - mus. Disse data antyder, at NOS1 - / - mus er faldet kontraktilitet sammenlignet med WT-mus.
8 / 52618fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1:. Trykket og volumen signaler detekteres ved brug af PV Loop LabChart Module tryksignalet ændres, når kateteret er placeret i LV. Arterietrykket signal (øverst) svingede 80-120 mm Hg. Når kateteret blev placeret i den venstre ventrikel, formen af tryksignalet ændringer og presset svingede 0-120 mm Hg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af PV sløjfer, der bruger PV Loop LabChart Module. VENSTRE) Repræsentative data for tryk (øverst), volumen (i midten) og hjertefrekvens (nederst). Er disse LV tryk / volumen-værdier bruges til at generate PV loop ved at plotte tryk (P) mod volumen (V). (Højre) Illustration af loops genereret af dataene til venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:.. Effekt af hjertefrekvens på LV tryk og volumen Repræsentative data, der viser LV tryk og volumen ændringer med stigende puls ved hjælp af PV Loop LabChart Module Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: NOS1 knockout (NOS1 - / -.) Mus er faldet in vivo hjertefunktion og kontraktile reserve Sammenlignet med vildtype (WT) mus, NOS1 - / - mus har betydeligt lavere maksimum (dP / dt max) og minimum (dP / dt min) på tryk udvikling med stigende puls. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD. * P <0,05 vs WT via ANOVA, n = 5 mus / gruppe.
Figur 5: NOS1 knockout (NOS1 - / -) mus har nedsat kontraktilitet. Bemærk LEFT) repræsentative tryk / volumen sløjfer opnået under inferior vena cava okklusion. Den rette form af hver sløjfe. De tykke linjer er enden systoliske tryk volumen-forhold (ESPVR). HØJRE) I forhold til vildtype (WT) mus, NOS1 - / - mus har en nedsat ende systolisk elastans (EBS) og forbelastning recruitable slagtilfælde arbejde (PRSW). Data er præsenteret som gennemsnit ± SD. * P <0,05 vs WT via uparret t-test, n = 5 mus / gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trin for denne teknik at opnå en pålidelig måling af kontraktilitet er korrekt kateter placering i LV. Hvis kateteret ikke er placeret korrekt, når LV kontrakter væggene kan kontakte kateteret resulterer i meget høje, og ikke fysiologiske, trykværdier forårsager uregelmæssige formede PV loops. Hvis det er nødvendigt, kan kateteret drejes for at opnå den korrekte placering. Et andet centralt skridt for denne teknik er at sikre musen fået ordentlig anæstesi. Hvis musen er over bedøvet, vil dette i høj grad formindske hjertefunktionen. En mus med en puls mindre end ~ 250 slag / min, kan betragtes i bedøvede. Derudover er mængden af blod, at musen hjertet pumper er lille, hvilket gør det vanskeligt at få præcise mængder. Det er vigtigt at kalibrere lydstyrken for hver mus. For volumen kalibrering beskrev vi kuvetten kalibreringsteknik. Der er yderligere metoder, der også bruges til at kalibrere mængder (dvs.,slagvolumen beregning ved anvendelse af en flow-sonde i nedadgående thorakalaorta) 10.
Der er mange begrænsninger ved brug af denne metode i musen; alle på grund af sin lille kropsstørrelse. For eksempel kræver denne teknik nøjagtig mikrokirurgisk dygtighed. Desuden er denne teknik resulterer i nogle blodtab, der potentielt kan ændre hjertefunktionen. Massivt blodtab kan undgås ved at fremføre kateteret gennem vaskulaturen i forhold til andre metoder (f.eks, punktering af venstre ventrikel). Her beskriver vi hele proceduren i detaljer med kritiske detaljer for at undgå disse problemer.
Tryk / volumen-analyse er en vigtig tilgang til at undersøge in vivo kontraktilitet. Udfører denne teknik i mus er signifikant eftersom der er mange fordele i forhold til andre arter (omkostninger, genetisk manipulation, etc.). Da puls er en vigtig faktor for hjertefunktionen 1 og påvirket af Anesthesia præsenterede vi yderligere skridt for at sikre, at sammenlignelige hjertefrekvens opnås for at tillade en gyldig sammenligning mellem grupperne. Desuden bruger denne ændrede PV loop teknik, en undersøger er i stand til direkte at teste Bowditch effekt. Derfor beskriver vi, hvordan man udfører denne teknik i musen for at opnå nøjagtige målinger af in vivo kontraktilitet ved forskellige puls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 silk thread | Surgical specialties | SP102 | |
| 6-0 silk thread | Surgical specialties | MBKF270 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Curve forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vascular clamp | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscope | World precision instruments | PZM-3 | |
| Pressure catheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Pressure and volume system | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperature controller | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Sterile glove | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Betadine surgical scrub | Veterinary | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cautery | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Syringe (26 G needle) | BD | 8017299 |
References
- Janssen, P. M. Myocardial contraction-relaxation coupling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1741-H1749 (2010).
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C. dP/dt(max)--a measure of 'baroinometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 66, 63-65 (2012).
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
